Orientador: Maurício Boscolo / Coorientador: Roberto da Silva / Banca: Marcelo de Freitas Lima / Banca: George Jackson de Moraes Rocha / Resumo: O presente trabalho foca o pré‐tratamento oxidativo do bagaço de cana de açúcar tendo em vista o uso da hidrólise enzimática para a produção de etanol celulósico. Destina‐se a fazer o estudo do pré‐tratamento com persulfato de sódio no intuito de se obter um pré‐hidrolisado eficiente para a sacarificação enzimática do bagaço. A despolimerização do bagaço pode gerar quantidade de açúcares fermentescíveis como a glicose e xilose, e assim aumentar substancialmente o volume de etanol produzido pela mesma área cultivada de cana de açúcar. Os resultados indicaram que o pré‐tratamento contendo somente oxidante persulfato de sódio poderia desestruturar o bagaço em temperatura branda atingida durante 0,5 min de irradiação com microondas, resultando no aumento na liberação de glicose (124%) e xilose (168%) após hidrólise enzimática em relação ao bagaço in natura. O resultado mais significativo de glicose (162%) e xilose (265%) em relação ao bagaço in natura foi obtido com 3,0 min de irradiação de microondas, em meio alcalino e na presença de persulfato de sódio. Ainda neste pré‐tratamento, foi observada no espectro de IR significativa modificação estrutural na região da carbonila, além de modificação com menor intensidade na região da vibração das ligações aromáticas da lignina. Os pré‐tratamentos resultaram em baixa solubilização de inibidores fenólicos na maioria dos pré‐tratamentos com persulfato. Também não foram detectadas concentrações de derivados furânicos provenientes da degradação térmica da hemicelulose (furfural) e celulose (HMF). De maneira geral, os pré‐tratamentos do bagaço de cana com persulfato de sódio em condições químicas distintas age sinergicamente na desestruturação da fibra do bagaço facilitando a hidrólise enzimática e na oxidação de fenólicos solubilizados a partir da oxidação da lignina / Abstract: This thesis focuses on the oxidative pretreatment of sugarcane pulp in view of the enzymatic hydrolysis use for cellulosic ethanol production. It intends to study the sodium persulfate pretreatment in order to obtain an efficient pre‐hydrolyzate for enzymatic saccharification of the pulp. The pulp depolymerization can generate fermentable sugar quantities such as glucose and xylose, and thus substantially increase the amount of ethanol produced by the same sugar cane growing area. Preliminary results indicated that the pretreatment containing sodium persulfate alone can disrupt the pulp at mild temperatures reached during 0.5 min of microwave irradiation, resulting in an increased glucose (124%) and xylose (168%) after enzymatic hydrolysis. The most significant result of glucose (162%) and xylose (265%) was obtained with 3.0 min of microwave irradiation, in an alkaline medium with persulfate. In this pretreatment, an expressive structural modification in the carbonyl region was observed through IR spectrum, besides the less intensive modification in the lignin's aromatic rings vibration region. The oxidative pretreatment minimized the phenolic inhibitors production, making it undetectable on most experiments. Also, concentrations of furanic derivate from thermal degradation of hemicellulose (furfural) and cellulose (HMF) carbohydrates weren't detected. Generally, the sodium persulfate pretreatment acts synergistically on the pulp fiber disruption and on the solubilized phenolic oxidation / Mestre

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-12. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:45:48Z : No. of bitstreams: 1 000846745.pdf: 896263 bytes, checksum: a90d4bcdf47eb725829cf478093a77a0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No Brasil o etanol é obtido principalmente a partir da cana de açúcar, a fibra do bagaço de cana é composta principalmente por lignina, celulose e hemicelulose, sendo possível produzir etanol celulósico a partir da sacarificação da celulose presente nessa fibra. Para se chegar ao etanol celulósico por hidrólise enzimática são necessárias pelo menos quatro etapas, sendo elas: o pré-tratamento; a hidrólise enzimática; a fermentação alcoólica dos açúcares e a destilação para a obtenção do etanol celulósico. Neste contexto o foco deste trabalho foi promover o pré-tratamento do bagaço utilizando ultrassom, micro-ondas e ozônio, a fim de, encontrar o melhor tratamento para modificação desta fibra, visando o aumento do rendimento enzimático. Após o tratamento a fibra resultante foi utilizada na hidrólise enzimática, caracterização química e avaliada térmica e estruturalmente pelas técnicas de TGA (termogravimetria), FTIR-ATR (espectroscopia no infravermelho), HPLC (cromatografia liquida), MEV, MET (microscopia eletrônica de varredura e transmissão) e DRX (difratometria de raios X). Os resultados obtidos por estas análises foram comparados ao rendimento da hidrólise enzimática e ao teor de compostos inibidores da fermentação alcoólica. Com a utilização do FTIR-ATR foi possível visualizar o efeito dos tratamentos nas diversas regiões da fibra e comprovar a redução da lignina. A partir da análise térmica por TGA foi possível observar que a maior estabilidade térmica das amostras está amplamente relacionada ao grau de celulose presente na fibra após o tratamento, com a análise por DRX foi possível determinar que a celulose cristalina não é afetada durante o pré-tratamento. A microscopia eletrônica de varredura permitiu observar as modificações causadas na superfície da fibra após os tratamentos, enquanto a microscopia eletrônica de transmissão... / In Brazil ethanol is produced mainly from sugar cane, fiber sugarcane bagasse is mainly composed of lignin, cellulose and hemicellulose, which can produce cellulosic ethanol from saccharification of cellulose present in this fiber. To get to cellulosic ethanol by enzymatic hydrolysis requires at least four stages: pre-treatment; enzymatic hydrolysis; alcoholic fermentation of the sugars and distillation for obtaining cellulosic ethanol. In this context the focus of this work was to pretreatment of bagasse using ultrasound, microwave and ozone in order to find the best treatment for modification of this fiber, to increase the enzyme yield. After treatment, the resulting fiber was used in enzymatic hydrolysis and chemical, thermal and structurally analysis by the techniques: TGA (thermogravimetry), FTIR-ATR (infrared spectroscopy), HPLC (liquid chromatography), SEM, TEM (scanning electron microscopy and transmission) and XRD (X-ray diffraction). The results obtained by these analyzes were compared to the yield of the enzymatic hydrolysis and the content of alcoholic fermentation inhibiting compounds. With the use of FTIR-ATR was able to see the effect of the treatments in the various regions of the fiber and demonstrate the reduction of lignin. From the thermal analysis by TGA was observed that the higher thermal stability of the samples is largely related to the degree of the cellulose present in the fiber after treatment, with the XRD analysis it was determined that the crystalline cellulose is not affected during the pre- treatment. The scanning electron microscopy allowed observing the changes caused on the fiber surface after treatment, while the transmission electron microscopy allowed observing the secondary cell wall is the most affected by ozone treatment. Treatments with ozone in alkaline medium showed low amount of inhibiting compounds and better yields during hydrolysis, especially when... / FAPESP: 2013/06234-3

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-20Bitstream added on 2014-12-02T11:21:21Z : No. of bitstreams: 1 000794446.pdf: 1870629 bytes, checksum: 1a25b680e2570ab1039e9a3045b8c3de (MD5) / O presente trabalho foca o pré‐tratamento oxidativo do bagaço de cana de açúcar tendo em vista o uso da hidrólise enzimática para a produção de etanol celulósico. Destina‐se a fazer o estudo do pré‐tratamento com persulfato de sódio no intuito de se obter um pré‐hidrolisado eficiente para a sacarificação enzimática do bagaço. A despolimerização do bagaço pode gerar quantidade de açúcares fermentescíveis como a glicose e xilose, e assim aumentar substancialmente o volume de etanol produzido pela mesma área cultivada de cana de açúcar. Os resultados indicaram que o pré‐tratamento contendo somente oxidante persulfato de sódio poderia desestruturar o bagaço em temperatura branda atingida durante 0,5 min de irradiação com microondas, resultando no aumento na liberação de glicose (124%) e xilose (168%) após hidrólise enzimática em relação ao bagaço in natura. O resultado mais significativo de glicose (162%) e xilose (265%) em relação ao bagaço in natura foi obtido com 3,0 min de irradiação de microondas, em meio alcalino e na presença de persulfato de sódio. Ainda neste pré‐tratamento, foi observada no espectro de IR significativa modificação estrutural na região da carbonila, além de modificação com menor intensidade na região da vibração das ligações aromáticas da lignina. Os pré‐tratamentos resultaram em baixa solubilização de inibidores fenólicos na maioria dos pré‐tratamentos com persulfato. Também não foram detectadas concentrações de derivados furânicos provenientes da degradação térmica da hemicelulose (furfural) e celulose (HMF). De maneira geral, os pré‐tratamentos do bagaço de cana com persulfato de sódio em condições químicas distintas age sinergicamente na desestruturação da fibra do bagaço facilitando a hidrólise enzimática e na oxidação de fenólicos solubilizados a partir da oxidação da lignina / This thesis focuses on the oxidative pretreatment of sugarcane pulp in view of the enzymatic hydrolysis use for cellulosic ethanol production. It intends to study the sodium persulfate pretreatment in order to obtain an efficient pre‐hydrolyzate for enzymatic saccharification of the pulp. The pulp depolymerization can generate fermentable sugar quantities such as glucose and xylose, and thus substantially increase the amount of ethanol produced by the same sugar cane growing area. Preliminary results indicated that the pretreatment containing sodium persulfate alone can disrupt the pulp at mild temperatures reached during 0.5 min of microwave irradiation, resulting in an increased glucose (124%) and xylose (168%) after enzymatic hydrolysis. The most significant result of glucose (162%) and xylose (265%) was obtained with 3.0 min of microwave irradiation, in an alkaline medium with persulfate. In this pretreatment, an expressive structural modification in the carbonyl region was observed through IR spectrum, besides the less intensive modification in the lignin’s aromatic rings vibration region. The oxidative pretreatment minimized the phenolic inhibitors production, making it undetectable on most experiments. Also, concentrations of furanic derivate from thermal degradation of hemicellulose (furfural) and cellulose (HMF) carbohydrates weren’t detected. Generally, the sodium persulfate pretreatment acts synergistically on the pulp fiber disruption and on the solubilized phenolic oxidation

Este estudo trata das proteínas relacionadas ao desenvolvimento e à formação da parede celular vegetal de cana-de-açúcar, com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento de novas tecnologias para a produção de etanol celulósico a partir do bagaço de cana. Com isso, as proteínas de parede celular de entrenós e folhas de plantas com 4 meses de idade em dois estádios de desenvolvimento, juvenil e maduro, foram identificadas. Para extração foi utilizado o método não destrutivo por infiltração a vácuo utilizando dois sais, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl seguido de centrifugação. As amostras complexas foram digeridas, fracionadas, sequenciadas por LC-MSE . Os peptídeos foram processados utilizando o ProteinLynx 2.5 e comparados com a base de dados de ESTs traduzidos de cana e sorgo. A anotação das proteínas foi realizada com base no programa PFAM e dividas em classes funcionais. Apenas as proteínas que apareceram em pelo menos duas das três repetições biológicas foram utilizadas na análise principal. Para prever a localização subcelular das proteínas selecionadas utilizaram-se os softwares: SignalP, TargetP, Predotar e TMHMM. Apenas aquelas proteínas que foram preditas para serem secretadas por dois ou mais programas foram consideradas como proteínas de parede celular (PPC). Ao todo, 543 proteínas foram consideradas como PPC: 205 em entrenós jovens, 143 em entrenós maduros, 124 em folhas jovens e 71 em folhas maduras. Dentre essas proteínas, 365 foram consideradas diferentes, e caracterizadas em dez classes funcionais. A análise estatística compreendeu a análise de PCA e PLS-DA, havendo diferença estatística entre os tratamentos analisados. Neste trabalho, foram encontradas 66 glicosil-hidrolases e 39 peroxidases, sendo 14 e 11 exclusivas de tecidos juvenis, respectivamente. Essas proteínas são conhecidas por terem funções relacionadas à quebra e ao remodelamento dos polissacarídeos da parede celular vegetal, e, portanto, foram indicadas neste estudo como alvo de pesquisas futuras que utilizem as próprias enzimas da planta para otimização da produção do etanol celulósico.Individualmente, este estudo foi o que mais identificou PPCs dentre a literatura existente, além de ter sido pioneiro na utilização da análise quantitativa para PPC. / This study provides information about the proteins of the cell wall of sugarcane at diferente stages of development and formation. The aim of this study is to assist in the development of new technologies for the production of cellulosic ethanol from sugarcane bagasse. Cell wall proteins from 4-month-old internodes and leaves of sugarcane in two developmental stages, juvenile and mature, have been identified. Protein extraction was performed with a non-destructive method by using vacuum infiltration with two salts, 0.2 M CaCl2 and 2 M LiCl, followed by centrifugation. Complex samples were digested, fractionated and sequenced by LC-MSE. Peptides were processed by ProteinLynx 2.5 and compared to the translated sugarcane and sorghum ESTs database. The annotation of the proteins was performed using PFAM and the functional classification was according the one used in other related studies. Only the proteins that appeared in at least two of the three biological replicates were used in the main analysis. In order to predict the subcellular localization of these proteins, SignalP, TargetP, TMHMM and Predotar softwares were used. Only those proteins that were predicted to be secreted by two or more programs were considered as cell wall proteins (PPS). Altogether, 543 proteins were classified as PPC: 205 inimmature internodes, 143 in mature internodes, 124 in young leaves and 71 in matured leaves. Among these proteins, 365 were considered different, and divided into ten functional classes. Statistical analysis was made with PCA and PLSDA, confirming that there were statistical differences among the treatments. In this work, 66 glycoside hydrolases and 39 peroxidases c identified, being 14 and 11 unique to young tissues, respectively. These proteins have their function related to plant cell wall polysaccharides breakdown and remodeling, and, therewith, the glycoside hydrolases and peroxidases found in this study were indicated to be the target of future research using the plant\'s own enzymes to optimize the cellulosic ethanol production. Individually, this study was the one that most identified PPC among the existing literature, and is a pioneer in the use of quantitative analysis for PPCs.

Este estudo trata das proteínas relacionadas ao desenvolvimento e à formação da parede celular vegetal de cana-de-açúcar, com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento de novas tecnologias para a produção de etanol celulósico a partir do bagaço de cana. Com isso, as proteínas de parede celular de entrenós e folhas de plantas com 4 meses de idade em dois estádios de desenvolvimento, juvenil e maduro, foram identificadas. Para extração foi utilizado o método não destrutivo por infiltração a vácuo utilizando dois sais, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl seguido de centrifugação. As amostras complexas foram digeridas, fracionadas, sequenciadas por LC-MSE . Os peptídeos foram processados utilizando o ProteinLynx 2.5 e comparados com a base de dados de ESTs traduzidos de cana e sorgo. A anotação das proteínas foi realizada com base no programa PFAM e dividas em classes funcionais. Apenas as proteínas que apareceram em pelo menos duas das três repetições biológicas foram utilizadas na análise principal. Para prever a localização subcelular das proteínas selecionadas utilizaram-se os softwares: SignalP, TargetP, Predotar e TMHMM. Apenas aquelas proteínas que foram preditas para serem secretadas por dois ou mais programas foram consideradas como proteínas de parede celular (PPC). Ao todo, 543 proteínas foram consideradas como PPC: 205 em entrenós jovens, 143 em entrenós maduros, 124 em folhas jovens e 71 em folhas maduras. Dentre essas proteínas, 365 foram consideradas diferentes, e caracterizadas em dez classes funcionais. A análise estatística compreendeu a análise de PCA e PLS-DA, havendo diferença estatística entre os tratamentos analisados. Neste trabalho, foram encontradas 66 glicosil-hidrolases e 39 peroxidases, sendo 14 e 11 exclusivas de tecidos juvenis, respectivamente. Essas proteínas são conhecidas por terem funções relacionadas à quebra e ao remodelamento dos polissacarídeos da parede celular vegetal, e, portanto, foram indicadas neste estudo como alvo de pesquisas futuras que utilizem as próprias enzimas da planta para otimização da produção do etanol celulósico.Individualmente, este estudo foi o que mais identificou PPCs dentre a literatura existente, além de ter sido pioneiro na utilização da análise quantitativa para PPC. / This study provides information about the proteins of the cell wall of sugarcane at diferente stages of development and formation. The aim of this study is to assist in the development of new technologies for the production of cellulosic ethanol from sugarcane bagasse. Cell wall proteins from 4-month-old internodes and leaves of sugarcane in two developmental stages, juvenile and mature, have been identified. Protein extraction was performed with a non-destructive method by using vacuum infiltration with two salts, 0.2 M CaCl2 and 2 M LiCl, followed by centrifugation. Complex samples were digested, fractionated and sequenced by LC-MSE. Peptides were processed by ProteinLynx 2.5 and compared to the translated sugarcane and sorghum ESTs database. The annotation of the proteins was performed using PFAM and the functional classification was according the one used in other related studies. Only the proteins that appeared in at least two of the three biological replicates were used in the main analysis. In order to predict the subcellular localization of these proteins, SignalP, TargetP, TMHMM and Predotar softwares were used. Only those proteins that were predicted to be secreted by two or more programs were considered as cell wall proteins (PPS). Altogether, 543 proteins were classified as PPC: 205 inimmature internodes, 143 in mature internodes, 124 in young leaves and 71 in matured leaves. Among these proteins, 365 were considered different, and divided into ten functional classes. Statistical analysis was made with PCA and PLSDA, confirming that there were statistical differences among the treatments. In this work, 66 glycoside hydrolases and 39 peroxidases c identified, being 14 and 11 unique to young tissues, respectively. These proteins have their function related to plant cell wall polysaccharides breakdown and remodeling, and, therewith, the glycoside hydrolases and peroxidases found in this study were indicated to be the target of future research using the plant\'s own enzymes to optimize the cellulosic ethanol production. Individually, this study was the one that most identified PPC among the existing literature, and is a pioneer in the use of quantitative analysis for PPCs.

Após as crises de petróleo ocorridas no século passado, vários países buscaram o desenvolvimento de novos combustíveis a fim de reduzir a dependência deste recurso natural. O Brasil foi um deles e criou o Programa Nacional do Álcool (Pró-Álcool) para incentivar a produção de etanol. Hoje, mais de 80% da frota nacional de veículos rodam ou somente com etanol ou com a mistura de gasolina e etanol. Para atender a crescente demanda de etanol, sem competir com áreas cultiváveis voltadas para produção de alimentos, fontes de materiais lignocelulósicos podem ser utilizadas com o intuito de se aproveitar a fração celulósica para obtenção de açúcar fermentável. Neste trabalho propôs-se avaliar o efeito de tecnologias de pré-tratamento dos subprodutos sucroalcooleiros (bagaço e palha de cana), seguida ou não de uma etapa de deslignificação, sobre a conversão enzimática da celulose de cada biomassa vegetal. Os materiais lignocelulósicos foram pré-tratados por explosão a vapor (bagaço), impregnação a vapor (palha) e por ultrassom (bagaço e palha). A etapa de pré-tratamento por explosão a vapor foi realizada no reator industrial de 5 m3 sob a condição de 200°C por 7min, das Usinas de Açúcar, Álcool e Biodiesel Vale do Rosário. A etapa de pré-tratamento por impregnação de vapor foi realizada em reator de 20 L sob as condições de 180, 185, 190, 195 °C por 10 min e 190°C por 15 min. Já a etapa de pré-tratamento por ultrassom foi realizada em banho de ultrassom a 55°C por 40 min e radiação de 40 kHz/120W. Os materiais pré-tratados foram deslignificados sob a condição de NaOH 1% (m/v), 100°C por 1h, variando somente o tamanho reator em função da quantidade de biomassa disponível. Para o bagaço explodido a vapor, a deslignificação organosolv também foi testada, variando as condições numa matriz de planejamento L18 de Taguchi. Os ensaios de hidrólise enzimática foram realizados empregando Celluclast 1.5L (15 FPU/g de amostra) e ?-Glucosidase (10 UI/g de amostra). Das três técnicas de pré-tratamento avaliadas (explosão a vapor, impregnação a vapor e ultrassom), somente os métodos baseados em vapor foram eficientes na desagregação dos constituintes dos subprodutos sucroalcooleiros. Esses métodos foram capazes de remover grande parte da hemicelulose (acima de 70%) e uma parte da lignina (<40%), elevando a digestibilidade da celulose pelas enzimas celulolíticas (conversão de 66 a 68%). O método de pré-tratamento com ultrassom provocou o aumento da recalcitrância dos materiais lignocelulósicos tanto para o agente deslignificante (soda cáustica) como para as celulases, sendo, portanto, um método não indicado, dentro da faixa das condições avaliadas, para um processo de conversão dos subprodutos sucroalcooleiros em açúcares fermentáveis. A etapa de deslignificação com soda cáustica foi essencial para elevar a digestibilidade dos materiais lignocelulósicos pré-tratados por explosão a vapor ou com ultrassom. Entretanto, para a palha pré-tratada hidrotermicamente, a etapa de extração alcalina não promoveu um efeito positivo sobre a conversão enzimática de celulose. De forma geral, observou-se que o bagaço de cana apresenta um potencial ligeiramente maior para conversão em açúcares fermentáveis em comparação com a palha de cana. / After the oil crises occurred in the last century, many countries have been to develop new fuels to reduce dependence on this natural resource. Brazil was one of them and created the National Alcohol Program (Pro-álcool) to promote the production of ethanol. Today, more than 80% of the national vehicles run on ethanol or with a mixture of gasoline and ethanol. To supply the growing demand for ethanol, without it to affect the food production farmland, sources of lignocellulosic materials can be used in order to take advantage of the cellulosic fraction for production of fermentable sugar. This work had objective to evaluate the effect of pretreatment technologies of sugarcane byproducts (bagasse and straw), followed or not by a stage of delignification, on the cellulose enzymatic conversion of each biomass. The lignocellulosic materials were pretreated by steam explosion (bagasse), vapor impregnation (straw) and ultrasound (bagasse and straw). The steam explosion pretreatment was carried out in 5 m3 industrial reactor under the condition of 200 °C for 7 min, from Usinas de Açúcar, Álcool e Biodiesel Vale do Rosário. The steam impregnation pretreatment was carried out in 20 L reactor under conditions of 180, 185, 190, 195 °C for 10 min and 190 °C for 15 min. The ultrasound pretreatment was performed in the ultrasonic bath at 55 °C for 40 min and 40 kHz/120W radiation. The pretreated materials were deslignified on condition of 1% (w/v) NaOH, 100 °C for 1 h, using different sizes of reactors due to amount of biomass available. For the steam exploded bagasse, one stage of organosolv delignification was also tested varying the conditions in a L18 Taguchi matrix. The enzymatic hydrolysis tests were performed using Celluclast 1.5L (15 FPU/g of material) and ?-Glucosidase (10 IU/g of material). From three pretreatment techniques evaluated (steam explosion, steam impregnation and ultrasonic), only the vapor-based methods were efficient in the breakdown of the constituents of sugarcane byproducts. These methods were able to remove most of the hemicellulose (above 70%) and a part of the lignin (<40%), increasing the cellulose digestibility by cellulolytic enzymes (conversion 66-68%). The ultrasound pretreatment increases the recalcitrance of lignocellulosic materials both for the caustic soda and for cellulases. Therefore, this pretreatment method is not indicated, within the conditions range assessed, for a conversion process of sugarcane byproducts to fermentable sugars. The delignification stage with caustic soda was essential to increase the digestibility of lignocellulosic materials pretreated by steam explosion or ultrasound. However, for the straw pretreated hydrothermically, the alkaline extraction did not cause a positive effect on the enzymatic conversion of cellulose. Overall, it was observed that sugarcane bagasse has a slightly higher potential for conversion to fermentable sugars in relation to sugarcane straw.

Compreender a dinâmica da decomposição da palha de cana-de-açúcar fora da região tradicional de cultivo no Brasil é primordial devido à crescente expansão da cultura englobando os estados de GO, MS e PR. Sendo assim, um experimento de campo foi conduzido nestas regiões de expansão de cultivo da cultura para avaliar a decomposição de quantidades iniciais de palha deixadas na superfície do solo (3, 6 e 12 Mg ha-1) em função das condições edafoclimáticas. Estas quantidades de palha foram estudadas visando compreender os impactos do manejo de remoção da palha no processo de decomposição deste resíduo cultural. A perda de massa da matéria de seca foi quantificada após 1, 4, 8 e 10 meses, enquanto o conteúdo de carbono (C), nitrogênio (N) e composição bioquímica da palha (i.e. celulose, hemicelulose e lignina) foram avaliados no início e final do experimento para acompanhar as alterações ao longo de um ciclo da cultura. Do mesmo modo, alterações visuais na palha em decomposição foram avaliadas através da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A perda de massa foi ajustada por um modelo exponencial, o qual foi capaz de representar acuradamente o padrão da decomposição da palha ao longo do tempo. Diferenças significativas entre os locais foram observadas para a perda de massa e C, diretamente ligadas a redução no conteúdo de celulose e hemicelulose. Na área experimental do MS houve uma redução na massa do resíduo 30% maior para as maiores quantidades de palha sobre o solo e uma liberação de C 35% maior quando comparado com as áreas em GO e PR. Após dez meses de decomposição, a relação C:N entre os tratamentos apresentou um decaimento linear, equivalente a 65:1 e 41:1 para a menor e maior quantidade de resíduo, sendo correlacionado com a menor (65%) e maior (76%) perda de massa, respectivamente. A redução da relação C:N está associada com o aumento relativo na concentração de N da palha ao final do estudo, variando de 4,5 a 9,4 g N kg-1 com um aumento gradativo entre as quantidades crescentes de resíduo. Após um ciclo de cultivo, houve alterações visuais na palha em decomposição, possivelmente em função da perda dos componentes bioquímicos. Sendo assim, foi possível concluir que uma menor taxa de remoção da palha de cana-de-açúcar proporciona um aumento na taxa de decomposição (maior perda de massa ao longo do tempo), implicando em maiores contribuições para o estoque de C e qualidade do solo. De forma geral, a perda de massa após um ciclo de decomposição é semelhante entre a região brasileira tradicional e de expansão de cultivo da cana-de-açúcar, entretanto, é possível que fatores locais como umidade, microrganismos e textura do solo, favoreçam a decomposição ocasionando diferenças na perda de massa entre os locais. / The comprenhension of sugarcane straw decomposition dynamics outside the traditional cultivation region in Brazil is relevant due to the increasing culture expansion encompassing GO, MS and PR states. Thus, a field experiment was conducted in these crop expansion regions to evaluate the decomposition of different straw amounts left on soil surface (3, 6 and 12 Mg ha-1) as a function of soil and climatic conditions. These amounts of straw were studied in order to understand the impacts of straw removal management in the decomposition process of this residue. The dry mass (DM) loss was quantified after 1, 4, 8 and 10 months, while the carbon content (C), nitrogen (N) and biochemical composition of the straw (i.e. cellulose, hemicellulose and lignin) were measured in the beginning and at the end of the experiment to follow the changes throughout a crop cycle. Likewise, visual changes in the decomposing straw were evaluated through Scanning Electron Microscopy (SEM). The DM loss was adjusted by an exponential model, which was able to accurately represent the pattern of straw decomposition over time. Significant differences between sites were observed for DM and C loss, directly linked to the reduction in cellulose and hemicellulose content. The MS site lost 30% more DM in the largest amounts of straw and 35% more C when compared to GO and PR sites. After 10 months of decomposition, the C:N ratio between treatments presented a linear decay, equivalent to 65:1 and 41:1 for the lowest and highest amount of straw, being correlated with the lowest (65%) and highest (76%) DM loss, respectively. The reduction in the C:N ratio was associated with the relative increase in the straw-N concentration at the end of the study, varying from 4.5 to 9.4 g N kg-1 with a gradual increase between increasing amounts of straw. After a crop cycle the sugarcane straw change visually, possible due to loss of biochemical compounds. Thus, it was possible to conclude that a lower rate of sugarcane straw removal induces an increase in the decomposition rate (higher DM loss over time), implying higher contributions to C stock and soil quality. Generally, DM loss after a decomposition cycle is similar between Brazil\'s traditional and sugarcane-expansion cultivation regions, however, it is possible that local factors as moisture, microorganisms and soil texture favor decomposition causing differences in DM loss between sites.

Atualmente há grande interesse no desenvolvimento de processos enzimáticos eficientes para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. O objetivo deste trabalho foi a otimização da produção por fermentação em estado sólido e a caracterização bioquímica, no extrato bruto, das -glucosidases, -xilosidases e xilanases produzidas por Colletotrichum graminicola e das lacases produzidas por Pycnoporus sanguineus. Também foi avaliado o potencial de aplicação dos extratos obtidos em coquetéis enzimáticos para a sacarificação de resíduos agroindustriais. A otimização das condições de cultivo, empregando a Metodologia de Superfície de Resposta, levou à produção de 159,3 ± 12,7 U g-1, 125,88 ± 6,4 U g-1, 378,1 ± 23,3 U g-1 e 138,6 ± 6,4 U g-1 de -glucosidases, -xilosidases, xilanases e lacases, respectivamente. Os meios de cultivo empregados foram constituídos por farelo de trigo suplementado com resíduos agroindustriais. Todas as enzimas produzidas apresentaram pH e temperatura ótimos de reação de 4,5-5,0 e 65ºC, respectivamente, bem como boa estabilidade térmica e ao pH. O coquetel composto pelos extratos brutos obtidos em condições otimizadas para a produção de xilanases (ECg) e lacases (EPs), em mistura com um extrato bruto de Trichoderma reesei rico em celulases (ETr) foi muito eficiente na sacarificação de palha de cana e papelão, sem pré-tratamento, atingindo rendimentos de 41,4 e 71,1% em glicose, respectivamente. Além disso, este coquetel foi mais eficiente na sacarificação de bagaço de cana explodido e in natura bem como de palha de cana in natura, quando comparado a um coquetel contendo celulases comerciais (Celluclast®) em mistura com ECg e EPs. Visando estudos futuros da ação individual de cada enzima sobre a biomassa, foi purificada uma -glucosidase majoritária de C. graminicola. A enzima mostrou temperatura e pH ótimos de reação de 5,0 e 65ºC, respectivamente, boa estabilidade térmica e ao pH, além da estimulação por xilose, propriedade muito interessante para emprego em coquetéis mistos de celulases e xilanases. Os resultados encontrados sugerem que as enzimas produzidas por C. graminicola e P. sanguineus, assim como os coquetéis enzimáticos avaliados, apresentam características muito interessantes para aplicações biotecnológicas, particularmente em processos de sacarificação da biomassa para obtenção de etanol celulósico. / There is currently a great interest in developing efficient processes for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. The objective of this study was the optimization of the culture conditions for the production of -glucosidases, xylanases and -xylosidases by Colletotrichum graminicola and laccases by Pycnoporus sanguineus under solid state fermentation, followed by the biochemical characterization of the enzymes in the crude extracts. The potential of application of the extracts to compose enzyme cocktails for the saccharification of agroindustrial residues was also investigated. Optimization of the culture conditions using the Response Surface Methodology led to the production of 159.3 ± 12.7 U g - 1, 125.88 ± 6.4 U g- 1, 378.1 ± 23.3 U g - 1 and 138.6 ± 6.4 U g - 1 of -glucosidases, -xylosidases, xylanases and laccases, respectively. The culture media employed consisted mainly of wheat bran, supplemented with agroindustrial residues. All enzymes produced showed optimum pH and temperature of 4.5-5.0 and 65° C, respectively, as well as good thermal and pH stability. A cocktail composed of the crude extracts obtained under optimized conditions for the production of xylanases (ECg) and laccases (EPs), mixed with a Trichoderma reesei crude extract (ETr), rich in cellulases, was highly efficient for the saccharification of sugarcane trash and cardboard, without pretreatment, reaching yields of 41.4% and 71.1% in glucose, respectively. Moreover, this cocktail was more efficient than a cocktail composed of commercial cellulases (Celluclast ®) in combination with ECg and EPs for the saccharification of raw and steam exploded sugarcane bagasse, as well as raw sugarcane trash. Aiming future studies on the individual action of each enzyme on biomass, a majoritary -glucosidase from C. graminicola was purified. The enzyme showed optima of temperature and pH of 5.0 and 65° C, respectively, good thermal and pH stability, as well as stimulation by xylose, a very interesting property for its application in mixed cellulase-xylanase cocktails. The results suggested that the enzymes produced by C. graminicola and P. sanguineus, as well as the cocktails employed in this study, have good potential for biotechnological applications, particularly in biomass saccharification processes for cellulosic ethanol production.

Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI. / Trichoderma harzianum is a fungus that has a considerable potential in biomass hydrolysis application due to its elevated cellulolytic activity. Cellulases from Trichoderma reesei have been widely used as model in studies of cellulose breakdown. However, cellulases from Trichoderma harzianum are less-studied enzymes which have not been characterized biophysically and biochemically as yet. CBHI, a cellobiohydrolase I, is the major cellulolytic enzyme produced by Trichoderma sp. and is currently one of the most investigated cellulases for biofuel applications. CBHI hydrolyzes crystalline cellulose to soluble cellobiose units, which turns it into a key enzyme for producing fermentable sugars from biomass. The aim of this work was to purify and characterize the CBHI of Trichoderma harzianum (ThCBHI). We established an efficient purification protocol of ThCBHI, from the homologous expression. The biochemical characterization of ThCBHI showed that the protein has a molecular mass of 66 kDa, a pI of 5,23, and the optimum pH and temperature for its activity are 5,0 and 50 ºC, respectively. The effect of pH and temperature on secondary and tertiary structure and enzymatic activity of ThCBHI were analyzed by CD and Fluorescence spectroscopy and showed that they affect protein stability by two distinct mechanisms. Variations of pH modify protonation of the residues, affecting directly its activity, leading to structural destabilization only at extreme pH values, such as pH 9, 0. On the other hand, temperature has direct influence on mobility, fold and compactness of the folding enzyme, at temperatures above 60 ºC, there is loss of secondary and tertiary structure. When the assays were conducted in the presence of the cellobiose, a competitive inhibitor, thermal stability of ThCBHI was significantly increased to 61,5 to 65,9 ºC. Structural studies and molecular dynamics simulations showed that the flexibility of Tyr260, in comparison to the Tyr247 from the homologous T. reesei CBHI, is enhanced due to the short side chains of adjacent Val216 and Ala384 residues and creates an additional gap at the side face of the catalytic tunnel. In addition, CBHI of T. harzianum has a shortened loop at the entrance of the cellulose-binding tunnel, which has been described to interact with the substrate in T. reesei CBHI. These structural features might explain why T. harzianum enzyme displays higher kcat value and lower product inhibition on both glucosides and lactosides substrates in comparison to T. reesei CBHI.

O objetivo deste trabalho foi encontrar os melhores cenários para os vetores energéticos etanol e eletricidade em termos das quantidades disponibilizadas de bagaço e palha para cada processo e da composição de biomassa em uma usina de processamento de cana-de-açúcar. O modelo simulado é abrangente, com otimização multiobjetivo. Com isso, mostrou-se que a biomassa possui características específicas para os conjuntos de vetores de saída próximos ao limite máximo de energia (fronteira de Pareto). Os resultados foram obtidos com a utilização do Método de Monte Carlo para gerar de forma aleatória a combinação das variáveis de interesse como umidade, fibra e outras. A contribuição das variáveis na produção otimizada dos vetores de energia foi avaliada por meio de distribuição de probabilidade e mostrou que a conversão ideal ocorre para altos teores de fibra e pequena umidade. A composição da fibra do bagaço e da palha tem importante papel nas vias de conversão, sendo a lignina a variável de maior impacto. O modelo mostrou que a palha tem papel menos relevante na otimização, possivelmente em função da menor quantidade em que é usada e da menor variabilidade de suas propriedades. / The objective of this work was to find the best scenarios for production of the energy vectors ethanol and electricity from sugarcane bagasse and straw, considering variables as mass flow rate destined to each process, biomass composition and fibers composition in a sugarcane plant. The model is comprehensive with multiobjective optimization and was able to show that biomass has a characteristic set of properties in the vicinity of the maximum limits of energy (Paretos frontier). In order to generate the stochastic variables of interest as humidity, fiber content and fiber properties as well as the amounts of biomass destined to energy and ethanol it was applied the Monte Carlo method. The contribution of each variable to the optimized production of energy vectors was assessed by probability distribution and showed that the ideal conversion occurs for high fiber and low humidity contents. The fiber compositions of the bagasse and straw had a secondary importance on the conversion routes, with lignin playing a prominent role. The model indicated that straw has a less relevant role in the optimization, possibly because it is used in smaller quantities and has a narrower variation of its properties.