A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas. Para estabelecer a infecção, estas bactérias desenvolveram estratégias de escape ao sistema complemento. Neste trabalho demonstramos que o sobrenadante de cultura de leptospiras patogênicas é capaz de inibir as três vias do complemento. Observamos que esse sobrenadante possui atividade proteolítica sobre C3, C3b e iC3b, além do FB (via alternativa), C2 e C4b (via clássica e das lectinas). As proteínas C3, C4, C2 e FB também foram clivadas quando soro humano normal (SHN) foi utilizado como fonte de complemento. Demonstramos que as proteases atuam em conjunto com os reguladores do hospedeiro Fator I e Fator H na clivagem de C3b. As clivagens foram inibidas pela 1,10-fenantrolina, sugerindo a participação de metaloproteases. Metaloproteases de leptospira da família das termolisinas foram produzidas como proteínas recombinantes e clivaram C3 no SHN. Concluímos que proteases de leptospiras patogênicas podem desativar moléculas do complemento e são potencias alvos para novas terapias em leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira. To establish the infection, these bacteria have developed strategies to escape the complement system. In this work, we demonstrate that culture supernatant from pathogenic Leptospira is capable of inhibiting the three complement pathways. We observe that this supernatant possess proteolytic activity under C3, C3b and iC3b, FB (alternative pathway), C2 and C4b (classical and lectin pathways). The proteins C3, C4, C2 and FB were also cleaved when normal human serum (NHS) was used as a source of complement. We demonstrate that these proteases act together with the host regulators Factor I and Factor H in C3b cleavage. The cleavages were inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the involvement of metalloproteinases. Leptospira metalloproteinases from the thermolysin family were produced as recombinant proteins and cleaved C3 in NHS. We concluded that proteases from pathogenic Leptospira can inactivate complement molecules and are potential targets for new therapies in leptospirosis.

Diferentes mecanismos têm sido mostrados por estar envolvidos na evasão à morte mediada por complemento. Neste estudo, demonstramos que a aquisição do FH pela Leptospira é crucial para a sobrevivência das bactérias no soro e que estas espiroquetas interagem com FH, FHL-1, FHR-1 e C4BP. Nós também demonstramos que a ligação à estes reguladores é mediada pelas proteínas leptospiral immunoglobulin-like (Lig). FH se liga as proteínas Lig via short consensus repeat (SCR) principalmente pelos domínios 5 e 20. Ensaios de competição sugerem que FH e C4BP têm sítios de ligação diferentes nas proteínas Lig. Além disso, FH e C4BP ligados nas proteínas Lig mantêm a atividade de cofator, mediando a degradação de C3b e C4b pelo FI. Nós demonstramos que a aquisição de FH e C4BP pela L. biflexa transgênica para LigA e LigB exercem um papel de proteção na sobrevida destas bactérias. Análise por citometria de fluxo também confirmaram a capacidade das leptospiras transgênicas para controlar a deposição de C3, C4 e MAC. As proteínas Lig também foram capazes de ligar plasminogênio, o qual foi ativado em plasmina e esta enzima foi capaz de degradar fibrinogénio, C3b e C5. Estas clivagens inativam C3b e C5, evitando a progressão da cascata, e bloqueando as três vias de complemento. / Different mechanisms have been shown to be involved in evasion of complement-mediated killing. In this study, we demonstrate that acquisition of FH on the Leptospira surface is crucial for bacterial survival in the serum and that these spirochetes interact with FH, FHL-1, FHR-1 and C4BP. We also demonstrate that binding to these regulators is mediated by leptospiral immunoglobulin-like (Lig) proteins. FH binds to Lig proteins via short consensus repeat (SCR) domains 5 and 20. Competition assays suggest that FH and C4BP have distinct binding sites on Lig proteins. Moreover, FH and C4BP bound to immobilized Ligs display cofactor activity, mediating C3b and C4b degradation by FI. We demonstrated that acquisition of FH and C4BP by the LigA and LigB transformed L. biflexa have the protective role, being crucial by bacterial survival. Analysis by Cytometer fluid also confirmed the ability of L. biflexa expressing LigA and LiB to controller the deposition of C3, C4 and MAC. Lig proteins were able to bind plasminogen, which was activated to plasmin and this enzyme was able to degrade the fibrinogen, C3b and C5. These cleavages inactivate C3b and C5, preventing progression of the complement cascade and blocking the three complement pathways.

Diferentes mecanismos têm sido mostrados por estar envolvidos na evasão à morte mediada por complemento. Neste estudo, demonstramos que a aquisição do FH pela Leptospira é crucial para a sobrevivência das bactérias no soro e que estas espiroquetas interagem com FH, FHL-1, FHR-1 e C4BP. Nós também demonstramos que a ligação à estes reguladores é mediada pelas proteínas leptospiral immunoglobulin-like (Lig). FH se liga as proteínas Lig via short consensus repeat (SCR) principalmente pelos domínios 5 e 20. Ensaios de competição sugerem que FH e C4BP têm sítios de ligação diferentes nas proteínas Lig. Além disso, FH e C4BP ligados nas proteínas Lig mantêm a atividade de cofator, mediando a degradação de C3b e C4b pelo FI. Nós demonstramos que a aquisição de FH e C4BP pela L. biflexa transgênica para LigA e LigB exercem um papel de proteção na sobrevida destas bactérias. Análise por citometria de fluxo também confirmaram a capacidade das leptospiras transgênicas para controlar a deposição de C3, C4 e MAC. As proteínas Lig também foram capazes de ligar plasminogênio, o qual foi ativado em plasmina e esta enzima foi capaz de degradar fibrinogénio, C3b e C5. Estas clivagens inativam C3b e C5, evitando a progressão da cascata, e bloqueando as três vias de complemento. / Different mechanisms have been shown to be involved in evasion of complement-mediated killing. In this study, we demonstrate that acquisition of FH on the Leptospira surface is crucial for bacterial survival in the serum and that these spirochetes interact with FH, FHL-1, FHR-1 and C4BP. We also demonstrate that binding to these regulators is mediated by leptospiral immunoglobulin-like (Lig) proteins. FH binds to Lig proteins via short consensus repeat (SCR) domains 5 and 20. Competition assays suggest that FH and C4BP have distinct binding sites on Lig proteins. Moreover, FH and C4BP bound to immobilized Ligs display cofactor activity, mediating C3b and C4b degradation by FI. We demonstrated that acquisition of FH and C4BP by the LigA and LigB transformed L. biflexa have the protective role, being crucial by bacterial survival. Analysis by Cytometer fluid also confirmed the ability of L. biflexa expressing LigA and LiB to controller the deposition of C3, C4 and MAC. Lig proteins were able to bind plasminogen, which was activated to plasmin and this enzyme was able to degrade the fibrinogen, C3b and C5. These cleavages inactivate C3b and C5, preventing progression of the complement cascade and blocking the three complement pathways.