O paciente, um menino brasileiro de família japonesa e pais consagüíneos, é portador de deficiência concomitante de C9 (C9D) e Fator (F) H. Detectamos níveis reduzidos de FH (16,8µg/mL), C3 e FB no seu soro. O Western Blot confirmou a ausência da proteína de 150 kDa (FH). Sua mãe também apresentou níveis reduzidos de FH (140,5µg/mL), C3 e FB, enquanto o pai e a irmã apresentaram níveis reduzidos de FH. C9 também estava reduzido no soro do paciente (5,6µg/mL). O seqüenciamento do cDNA de FH do paciente revelou a presença de uma substituição homozigota G453A, codificando uma His127Arg. Esta substituição é também homozigota na mãe e provavelmente altera a estrutura terciária do FH e/ou seu perfil de secreção, uma vez que o FH é produzido pelos fibroblastos do paciente. O seqüenciamento de fragmentos do DNA genômico de C9 do paciente revelou a ausência da mutação Arg95, principal causa de C9D entre japoneses. O paciente é portador de uma mutação missense que possivelmente impede a secreção de FH, contudo, não pudemos identificar mutações envolvidas na C9D do paciente. / Our proband, Brazilian from a family of Japanese descent and history of consanguinity, carries C9 (C9D) and FH deficiencies. He was referred with severe recurrent pneumonia. FH (16,8 µg/mL), C3 and FB were present in the patient at low levels. Western blot assays confirmed the complete absence of 150 kDa (FH). His mother also had FH (140,5 µg/mL), C3 and FB low levels, while his father and sister presented only FH low levels. C9 was present in low levels (5,6 µg/mL) and only a very faint ~70 kDa band (expected size) was detected. Sequencing of proband?s FH cDNA revealed a homozygous G453A substitution, encoding a His127Arg. This substitution is also homozygous in the mother and may alter FH protein tertiary structure and/or its secretion profile, as we detected FH production in patient?s fibroblast. Sequencing of proband?s C9 genomic DNA fragments revealed the absence of Arg95 mutation, main cause of C9D in other C9D Japanese patients. The proband carries a missense mutation that may impair the FH secretion, but we couldn?t identify mutations explaining its C9D.

Nosso grupo estudou paciente com antecedente de infecções graves e deficiência homozigota Fator H (mutação CG453T→CA453T). Esta mutação leva a troca de códon Arg127His na molécula de Fator H (FH) resultando em acúmulo deste no retículo endoplasmático. Quando tratada a cultura de fibroblastos do paciente com curcumina in vitro, estes apresentaram aumento de secreção do FH, que mesmo mutado, apresentava função reguladora preservada. Neste protocolo, foi utilizado Theracurmin® (curcumina nanopartículada) para tratar a deficiência de FH deste paciente. Em avaliação prévia ao tratamento, foi diagnosticado lúpus com grau de atividade SLEDAI 4/105. No tratamento experimental, foram avaliados nível plasmático de curcumina e tetrahidrocurcumina. O paciente não apresentou sintomas adversos. Foi possível identificar que os níveis de curcumina e seus metabólitos se relacionaram a discreto aumento de FH detectado por Western Blot, porém sem normalização do FH e C3. O grau de atividade do lúpus se manteve estável ao longo de todo o tratamento. / Our group investigated a patient with a past of severe infections and homozygous deficiency Factor H (mutation CG453T → CA453T). This mutation leads to Arg127His codon exchange in the Factor H (FH) molecule resulting in accumulation of this protein in the endoplasmic reticulum. Once the culture of fibroblasts of the patient was treated with curcumin in vitro, they presented increased secretion of FH, which had his regulatory function. In this protocol, Theracurmin® (nanoparticle curcumin) was used to treat the FH deficiency of this patient. In pre-treatment evaluation, the pacient was diagnosed lupus with SLEDAI grade of activity 4/105. In the experimental treatment, plasma levels of curcumin and tetrahydrocurcumin were evaluated. The patient hasn\'t had adverse symptoms. It was possible to identify that the levels of curcumin and its metabolites were related to the discrete increase of FH detected by Western Blot, but without normalization of FH and C3. The degree of lupus activity remained stable throughout the treatment.

A properdina tem a capacidade de estabilizar o complexo enzimático C3bBb, com função de C3-convertase da Via Alternativa, capaz de clivar moléculas de C3, gerando C3a e C3b. Diferentes trabalhos têm sugerido que a properdina pode se ligar diretamente à superficie de um patógeno independentemente complexo enzimático C3bBb. No que diz respeito à interação de properdina com Leptospira tanto patogênica quanto não patogênica, nada se conhece na literatura. Neste trabalho demostramos que tanto a properdina presente no SHN, quanto purificada e todos os seus oligômeros interagiram com tais espiroquetas. Também observamos que a ligação da properdina pode acontecer diretamente na superfície da bactéria ou após ligação prévia do fragmento C3b. Observamos também, que na presença de SHN estas bactérias foram totalmente eliminadas, no entanto, 70% das bactérias sobreviveram quando incubadas com SHD-P. Já a adição de properdina purificada ao SHD-P provoca uma marcante diminuição no número de leptospiras viáveis. Avaliamos também quais proteínas bacterianas teriam a capacidade de se ligar à properdina. Entre as proteínas recombinantes de L. interrogans, apenas a lipoproteína LIC11087, uma proteína presente unicamente na superfície de leptospiras patogênicas, interagiu com a properdina. Todos os oligômeros de properdina presentes no SHN interagiram com a lipoproteína LIC11087. Determinamos por quantificação do complexo enzimático usando anti-Factor B policlonal que a properdina apresenta uma significativa atividade reguladora quando se depositava na superfície das bactérias não patogênicas, promovendo desta maneira, a formação da C3-convertase da Via Alternativa. Constatamos também nos sorovares patogênicos, pouca atividade reguladora pela properdina quando estas leptospiras foram pré-incubadas com a proteína. Também encontramos que a ligação da properdina na superfície de leptospiras contribui para um aumento da fagocitose por polimorfonucleares humanos de leptospiras, principalmente das não patogênicas. Nossos dados obtidos até o momento sugerem que a properdina liga-se na superfície das leptospiras patogênicas e não patogênicas; participa no processo de eliminação de leptospiras não patogênicas pela Via Alternativa; e, após sua deposição na superfície das bactérias, contribui para a formação de uma C3-convertase nas bactérias não patogênicas, diferente ao modelo tradicional. / Properdin is a positive regulatory protein that stabilizes the C3- and C5-convertases of the alternative pathway. Several studies have suggested that properdin can bind directly to the surface of a pathogen regardless enzyme complex C3bBb. With regard to the interaction of properdin with both pathogenic Leptospira and non-pathogenic, nothing is known in the literature. In this work we demonstrate that both properdin present in SHN and purified and all their oligomers interacted with spirochetes and of properdin can binding directly on the surface of bacteria or after prior binding of C3b fragment. We also observed that the Activation of the alternative pathway of complement is crucial for killing non-pathogenic L. biflexa and properdin acts effectively since this bacterium proliferates in P-depleted human serum. Since the addition of purified properdin the SHD-P causes a marked decrease in the number of viable leptospires. We also evaluated bacterial proteins which have the ability to bind to properdin. Among several recombinant leptospiral membrane proteins tested, lipoprotein LIC11087, present only in pathogenic Leptospira, was the ligand for P, P2, P3 and P4. Determined by quantifying the enzyme complex using polyclonal anti-factor B that properdin presents a significant regulatory activity when deposited on the surface of non-pathogenic bacteria, thereby promoting the formation of C3 convertase Alternative pathway. We found also in pathogenic serovars, little regulatory activity by properdin when they were preincubated leptospires with the protein. We also found that the binding of properdin in leptospiras surface contributes to increased phagocytosis of leptospira by human polymorphonuclear, mainly from non-pathogenic. Our data obtained suggest that properdin binds to Leptospira species and may play an important role to limit the proliferation of non-pathogenic Leptospira; participates in leptospiras elimination process nonpathogenic Via Alternative; and, after deposition on the surface of bacteria, it contributes to the formation of a C3 convertase in non-pathogenic bacteria, different from the traditional model.

O paciente, um menino brasileiro de família japonesa e pais consagüíneos, é portador de deficiência concomitante de C9 (C9D) e Fator (F) H. Detectamos níveis reduzidos de FH (16,8µg/mL), C3 e FB no seu soro. O Western Blot confirmou a ausência da proteína de 150 kDa (FH). Sua mãe também apresentou níveis reduzidos de FH (140,5µg/mL), C3 e FB, enquanto o pai e a irmã apresentaram níveis reduzidos de FH. C9 também estava reduzido no soro do paciente (5,6µg/mL). O seqüenciamento do cDNA de FH do paciente revelou a presença de uma substituição homozigota G453A, codificando uma His127Arg. Esta substituição é também homozigota na mãe e provavelmente altera a estrutura terciária do FH e/ou seu perfil de secreção, uma vez que o FH é produzido pelos fibroblastos do paciente. O seqüenciamento de fragmentos do DNA genômico de C9 do paciente revelou a ausência da mutação Arg95, principal causa de C9D entre japoneses. O paciente é portador de uma mutação missense que possivelmente impede a secreção de FH, contudo, não pudemos identificar mutações envolvidas na C9D do paciente. / Our proband, Brazilian from a family of Japanese descent and history of consanguinity, carries C9 (C9D) and FH deficiencies. He was referred with severe recurrent pneumonia. FH (16,8 µg/mL), C3 and FB were present in the patient at low levels. Western blot assays confirmed the complete absence of 150 kDa (FH). His mother also had FH (140,5 µg/mL), C3 and FB low levels, while his father and sister presented only FH low levels. C9 was present in low levels (5,6 µg/mL) and only a very faint ~70 kDa band (expected size) was detected. Sequencing of proband?s FH cDNA revealed a homozygous G453A substitution, encoding a His127Arg. This substitution is also homozygous in the mother and may alter FH protein tertiary structure and/or its secretion profile, as we detected FH production in patient?s fibroblast. Sequencing of proband?s C9 genomic DNA fragments revealed the absence of Arg95 mutation, main cause of C9D in other C9D Japanese patients. The proband carries a missense mutation that may impair the FH secretion, but we couldn?t identify mutations explaining its C9D.

A properdina tem a capacidade de estabilizar o complexo enzimático C3bBb, com função de C3-convertase da Via Alternativa, capaz de clivar moléculas de C3, gerando C3a e C3b. Diferentes trabalhos têm sugerido que a properdina pode se ligar diretamente à superficie de um patógeno independentemente complexo enzimático C3bBb. No que diz respeito à interação de properdina com Leptospira tanto patogênica quanto não patogênica, nada se conhece na literatura. Neste trabalho demostramos que tanto a properdina presente no SHN, quanto purificada e todos os seus oligômeros interagiram com tais espiroquetas. Também observamos que a ligação da properdina pode acontecer diretamente na superfície da bactéria ou após ligação prévia do fragmento C3b. Observamos também, que na presença de SHN estas bactérias foram totalmente eliminadas, no entanto, 70% das bactérias sobreviveram quando incubadas com SHD-P. Já a adição de properdina purificada ao SHD-P provoca uma marcante diminuição no número de leptospiras viáveis. Avaliamos também quais proteínas bacterianas teriam a capacidade de se ligar à properdina. Entre as proteínas recombinantes de L. interrogans, apenas a lipoproteína LIC11087, uma proteína presente unicamente na superfície de leptospiras patogênicas, interagiu com a properdina. Todos os oligômeros de properdina presentes no SHN interagiram com a lipoproteína LIC11087. Determinamos por quantificação do complexo enzimático usando anti-Factor B policlonal que a properdina apresenta uma significativa atividade reguladora quando se depositava na superfície das bactérias não patogênicas, promovendo desta maneira, a formação da C3-convertase da Via Alternativa. Constatamos também nos sorovares patogênicos, pouca atividade reguladora pela properdina quando estas leptospiras foram pré-incubadas com a proteína. Também encontramos que a ligação da properdina na superfície de leptospiras contribui para um aumento da fagocitose por polimorfonucleares humanos de leptospiras, principalmente das não patogênicas. Nossos dados obtidos até o momento sugerem que a properdina liga-se na superfície das leptospiras patogênicas e não patogênicas; participa no processo de eliminação de leptospiras não patogênicas pela Via Alternativa; e, após sua deposição na superfície das bactérias, contribui para a formação de uma C3-convertase nas bactérias não patogênicas, diferente ao modelo tradicional. / Properdin is a positive regulatory protein that stabilizes the C3- and C5-convertases of the alternative pathway. Several studies have suggested that properdin can bind directly to the surface of a pathogen regardless enzyme complex C3bBb. With regard to the interaction of properdin with both pathogenic Leptospira and non-pathogenic, nothing is known in the literature. In this work we demonstrate that both properdin present in SHN and purified and all their oligomers interacted with spirochetes and of properdin can binding directly on the surface of bacteria or after prior binding of C3b fragment. We also observed that the Activation of the alternative pathway of complement is crucial for killing non-pathogenic L. biflexa and properdin acts effectively since this bacterium proliferates in P-depleted human serum. Since the addition of purified properdin the SHD-P causes a marked decrease in the number of viable leptospires. We also evaluated bacterial proteins which have the ability to bind to properdin. Among several recombinant leptospiral membrane proteins tested, lipoprotein LIC11087, present only in pathogenic Leptospira, was the ligand for P, P2, P3 and P4. Determined by quantifying the enzyme complex using polyclonal anti-factor B that properdin presents a significant regulatory activity when deposited on the surface of non-pathogenic bacteria, thereby promoting the formation of C3 convertase Alternative pathway. We found also in pathogenic serovars, little regulatory activity by properdin when they were preincubated leptospires with the protein. We also found that the binding of properdin in leptospiras surface contributes to increased phagocytosis of leptospira by human polymorphonuclear, mainly from non-pathogenic. Our data obtained suggest that properdin binds to Leptospira species and may play an important role to limit the proliferation of non-pathogenic Leptospira; participates in leptospiras elimination process nonpathogenic Via Alternative; and, after deposition on the surface of bacteria, it contributes to the formation of a C3 convertase in non-pathogenic bacteria, different from the traditional model.

Diferentes mecanismos têm sido mostrados por estar envolvidos na evasão à morte mediada por complemento. Neste estudo, demonstramos que a aquisição do FH pela Leptospira é crucial para a sobrevivência das bactérias no soro e que estas espiroquetas interagem com FH, FHL-1, FHR-1 e C4BP. Nós também demonstramos que a ligação à estes reguladores é mediada pelas proteínas leptospiral immunoglobulin-like (Lig). FH se liga as proteínas Lig via short consensus repeat (SCR) principalmente pelos domínios 5 e 20. Ensaios de competição sugerem que FH e C4BP têm sítios de ligação diferentes nas proteínas Lig. Além disso, FH e C4BP ligados nas proteínas Lig mantêm a atividade de cofator, mediando a degradação de C3b e C4b pelo FI. Nós demonstramos que a aquisição de FH e C4BP pela L. biflexa transgênica para LigA e LigB exercem um papel de proteção na sobrevida destas bactérias. Análise por citometria de fluxo também confirmaram a capacidade das leptospiras transgênicas para controlar a deposição de C3, C4 e MAC. As proteínas Lig também foram capazes de ligar plasminogênio, o qual foi ativado em plasmina e esta enzima foi capaz de degradar fibrinogénio, C3b e C5. Estas clivagens inativam C3b e C5, evitando a progressão da cascata, e bloqueando as três vias de complemento. / Different mechanisms have been shown to be involved in evasion of complement-mediated killing. In this study, we demonstrate that acquisition of FH on the Leptospira surface is crucial for bacterial survival in the serum and that these spirochetes interact with FH, FHL-1, FHR-1 and C4BP. We also demonstrate that binding to these regulators is mediated by leptospiral immunoglobulin-like (Lig) proteins. FH binds to Lig proteins via short consensus repeat (SCR) domains 5 and 20. Competition assays suggest that FH and C4BP have distinct binding sites on Lig proteins. Moreover, FH and C4BP bound to immobilized Ligs display cofactor activity, mediating C3b and C4b degradation by FI. We demonstrated that acquisition of FH and C4BP by the LigA and LigB transformed L. biflexa have the protective role, being crucial by bacterial survival. Analysis by Cytometer fluid also confirmed the ability of L. biflexa expressing LigA and LiB to controller the deposition of C3, C4 and MAC. Lig proteins were able to bind plasminogen, which was activated to plasmin and this enzyme was able to degrade the fibrinogen, C3b and C5. These cleavages inactivate C3b and C5, preventing progression of the complement cascade and blocking the three complement pathways.

Diferentes mecanismos têm sido mostrados por estar envolvidos na evasão à morte mediada por complemento. Neste estudo, demonstramos que a aquisição do FH pela Leptospira é crucial para a sobrevivência das bactérias no soro e que estas espiroquetas interagem com FH, FHL-1, FHR-1 e C4BP. Nós também demonstramos que a ligação à estes reguladores é mediada pelas proteínas leptospiral immunoglobulin-like (Lig). FH se liga as proteínas Lig via short consensus repeat (SCR) principalmente pelos domínios 5 e 20. Ensaios de competição sugerem que FH e C4BP têm sítios de ligação diferentes nas proteínas Lig. Além disso, FH e C4BP ligados nas proteínas Lig mantêm a atividade de cofator, mediando a degradação de C3b e C4b pelo FI. Nós demonstramos que a aquisição de FH e C4BP pela L. biflexa transgênica para LigA e LigB exercem um papel de proteção na sobrevida destas bactérias. Análise por citometria de fluxo também confirmaram a capacidade das leptospiras transgênicas para controlar a deposição de C3, C4 e MAC. As proteínas Lig também foram capazes de ligar plasminogênio, o qual foi ativado em plasmina e esta enzima foi capaz de degradar fibrinogénio, C3b e C5. Estas clivagens inativam C3b e C5, evitando a progressão da cascata, e bloqueando as três vias de complemento. / Different mechanisms have been shown to be involved in evasion of complement-mediated killing. In this study, we demonstrate that acquisition of FH on the Leptospira surface is crucial for bacterial survival in the serum and that these spirochetes interact with FH, FHL-1, FHR-1 and C4BP. We also demonstrate that binding to these regulators is mediated by leptospiral immunoglobulin-like (Lig) proteins. FH binds to Lig proteins via short consensus repeat (SCR) domains 5 and 20. Competition assays suggest that FH and C4BP have distinct binding sites on Lig proteins. Moreover, FH and C4BP bound to immobilized Ligs display cofactor activity, mediating C3b and C4b degradation by FI. We demonstrated that acquisition of FH and C4BP by the LigA and LigB transformed L. biflexa have the protective role, being crucial by bacterial survival. Analysis by Cytometer fluid also confirmed the ability of L. biflexa expressing LigA and LiB to controller the deposition of C3, C4 and MAC. Lig proteins were able to bind plasminogen, which was activated to plasmin and this enzyme was able to degrade the fibrinogen, C3b and C5. These cleavages inactivate C3b and C5, preventing progression of the complement cascade and blocking the three complement pathways.

A Degeneração da Mácula Relacionada a Idade (DMRI) acomete pessoas com mais de 50 anos, comprometendo gravemente a visão. Desde 2005, têm-se sugerido uma correlação entre DMRI e o polimorfismo Y402H do Fator H (FH). Os mecanismos pelos quais a proteína FH participa da etiopatogenia dessa doença têm sido alvo de muitos estudos, desde então. Neste trabalho, investigamos a correlação entre esse polimorfismo e a expressão de proteínas da via alternativa e parâmetros do perfil lipídico de pacientes com DMRI. As concentrações de FH, Fator B, C3 e Proteína C-reativa foram semelhantes entre os grupos controle e paciente. As concentrações de Fator D e os autoanticorpos encontravam-se reduzidos nos pacientes; enquanto Fator I e os demais parâmetros do perfil lipídico estavam aumentados nesses pacientes. A variante Y402 aparentemente aderiu melhor à superfície das leptospiras (superfície ativadora da via alternativa) em relação à variante H402, mas não houve diferença entre as variantes em relação à ligação a células endoteliais (superfície não ativadora). / Age-related Macular Degeneration (AMD) affects people over 50 years, and severely prejudice the vision. Since 2005, it has been suggested a correlation between AMD and the Y402H polymorphism of Factor H (FH). After this, the mechanisms by which FH protein participates in the pathogenesis of this disease have been extensively studied. In this study, we investigated the correlation between this polymorphism and expression of proteins of the alternative pathway and lipid profile of patients with AMD. The concentrations of FH, Factor B, C3 and C-reactive protein were similar between the control and patient groups.Factor D concentrations and autoantibodies levels were reduced in patients, while Factor I concentrations and the levels of the other parameters of lipid profile were increased in these patients.Apparently, Y402 variant displays better adhesion to the surface of Leptospira (alternative pathway activating surface) than the H402 variant, but no difference between the variants of the linkage to endothelial cells (non-alternative pathway activating surface).

A Degeneração da Mácula Relacionada a Idade (DMRI) acomete pessoas com mais de 50 anos, comprometendo gravemente a visão. Desde 2005, têm-se sugerido uma correlação entre DMRI e o polimorfismo Y402H do Fator H (FH). Os mecanismos pelos quais a proteína FH participa da etiopatogenia dessa doença têm sido alvo de muitos estudos, desde então. Neste trabalho, investigamos a correlação entre esse polimorfismo e a expressão de proteínas da via alternativa e parâmetros do perfil lipídico de pacientes com DMRI. As concentrações de FH, Fator B, C3 e Proteína C-reativa foram semelhantes entre os grupos controle e paciente. As concentrações de Fator D e os autoanticorpos encontravam-se reduzidos nos pacientes; enquanto Fator I e os demais parâmetros do perfil lipídico estavam aumentados nesses pacientes. A variante Y402 aparentemente aderiu melhor à superfície das leptospiras (superfície ativadora da via alternativa) em relação à variante H402, mas não houve diferença entre as variantes em relação à ligação a células endoteliais (superfície não ativadora). / Age-related Macular Degeneration (AMD) affects people over 50 years, and severely prejudice the vision. Since 2005, it has been suggested a correlation between AMD and the Y402H polymorphism of Factor H (FH). After this, the mechanisms by which FH protein participates in the pathogenesis of this disease have been extensively studied. In this study, we investigated the correlation between this polymorphism and expression of proteins of the alternative pathway and lipid profile of patients with AMD. The concentrations of FH, Factor B, C3 and C-reactive protein were similar between the control and patient groups.Factor D concentrations and autoantibodies levels were reduced in patients, while Factor I concentrations and the levels of the other parameters of lipid profile were increased in these patients.Apparently, Y402 variant displays better adhesion to the surface of Leptospira (alternative pathway activating surface) than the H402 variant, but no difference between the variants of the linkage to endothelial cells (non-alternative pathway activating surface).