Circadian system of mammals is generated in suprachiasmatic nuclei of hypothalamus. This system is synchronized with light conditions through phase shifts that occur after light exposition during the subjective night. Recent studies have shown that activation of endocannabinoid receptors attenuates the light-induced phase shifts and influences the ability of circadian system to light entrainment. The aim of this work is to examine this influence on behavioral level and on light-reactive cellular processes within the suprachiasmatic nuclei. Our results show that the activation of endocannabinoid system via CB1 receptor agonist modulates the light-induced phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and the expression of c-Fos protein in neurons of suprachiasmatic nuclei in the rat's brain; these cellular processes correlate with the attenuation of light entrainment. Keywords: circadian system, suprachiasmatic nuclei, light entrainment, endocannabinoid system, CB1 receptors, extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2, c-Fos

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L’estradiol (E2) est une hormone femelle qui joue un rôle essentiel, à la fois dans la régulation et dans la détermination de certaines conditions physiologiques in vivo, telle que la différenciation et la prolifération cellulaire. Lorsque l’E2 est donné en supplément, par exemple dans le cas de thérapie hormonale, deux effets sont observés, un effet génomique et un effet non-génomique, de par son interaction avec les récepteurs à œstrogène du noyau ou de la membrane cellulaire, respectivement. L’effet non-génomique est plus difficile à étudier biologiquement parce que l’effet se produit sur une échelle de temps extrêmement courte et à cause de la nature hydrophobe de l’E2 qui réduit sa biodisponibilité et donc son accessibilité aux cellules cibles. C’est pourquoi il est nécessaire de développer des systèmes d’administration de l’E2 qui permettent de n’étudier que l’effet non-génomique de l’œstrogène. Une des stratégies employée consiste à greffer l’E2 à des macromolécules hydrophiles, comme de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou des dendrimères de type poly(amido)amine, permettant de maintenir l’interaction de l’E2 avec les récepteurs d’œstrogène de la membrane cellulaire et d’éviter la pénétration de l’E2 dans le noyau des cellules. Toutefois, ces systèmes macromolécules-E2 sont critiquables car ils sont peu stables et l’E2 peut se retrouver sous forme libre, ce qui affecte sa localisation cellulaire. L’objectif de cette thèse est donc de développer de nouvelles plateformes fonctionnalisées avec de l’E2 en utilisant les approches de synthèses ascendantes et descendantes. Le but de ces plateformes est de permettre d’étudier le mécanisme de l’effet non-génomique de l’E2, ainsi que d’explorer des applications potentielles dans le domaine biomédical. L’approche ascendante est basée sur un ligand d’E2 activé, l’acide 17,α-éthinylestradiol-benzoïque, attaché de façon covalente à un polymère de chitosan avec des substitutions de phosphorylcholine (CH-PC-E2). L’estradiol est sous forme de pro-drogue attachée au polymère qui s’auto-assembler pour former un film. L’effet biologique de la composition chimique du film de chitosan-phosphorylcholine a été étudié sur des cellules endothéliales. Les films de compositions chimiques différentes ont préalablement été caractérisés de façon physicochimique. La topographie de la surface, la charge de surface, ainsi que la rhéologie des différents films contenant 15, 25, ou 40% molaires de phosphorylcholine, ont été étudiés par microscopie à force atomique (AFM), potentiel zêta, résonance plasmonique de surface et par microbalance à cristal de quartz avec dissipation (QCM-D). Les résultats de QCM-D ont montré que plus la part molaire en phosphorylcholine est grande moins il y a de fibrinogène qui s’adsorbe sur le film de CH-PC. Des cellules humaines de veine ombilicale (HUVECs) cultivées sur des films de CH-PC25 et de CH-PC40 forment des amas cellulaire appelés sphéroïdes au bout de 4 jours, alors que ce n’est pas le cas lorsque ces cellules sont cultivées sur des films de CH-PC15. L’attachement de l’estradiol au polymère a été caractérisé par plusieurs techniques, telles que la résonance magnétique nucléaire de proton (1H NMR), la spectroscopie infrarouge avec transformée de Fourier à réfraction totale atténuée (FTIR-ATR) et la spectroscopie UV-visible. La nature hydrogel des films (sa capacité à retenir l’eau) ainsi que l’interaction des films avec des récepteurs à E2, ont été étudiés par la QCM-D. Des études d’imagerie cellulaires utilisant du diacétate de diaminofluoresceine-FM ont révélé que les films hydrogels de CH-PC-E2 stimulent la production d’oxyde nitrique par les cellules endothéliales, qui joue un rôle protecteur pour le système cardiovasculaire. L’ensemble de ces études met en valeur les rôles différents et les applications potentielles qu’ont les films de type CH-PC-E2 et CH-PC dans le cadre de la médecine cardiovasculaire régénérative. L’approche descendante est basée sur l’attachement de façon covalente d’E2 sur des ilots d’or de 2 μm disposés en rangées et espacés par 12 μm sur un substrat en verre. Les ilots ont été préparés par photolithographie. La surface du verre a quant à elle été modifiée à l’aide d’un tripeptide cyclique, le cRGD, favorisant l’adhésion cellulaire. L’attachement d’E2 sur les surfaces d’or a été suivi et confirmé par les techniques de SPR et de QCM-D. Des études d’ELISA ont montré une augmentation significative du niveau de phosphorylation de la kinase ERK (marqueur important de l’effet non-génomique) après 1 heure d’exposition des cellules endothéliales aux motifs alternant l’E2 et le cRGD. Par contre lorsque des cellules cancéreuses sont déposées sur les surfaces présentant des motifs d’E2, ces cellules ne croissent pas, ce qui suggère que l’E2 n’exerce pas d’effet génomique. Les résultats de l’approche descendante montrent le potentiel des surfaces présentant des motifs d’E2 pour l’étude des effets non-génomiques de l’E2 dans un modèle in vitro. / Estradiol (E2) is an essential female hormone in the regulation and determination of various physiological conditions in vivo, such as cell proliferation and differentiation. When supplementing exogenous E2 as a clinical strategy for hormone therapy, it generates genomic and non-genomic effect simultaneously via binding to the estrogen receptors in the cell nucleus or membrane site. Compared to the genomic effect, it is quite difficult to monitor the E2-induced non-genomic biological behavior because this effect occurs in extremely transient time scale and the bioavailability and accessibility of E2 to target cells is very low due to the hydrophobic nature of E2. As a result, it is indispensable to develop E2 delivery systems to specifically understand estrogenic non-genomic nature. One of strategies is to graft E2 to the hydrophilic macromolecules, e.g. bovine serum albumin (BSA) or poly(amido)amine dendrimer, to maintain E2 interacting with membrane estrogen receptors instead of penetrating into the cell nucleus. However, the instability of those E2-macromolecules systems, either containing free E2 leaching or discrepancies of cellular localizations, led to controversies. Herein, the objective of present thesis is to develop novel E2-functionlized platforms by the principle of bottom-up and top-down approaches for understanding the mechanism of estrogenic non-genomic effect, and further, to explore their potential applications in the biomedicine. As a bottom-up approach, an activated E2 ligand, 17α-ethinylestradiol-benzoic acid was covalently conjugated onto a phosphorylcholine substituted chitosan polymer (CH-PC-E2) as a prodrug strategy for the fabrication of self-assembled films. Through a series of combined physicochemical and cellular investigations, the relationship between various chemical compositions of chitosan-phosphorylcholine (CH-PC) films and cellular responses was also evaluated. Based on atomic force microscopy (AFM) examination, zeta-potential measurements, surface plasmon resonance (SPR), and quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D) measurements, surface topography, charge, and rheology of CH-PC films with 15, 25, and 40 mol% PC contents were characterized. Moreover, QCM-D measurements indicated that the amount of fibrinogen adsorbed on CH-PC films decreased significantly with increasing PC content. Finally, it was also showed that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) form spheroids on CH-PC25 and CH-PC40 films, but not on CH-PC15 films cultured over 4 days. In addition, the CH-PC-E2 polymer conjugates were prepared and characterized by several techniques, such as 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR), Fourier transformed infrared-attenuated total refraction (FTIR-ATR) and UV/Vis spectra measurements. The hydrogel nature of CH-PC-E2 film as well as its interactions to estrogen receptors was further extensively investigated by QCM-D study. In the cellular study, CH-PC-E2 hydrogel films can significantly stimulate the production of nitric oxide, a protective molecule in the cardiovascular system, in the endothelial cells by a diaminofluorescein-FM diacetate imaging study. The studies above demonstrated the different roles and potential applications of CH-PC-E2 and CH-PC surfaces in the cardiovascular regenerative medicine. As a top-down approach, micropatterned substrates were used for E2 functionalization, which were prepared by photolithography via aligning ~ 2 μm in diameter gold arrays onto a glass substrate. After that, a cell adhesive peptide, cyclic RGD was introduced to the glass surface in order to induce the attachment of cells. Meanwhile, estradiol was covalently immobilized on the gold surface and the process was monitored and validated by combining SPR and QCM-D studies. In the micropatterned substrate-coupled cell ELISA study, a phosphorylation level of extracellular signal-regulated kinase (ERK), which is an important non-genomic marker, was significantly elevated by this E2-functionalized micropatterned surface after 1 hour incubation. Furthermore, E2-functionalized micropatterned substrate didn’t proliferate cancer cells indicating the absence of genomic effect stimulation. Based on these results, our E2-functionalized micropatterned substrates can function as an in vitro model for the elucidation of estrogenic non-genomic behaviors.

Les maladies cardio-vasculaires (MCV), telles que l’hypertension et l’athérosclérose, s’accompagnent de modifications structurales et fonctionnelles au niveau vasculaire. Un fonctionnement aberrant de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires à l’origine de ces changements. L’endothéline-1 (ET-1) contribue à la pathogénèse des anomalies vasculaires, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, des composantes clés impliquées dans les voies prolifératives et de croissance cellulaires. Il a été suggéré que le stress oxydant jouerait un rôle intermédiaire dans les effets pathophysiologiques vasculaires de l’ET-1. En conséquence, une modulation de la signalisation induite par l’ET-1 peut servir comme éventuelle stratégie thérapeutique contre le développement des MCV. Il apparaît de nos jours un regain d’intérêt dans l’utilisation des agents phyto-chimiques pour traiter plusieurs maladies. La curcumine, constituant essentiel de l’épice curcuma, est dotée de plusieurs propriétés biologiques parmi lesquelles des propriétés anti-oxydantes, anti-prolifératrices et cardio-protectrices. Cependant, les mécanismes moléculaires de son effet cardio-protecteur demeurent obscurs. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’efficacité de la curcumine à inhiber la signalisation induite par l’ET-1 dans les CMLV. La curcumine a inhibé la phosphorylation des protéines IGF-1R, PKB, c-Raf et ERK1/2, induite par l’ET-1 et l’IGF-1. De plus, la curcumine a inhibé l’expression du facteur de transcription Egr-1 induite par l’ET-1 et l’IGF-1, dans les CMLV. Ces résultats suggèrent que la capacité de la curcumine à atténuer ces voies de signalisation serait un mécanisme d’action potentiel de ses effets protecteurs au niveau cardiovasculaire. / Cardiovascular diseases (CVDs), including hypertension and atherosclerosis, are associated with vascular functional and structural changes. Some of the cellular events underlying these processes include aberrant vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation, hypertrophy and migration. Endothelin-1 (ET-1) has been implicated in the pathogenesis of vascular abnormalities through the hyperactivation of key components of growth promoting and proliferative signaling pathways, including MAPKs and PI3-K/PKB. Vascular oxidative stress has also been suggested to play an intermediary role in mediating ET-1-induced pathophysiological effects. Interference with ET-1-induced signaling may therefore serve as a potential therapeutic strategy against the progression of cardiovascular disorders. There is presently a surge of interest in the use of plant-derived phytochemicals for the treatment of various diseases. Curcumin, the main constituent of the spice turmeric, exhibits multiple biological properties, amongst them, antioxidant, anti-proliferative and cardioprotective properties. However, the molecular mechanisms of its cardiovascular protective action remain obscure. Therefore, in the present studies, we investigated the effectiveness of curcumin to inhibit ET-1-induced signaling events in VSMC. Curcumin inhibited ET-1-induced as well as IGF-1-induced phosphorylation of IGF-1R, PKB, c-Raf and ERK1/2, in VSMC. Furthermore, curcumin inhibited the expression of transcription factor early growth response-1 (Egr-1) induced by ET-1 and IGF-1, in VSMC. In summary, these results demonstrate that curcumin is a potent inhibitor of ET-1 and IGF-1-induced mitogenic and proliferative signaling events in VSMC, suggesting that the ability of curcumin to attenuate these effects may contribute as potential mechanism for its cardiovascular protective response.

Les maladies cardio-vasculaires (MCV), telles que l’hypertension et l’athérosclérose, s’accompagnent de modifications structurales et fonctionnelles au niveau vasculaire. Un fonctionnement aberrant de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires à l’origine de ces changements. L’endothéline-1 (ET-1) contribue à la pathogénèse des anomalies vasculaires, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, des composantes clés impliquées dans les voies prolifératives et de croissance cellulaires. Il a été suggéré que le stress oxydant jouerait un rôle intermédiaire dans les effets pathophysiologiques vasculaires de l’ET-1. En conséquence, une modulation de la signalisation induite par l’ET-1 peut servir comme éventuelle stratégie thérapeutique contre le développement des MCV. Il apparaît de nos jours un regain d’intérêt dans l’utilisation des agents phyto-chimiques pour traiter plusieurs maladies. La curcumine, constituant essentiel de l’épice curcuma, est dotée de plusieurs propriétés biologiques parmi lesquelles des propriétés anti-oxydantes, anti-prolifératrices et cardio-protectrices. Cependant, les mécanismes moléculaires de son effet cardio-protecteur demeurent obscurs. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’efficacité de la curcumine à inhiber la signalisation induite par l’ET-1 dans les CMLV. La curcumine a inhibé la phosphorylation des protéines IGF-1R, PKB, c-Raf et ERK1/2, induite par l’ET-1 et l’IGF-1. De plus, la curcumine a inhibé l’expression du facteur de transcription Egr-1 induite par l’ET-1 et l’IGF-1, dans les CMLV. Ces résultats suggèrent que la capacité de la curcumine à atténuer ces voies de signalisation serait un mécanisme d’action potentiel de ses effets protecteurs au niveau cardiovasculaire. / Cardiovascular diseases (CVDs), including hypertension and atherosclerosis, are associated with vascular functional and structural changes. Some of the cellular events underlying these processes include aberrant vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation, hypertrophy and migration. Endothelin-1 (ET-1) has been implicated in the pathogenesis of vascular abnormalities through the hyperactivation of key components of growth promoting and proliferative signaling pathways, including MAPKs and PI3-K/PKB. Vascular oxidative stress has also been suggested to play an intermediary role in mediating ET-1-induced pathophysiological effects. Interference with ET-1-induced signaling may therefore serve as a potential therapeutic strategy against the progression of cardiovascular disorders. There is presently a surge of interest in the use of plant-derived phytochemicals for the treatment of various diseases. Curcumin, the main constituent of the spice turmeric, exhibits multiple biological properties, amongst them, antioxidant, anti-proliferative and cardioprotective properties. However, the molecular mechanisms of its cardiovascular protective action remain obscure. Therefore, in the present studies, we investigated the effectiveness of curcumin to inhibit ET-1-induced signaling events in VSMC. Curcumin inhibited ET-1-induced as well as IGF-1-induced phosphorylation of IGF-1R, PKB, c-Raf and ERK1/2, in VSMC. Furthermore, curcumin inhibited the expression of transcription factor early growth response-1 (Egr-1) induced by ET-1 and IGF-1, in VSMC. In summary, these results demonstrate that curcumin is a potent inhibitor of ET-1 and IGF-1-induced mitogenic and proliferative signaling events in VSMC, suggesting that the ability of curcumin to attenuate these effects may contribute as potential mechanism for its cardiovascular protective response.