Cette thèse a pour objectif d’identifier et caractériser des biomarqueurs liés aux traitements d’immunothérapie allergénique (ITA). En particulier, le travail s’est porté sur les biomarqueurs prédictifs de l’efficacité du traitement : leur estimation avant la prise médicamenteuse permettrait d’évaluer les bénéfices cliniques à l’issue de l’ITA. À partir d’échantillons de sérum collectés avant ITA et provenant de patients inclus dans une étude clinique contrôlée, randomisée et dirigée contre les pollens de graminées, une méthode d’analyse protéomique différentielle (la 2D-DIGE) a permis d’identifier une protéine comme candidat biomarqueur prédictif de l’efficacité de l’ITA. Dans un premier temps, les variants moléculaires de la protéine identifiée ont été caractérisés. L’analyse en spectrométrie de masse de la protéine a permis d’identifier les modifications post-Traductionnelles associées aux isoformes plus abondants dans le sérum des patients pour lesquels une réponse positive à l’ITA est observée. Une approche protéomique de quantification relative a été mise en œuvre par LC-MS/MS sans marquage, et a permis d’identifier des peptides de la protéine d’intérêt, portant des modifications post-Traductionnelles spécifiques, associés à un bénéfice clinique accru en fin d’ITA. Dans un deuxième temps, l’implication de la fétuine-A dans la physiopathologie de l’allergie a été étudiée. Des modèles cellulaires humains ont mis en évidence le caractère essentiel des acides sialiques portés par la protéine pour l’activation de la voie TLR4, dans les mécanismes de l’immunité innée initiant la réaction allergique. In vivo, les modèles murins d’asthme allergique développés ont en revanche montré la fonction anti-Inflammatoire de la protéine. La fétuine-A a donc un rôle ambivalent, mais est indubitablement liée à la régulation de l’inflammation allergique. La validation des candidats biomarqueurs peptidiques de la protéine dans d’autres cohortes cliniques représente une future étape clé, qui permettrait d’envisager l’usage de ces marqueurs en clinique, pour améliorer la sélection des patients les plus susceptibles de répondre à l’ITA. / This thesis aimed at identifying and characterizing predictive biomarkers associated with allergen-Specific immunotherapy (AIT) efficacy. In particular, we were focused on biomarkers predictive of AIT efficacy: quantifying such markers before treatment would allow estimating the final clinical benefit. For this purpose, serum samples were collected before AIT from patients included in a double-Blind, placebo controlled clinical study against grass pollen allergy. Their analysis by means of differential proteomics (2D-DIGE) pointed out a protein, named fetuin-A, as a candidate biomarker predictive of AIT efficacy. First, the protein fetuin-A isoforms were extensively characterized by mass spectrometry, and specific post-Translational modifications (PTMs) were associated to the isoforms more abundant in sera from patients positively responding to AIT. A second proteomic approach allowed identifying fetuin-A peptides, differentially expressed among groups of patients. Some peptides from the candidate protein, bearing specific post-Translational modifications (PTMs), are associated with an increased clinical benefit at the end of the treatment. In a second part, we studied the involvement of the fetuin-A during the course of allergic inflammation. Human cellular assays highlighted that sialic acids on the protein PTMs are essential to activate the TLR4 pathway, and inducing innate immune mechanisms linked to allergy. In vivo, murine models of allergic asthma showed an opposite anti-Inflammatory function of the protein. Thus, the protein fetuin-A is still ambivalent, but is undoubtedly linked to the regulation of allergic inflammation. Validation of peptides candidate biomarkers in larger clinical cohorts is of utmost interest, since using such biomarkers in clinics would improve patients’ selection and therefore clinical benefit from the treatment.

Les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) représentent une arme primordiale dans la défense contre divers agents pathogènes; notamment les bactéries, les champignons, les cellules tumorales de même que les cellules infectées par des virus. Cependant, certaines pathologies reliées à l’inflammation chronique soulèvent l’implication des neutrophiles notamment dans l’arthrite rhumatoïde. La réponse inflammatoire persistante générée par l’activation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite à la sécrétion non contrôlée de leurs produits cytotoxiques. Même si l’activation chronique des neutrophiles est néfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait s’avérer un bon outil en cas de neutropénie, comme c’est souvent le cas les patients ayant reçu des traitements de chimiothérapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise à identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mécanisme d’action impliqué dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isolés par Lagraoui (1999), le milieu conditionné concentré (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01). Suivant le séquençage du MCC parallèlement au facteur semi-pur actif, deux protéines ont été identifiées à la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : l’albumine et la fétuine. Notre projet vise donc à comparer les effets de l’albumine et de la fétuine à ceux du GM-CSF dans l’optique d’une thérapie alternative au GM-CSF en tant qu’adjuvant de chimiothérapie. La présence d’albumine, de fétuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubés 24 heures avec la Mutamycin® induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport à la Mutamycin® (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). L’effet de l’albumine dépend de la voie de la kinase PI3 mais également celle la kinase ERK, alors que celle de la fétuine dépend de la kinase PI3. Similairement l’EPO, l’albumine et la fétuine supporte la différentiation des HSCs en précurseurs érythrocytaires de type BFU-E. Dans un modèle murin de chiomioprotection, l’albumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrôle des leukocytes de la rate (66 ±8 x106c/ml vs 81 ±16 x106c/ml) et du sang (3.6 ±0.4 x106c/ml vs 5.7 ±2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, l’albumine et la fétuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalité et mécansimes d’action. Cependant, vu leur manque de spécificité, l’application thérapeutique en tant qu’adjuvant de chiomiothérapie de l’albumine et la fétuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dégénératives et les évènements ischémiques pourraient s’avérer de bonnes cibles thérapeutiques, principalement pour l’albumine. / Circulating polymorphonuclear neutrophils (PMN) possess a short half-life and are constantly renewed by the bone marrow to ensure the first-line of defense. Therefore, homeostasis must be maintained through a well-regulated process of apoptosis. Survival of PMN can be regulated by several cytokines as well as conditioned media (CM). Although PMN are crucial for protection against microorganisms, activated neutrophils can lead to severe tissue damage in diseases characterized by chronic inflammation. Indeed, in rheumatoid arthritis (RA), activated PMN contribute to tissue damage by releasing a number of destructive agents. On the other hand, chronic activation of PMN could prevent opportunistic infections present in immunosuppressed patients. This project addresses the isolation and mechanism of action of synovial liquid components on the survival of neutrophils based on previous work (Lagraoui, 1999). Following tangential flow filtration (MW cut off: 30 and 50 kDa), concentrated CM enhanced the viability (75%) of 24-hour cultured human neutrophils isolated from peripheral blood of healthy volunteers (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01) as seen in Lagraoui (1999) previous work. N-terminal protein sequence analysis of the concentrated CM and fractionated conditioned media from previous work revealed 2 known proteins contained in both analysis: albumin, and fetuin. In view of the importance of neutrophiles in immune defense, we compared the benefits of albumin and fetuin to those of granulocytes macrophages-colony stimulating factor (GM-CSF), a growth factor used as an adjunct to cancer chemotherapy. Albumin and fetuin were tested by the AnnexinV-FITC/7-AAD method and displayed an inhibition of neutrophil apoptosis of two to three folds relative to control value. Moreover, albumin (A : 200μM) and fetuin (F : 200μM) rescue human PMN from mutamycin-induced apoptosis, comparable to GM-CSF (GM : 10ng/ml); (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). Albumin also induces cellular signaling pathways activation via PI3-K and ERK, whereas fetuin acts through PI3-K pathway only. They induce the differentiation of HSCs into erythrocytes progenitors BFU-E. In immunosuppressed mice, albumin protects white blood cells depletion induced by cytotoxic agent from spleen and blood. Considering all the benefits of albumin and fetuin, their targeting as an adjunct to cancer chemotherapy could be disappointing in view of their lack of specificity. On the other hand, their multiple benefits could have a major impact on neurodegenerative disorders and ischemic events.

Les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) représentent une arme primordiale dans la défense contre divers agents pathogènes; notamment les bactéries, les champignons, les cellules tumorales de même que les cellules infectées par des virus. Cependant, certaines pathologies reliées à l’inflammation chronique soulèvent l’implication des neutrophiles notamment dans l’arthrite rhumatoïde. La réponse inflammatoire persistante générée par l’activation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite à la sécrétion non contrôlée de leurs produits cytotoxiques. Même si l’activation chronique des neutrophiles est néfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait s’avérer un bon outil en cas de neutropénie, comme c’est souvent le cas les patients ayant reçu des traitements de chimiothérapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise à identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mécanisme d’action impliqué dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isolés par Lagraoui (1999), le milieu conditionné concentré (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01). Suivant le séquençage du MCC parallèlement au facteur semi-pur actif, deux protéines ont été identifiées à la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : l’albumine et la fétuine. Notre projet vise donc à comparer les effets de l’albumine et de la fétuine à ceux du GM-CSF dans l’optique d’une thérapie alternative au GM-CSF en tant qu’adjuvant de chimiothérapie. La présence d’albumine, de fétuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubés 24 heures avec la Mutamycin® induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport à la Mutamycin® (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). L’effet de l’albumine dépend de la voie de la kinase PI3 mais également celle la kinase ERK, alors que celle de la fétuine dépend de la kinase PI3. Similairement l’EPO, l’albumine et la fétuine supporte la différentiation des HSCs en précurseurs érythrocytaires de type BFU-E. Dans un modèle murin de chiomioprotection, l’albumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrôle des leukocytes de la rate (66 ±8 x106c/ml vs 81 ±16 x106c/ml) et du sang (3.6 ±0.4 x106c/ml vs 5.7 ±2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, l’albumine et la fétuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalité et mécansimes d’action. Cependant, vu leur manque de spécificité, l’application thérapeutique en tant qu’adjuvant de chiomiothérapie de l’albumine et la fétuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dégénératives et les évènements ischémiques pourraient s’avérer de bonnes cibles thérapeutiques, principalement pour l’albumine. / Circulating polymorphonuclear neutrophils (PMN) possess a short half-life and are constantly renewed by the bone marrow to ensure the first-line of defense. Therefore, homeostasis must be maintained through a well-regulated process of apoptosis. Survival of PMN can be regulated by several cytokines as well as conditioned media (CM). Although PMN are crucial for protection against microorganisms, activated neutrophils can lead to severe tissue damage in diseases characterized by chronic inflammation. Indeed, in rheumatoid arthritis (RA), activated PMN contribute to tissue damage by releasing a number of destructive agents. On the other hand, chronic activation of PMN could prevent opportunistic infections present in immunosuppressed patients. This project addresses the isolation and mechanism of action of synovial liquid components on the survival of neutrophils based on previous work (Lagraoui, 1999). Following tangential flow filtration (MW cut off: 30 and 50 kDa), concentrated CM enhanced the viability (75%) of 24-hour cultured human neutrophils isolated from peripheral blood of healthy volunteers (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01) as seen in Lagraoui (1999) previous work. N-terminal protein sequence analysis of the concentrated CM and fractionated conditioned media from previous work revealed 2 known proteins contained in both analysis: albumin, and fetuin. In view of the importance of neutrophiles in immune defense, we compared the benefits of albumin and fetuin to those of granulocytes macrophages-colony stimulating factor (GM-CSF), a growth factor used as an adjunct to cancer chemotherapy. Albumin and fetuin were tested by the AnnexinV-FITC/7-AAD method and displayed an inhibition of neutrophil apoptosis of two to three folds relative to control value. Moreover, albumin (A : 200μM) and fetuin (F : 200μM) rescue human PMN from mutamycin-induced apoptosis, comparable to GM-CSF (GM : 10ng/ml); (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). Albumin also induces cellular signaling pathways activation via PI3-K and ERK, whereas fetuin acts through PI3-K pathway only. They induce the differentiation of HSCs into erythrocytes progenitors BFU-E. In immunosuppressed mice, albumin protects white blood cells depletion induced by cytotoxic agent from spleen and blood. Considering all the benefits of albumin and fetuin, their targeting as an adjunct to cancer chemotherapy could be disappointing in view of their lack of specificity. On the other hand, their multiple benefits could have a major impact on neurodegenerative disorders and ischemic events.