Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The feline calicivirus (FCV) and the felid herpesvirus type 1 (FeHV-1) are the main agents of the respiratory tract diseases of felines. Both viruses are distributed worldwide, however its distribution and prevalence in Brazil are not well known. In the present thesis we describe the isolation and one serosurvey of FCV and FeHV-1 in some counties of the Rio Grande do Sul State, Brazil; and the molecular characterization of the capsid protein gene of FCV isolates is also described. In Chapter 1, we describe the epidemiologic survey of FCV and FeHV-1 through investigation of the conjunctival, nasal, oral and oropharyngeal swabs from 302 domestic cats. The viral isolation was performed in Crandell-Reese feline kidney cells and the isolates were submitted to PCR and RT-PCR for confirmation of the presence of the FeHV-1 and FCV, respectively. Fifty five (18.2%) of the 302 cats analyzed were positive for the viral isolation; when tested by PCR, 29 cats (52.7%) were shedding the FCV, 21 (38.2%) shedding FeHV-1, and 5 cats (9.1%) shedding both viruses. In addition, isolates of FCV and FeHV-1 were standardized to be used as control in the PCR and virus neutralization (VN) assays (serological technical used in chapter 3 of the thesis). The SV65/90 (FCV) and the SV534/00 (FeHV-1) isolates were defined as standard viruses for the assays. In Chapter 2, the molecular characterization of 13 FCV isolates is described; ten isolates came from the survey performed in chapter 1, two were deposited in the virology laboratory of the UFSM and one was obtained from a cat with gingivitis-stomatitis syndrome. The ORF2 (open reading frame) region that codifies the major protein of the viral capsid was sequenced, which includes an immunodominant region of the virus. The ORF 2 was analyzed at the nucleotide and amino acid levels and these data was used for phylogenetic studies of the 13 Brazilian isolates of FCV. These isolates were compared to ten reference strains of FCV and to the San Miguel sea lion virus type 1 (SMSV-1) as an outgroup in phylogenetic study. The primers were designed using the complete sequence of FCV-F9. The comparison of the 13 Brazilian isolates with the F9 strain revealed a large molecular diversity among them, concentrated mainly along the linear epitopes of the region. The Chapter 3 describes a serosurvey against FCV and FeHV-1 in serum samples from domestic feline. From the 630 samples tested by the VN assay, 53.6% (338/630) were positive to one or both viruses with a prevalence of 39.2% for neutralizing antibodies against FCV and 30.6% for FeHV-1. The results from the present study demonstrated that the FCV and FeHV-1 are circulating among the feline population examined, and also, the presence of carriers of the viruses among these cats. Besides, the molecular characterization of the FCV evidenced the great genetic variability of the Brazilian isolates when compared to vaccine and reference strains. / O calicivírus felino (feline calicivirus FCV) e o herpesvírus felino tipo 1 (felid herpesvirus type 1 FeHV-1) são os principais agentes das doenças do trato respiratório dos felinos. Ambos os vírus são mundialmente distribuídos, mas no Brasil sua distribuição e prevalência são ainda pouco conhecidas. Na presente tese descrevemos o isolamento e sorologia do FCV e do FeHV-1 em alguns municípios do estado do Rio Grande do Sul (RS), Brasil; e a caracterização molecular do gene da proteína do capsídeo de isolados de FCV. No Capítulo 1, descreve-se o isolamento do FCV e do FeHV-1 por meio da coleta de suabes (conjuntival, nasal, oral e orofaringeano) de 302 gatos domésticos. O material coletado foi inoculado em cultivo celular de origem felina (CRFK) e submetidos a PCR e RT-PCR para confirmação em FeHV-1 e FCV, respectivamente. Dos 302 gatos analisados, 55 (18,2%) foram positivos no isolamento; e quando testados por PCR, 29 dos 55 gatos (52,7%) excretavam o FCV, 21 (38,2%) excretavam o FeHV-1 e 5 gatos (9,1%) apresentavam ambos os vírus. Além dessa descrição, realizou-se a padronização de um isolado de FCV e de FeHV-1, para serem utilizados como controle nas técnicas de PCR e na vírus neutralização [VN] (técnica sorológica utilizada no capítulo 3 da tese). O SV65/90 (FCV) e o SV534/00 (FeHV-1) foram os isolados definidos como vírus-padrão. No Capítulo 2, incluímos o estudo sobre a análise molecular de 13 isolados de FCV; dez isolados foram obtidos a partir do material descrito no capítulo 1, dois estavam armazenados no laboratório de virologia da UFSM e um foi obtido de um gato acometido pela síndrome gengivo-estomatite. A região analisada foi o gene da proteína do capsídeo, codificado pela ORF2 (open reading frame), na qual se localizam as regiões imunodominantes do FCV. A ORF2 foi analisada em nível de nucleotídeos e aminoácidos; e uma análise filogenética dos 13 isolados brasileiros de FCV, incluindo dez cepas de referência e o vírus dos leões marinhos de San Miguel tipo 1 (San Miguel sea lion virus type 1 SMSV-1) como um outgroup, foi também realizada. Os primers foram desenhados com base na sequência completa do genoma da cepa de referência a FCV-F9. Quando os 13 isolados brasileiros de FCV foram comparados a cepa F9, detectou-se grande diversidade molecular nas regiões variáveis do gene e nos epitopos lineares mapeados. O Capítulo 3 contem um estudo sorológico contra FCV e FeHV-1 em amostras de soro de felinos domésticos. Das 630 amostras testadas pela VN, 53,6% (338/630) foram positivas para um ou ambos os vírus; sendo a prevalência de anticorpos neutralizantes contra o FCV de 39,2% e do FeHV-1 de 30,6%. Os resultados aqui apresentados demonstram a circulação do FCV e do FeHV-1 na população de gatos domésticos analisados, assim como, a presença de gatos portadores para ambos os vírus. Além disso, a caracterização molecular do FCV demonstrou a grande variabilidade genética dos isolados brasileiros em comparação às cepas vacinais e às de referência.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The essential oils obtained from plants used as condiments are an important source of compounds with pharmacologic activity. In the present study, the antiviral activity of the essential oil of Ocimum basilicum L. (basil) and from the monoterpens camphor, 1,8-cineol and timol was tested against the bovine viral diarrhea virus (BVDV), while the essential oil of Rosmarinus officinalis L. (rosemary), Lippia graveolens HBK. (mexican oregano) and Thymus vulgaris L. (thyme) were tested against the feline calicivirus (FCV). The colorimetric test MTT ([3- (4.5-dimetilazol-2-il)-2.5-brometo of difeniltetrazolium]) was applied for the measurement of cytotoxicity, and the antiviral tests were performed by the plaque reduction assay. Three different protocols were applied: a) the virus was incubated with the essential oils or compounds before the inoculation into cells (virucidal assay); b) the cells were treated with the essential oils or compounds prior to virus inoculation; or, c) essential oils and compounds were added to the cells after virus inoculation and maintained for 72 hours. The results were expressed as CC50 (cytotoxic concentration to 50% of the cell culture), IC50 (inhibitory concentration to 50%) and SI (selectivity index = CC50/IC50). The best results were evidenced for the monoterpens camphor (SI=13.88) and the 1,8-cineol (IS=9.05) against BVDV. These results were obtained from the virucidal protocol and these compounds showed also the lower toxicicity towards the bovine kidney cells culture (Madin-Darby bovine kidney cells = MDBK) (CC50 = 4420.12 μg/mL and 2996.10 μg/mL, respectively). Regarding to the tests with FCV, the thyme essential oil showed the best results with SI=8.57 for c treatment. The basil essential oil had a moderate action in the a protocol (SI=6.54) and also for the c protocol (SI=6.86). In addition, the basil essential oil exhibited low levels of cytotoxicity towards the Crandel-Reese feline kidney cells (CRFK), with CC50 of 1300.21 μg/mL. In conclusion, the essential oils and monoterpens examined showed different levels of inhibitory activity on diverse moments of the viral infection. The antiviral activity demonstrated by the essential oils and compounds on BVDV and FCV may suggest a possible action on the hepatitis C virus (HCV) and norovirus (NoVs), respectively; since BVDV ande FCV shows several structural and replicative similarities to HCV and NoVs. / Óleos essenciais obtidos de plantas utilizadas como condimentos constituem uma fonte de compostos com promissoras atividades farmacológicas. No presente estudo, a atividade antiviral do óleo essencial de Ocimum basilicum L. (manjericão) e dos monoterpenos cânfora, 1,8-cineol e timol foi testada frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV), enquanto que os óleos essenciais de Rosmarinus officinalis L. (alecrim), Lippia graveolens HBK. (orégano mexicano) e Thymus vulgaris L. (tomilho) foram testados frente ao calicivírus felino (FCV). O teste colorimétrico com MTT ([3- (4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazolium]) foi aplicado para a detecção de citotoxicidade, já os testes de atividade antiviral foram realizados através da metodologia de ensaio de redução de placas. Para este, três diferentes protocolos foram aplicados: o vírus foi incubado com os óleos essenciais ou compostos antes da infecção viral (ensaio virucida); as células foram pré tratadas com os óleos essenciais ou compostos antes da inoculação do vírus; ou as células infectadas foram incubadas com esses após as 2 horas de adsorção viral. Os resultados foram expressos como CC50 (concentração citotóxica para 50% do cultivo celular), CI50 (concentração inibitória para 50%) e IS (índice de seletividade = CC50/CI50). Os resultados de atividade frente ao BVDV evidenciaram, no geral, uma boa ação antiviral exercida pelos monoterpenos, sendo que a cânfora (IS=13,88) seguida do 1,8-cineol (IS=9,05) foram os compostos que apresentaram os mais elevados índices de seletividade obtidos no ensaio virucida, bem como a menor toxicidade frente às células de linhagem de rim bovino (Madin-Darby bovine kidney cells = MDBK) (CC50 = 4420,12 μg/ml e 2996,10 μg/ml, respectivamente). Em relação aos testes com FCV, o óleo essencial de tomilho mostrou os melhores resultados, com índice de 8,57 para o tratamento no qual os óleos essenciais foram adicionados às células antes da inoculação viral. Já o óleo essencial de alecrim, além de apresentar uma moderada ação nos ensaios virucida (IS=6,54) e de pós-tratamento (IS=6,86), exibiu baixos níveis de toxicidade em relação às células de linhagem de rim felino (Crandell-Reese feline kidney = CRFK), com CC50 de 1300,21 μg/ml. Dessa forma, conclui-se que os óleos essenciais e monoterpenos em estudo apresentaram algum nível de atividade inibitória em diferentes momentos da infecção viral.