O crânio é composto de estruturas que interagem entre si formando um sistema complexo, como os ossos da caixa craniana unidos por tecido fibroso (sutura), o qual exerce função importante durante o desenvolvimento do indivíduo até a idade adulta. Ao fenômeno de fusão prematura das suturas dá-se o nome de craniossinostose que, em 32% dos casos com diagnóstico molecular, são causados por mutações no gene FGFR2. A via de sinalização por FGF já foi implicada tanto em processos biológicos mitogênicos, regulatórios, morfológicos quanto em processos endócrinos. A síndrome de Apert representa 4% de todos os casos de craniossinostose e as duas mutações mais frequentes encontradas nestes pacientes, S252W (64%) e P253R (26%), aumentam a afinidade de ligação dos receptores das isoformas epiteliais e mesenquimais do receptor por quase todos os FGFs e levam à perda de especificidade aos ligantes. Entretanto, a literatura acerca das características celulares aberrantes causadas por mutações desta síndrome é controversa. Atualmente, muitos estudos têm apontado a importância do periósteo, tecido fibroso rico em células que recobre os ossos, na regeneração óssea, não só através de sinalização parácrina, mas também como fonte de células osteoprogenitoras. Neste contexto, há poucos trabalhos na literatura. Nossa hipótese principal é verificar se o periósteo contribui para a fusão, prematura e pós-cirúrgica, das suturas coronais na Síndrome de Apert. Neste caso, a nossa expectativa é as células que compõem este tecido, como por exemplo, fibroblastos e células-tronco mesenquimais, tenham funções celulares como proliferação, migração e diferenciação anômalas em resposta a vias de sinalização intracelulares alteradas. Assim sendo, nossos objetivos foram verificar se a mutação S252W tem um efeito funcional/celular semelhante em duas diferentes potenciais células osteoprogenitoras: fibroblasto e células-tronco mesenquimais; e verificar se diferentes ligantes a FGFR2, os FGFs, atuam diferentemente nas funções destas mesmas células com mutação S252W. De forma geral, nossos resultados revelaram as diferenças funcionais entre fibroblastos e células-tronco mesenquimais (MSCs) provenientes de pacientes com síndrome de Apert, sendo que as funções dos fibroblastos mutados estão mais comprometidas do que as funções das MSCs. Além disso, os fibroblastos S252W têm efeito positivo sobre as MSCs, selvagem ou mutadas, enquanto que o oposto não ocorre. A inibição da fosforilação da JNK anula o efeito da mutação no processo de diferenciação osteogênica atípica de fibroblastos. Também mostramos que FGF2, FGF10 e FGF19 têm diferentes influências sobre o fenótipo de células com a mutação, que também difere entre os tipos celulares. O FGF19 é o fator que mais interfere no processo de ossificação nas células S252W. Nossa análise de perfil de expressão gênica mostrou que os FGFs modulam diferentes vias de sinalização em fibroblastos de pacientes com síndrome de Apert: o FGF2 está ligado a genes do sistema nervoso central, corroborado pelo estudo no modelo animal; o FGF10, a resposta imune e o FGF19 à ossificação. O estudo de células com mutação atípica mostra que a expressão ectópica da isoforma epitelial de FGFR2 está associada ao fenótipo clínico da Síndrome de Apert e parece ser também responsável pelo fenótipo atípico associado à transição epitélio-mesenquimal. Estes resultados nos possibilitaram inferir que o periósteo contribui para o processo de reossificação das suturas na Síndrome de Apert, e que tanto fibroblastos como células-tronco mesenquimais podem estar envolvidos neste processo. / The skull is composed of structures that interact with each other forming a complex system, sucha as the bones of the skull that are united by fibrous tissue (suture), which plays important role during the development of the individual until adulthood. The phenomenon of premature fusion of sutures is named as craniosynostosis, which are caused by mutations in the FGFR2 gene in 32% of the cases with molecular diagnosis. The FGF signaling pathway has been implicated in both mitogenic biological processes, regulatory, morphological and endocrine processes. Apert syndrome accounts for 4% of all cases of craniosynostosis and the two most frequent mutations found in these patients, S252W (64%) and P253R (26%), increase the binding affinity in mesenchymal and epithelial isoforms of the receptor for nearly all FGFs and lead to loss of ligand specificity. However, literature concerning the aberrant cellular characteristics caused by Apert syndrome mutations is controversial. Currently, many studies have highlighted the importance of the periosteum (a fibrous tissue rich in cells that covers the bones) in bone regeneration, not only through paracrine signaling, but also as a source of osteoprogenitor cells. In this regard, there are few studies in literature. Our main hypothesis is to verify whether the periosteum contributes to premature and post-surgical fusion of the coronal sutures in Apert syndrome. In this case, we expect that the cells that compose this tissue, such as fibroblasts and mesenchymal stem have abnormal cell functions such as proliferation, migration and differentiation in response to altered intracellular signaling pathways. Our objectives were to verify if the S252W mutation has a similar functional/cellular effect in two different potential osteoprogenitor cells: fibroblasts and mesenchymal stem cells; and to verify whether different ligands to FGFR2, the FGFs, act differently in these cells with S252W mutation. Overall, our results reveal functional differences between fibroblasts and mesenchymal stem cells (MSCs) from patients with Apert syndrome, and that these functions are more impaired in the mutant fibroblasts. Moreover, the S252W fibroblasts have positive effect on the osteogenic differentiation of MSCs (wild-type and mutant) whereas the opposite does not occur. Inhibition of JNK phosphorylation nullifies the effect of atypical osteogenic differentiation of mutant fibroblasts. We also show that FGF2, FGF10 and FGF19 have different influences on the phenotype of mutant cells, which also differs between cell types. The FGF19 is the main factor that interferes with the process of ossification of S252W cells. Our analysis of gene expression profile showed that FGFs modulate different signaling pathways in fibroblasts from Apert syndrome patients: while FGF2 gene is linked to the central nervous system, supported by studies in animal model, FGF10 is associated to immune response and FGF19, to ossification. The study of cells with atypical mutation shows that the ectopic expression of the epithelial isoform of FGFR2 generates the clinical phenotype of Apert syndrome, but also leads to an atypical phenotype associated with epithelial-mesenchymal transition. These results enabled us to infer that the periosteum contributes to the process of suture reossification in Apert syndrome, and that both fibroblast and mesenchymal stem cells may be involved in this process.

O crânio é composto de estruturas que interagem entre si formando um sistema complexo, como os ossos da caixa craniana unidos por tecido fibroso (sutura), o qual exerce função importante durante o desenvolvimento do indivíduo até a idade adulta. Ao fenômeno de fusão prematura das suturas dá-se o nome de craniossinostose que, em 32% dos casos com diagnóstico molecular, são causados por mutações no gene FGFR2. A via de sinalização por FGF já foi implicada tanto em processos biológicos mitogênicos, regulatórios, morfológicos quanto em processos endócrinos. A síndrome de Apert representa 4% de todos os casos de craniossinostose e as duas mutações mais frequentes encontradas nestes pacientes, S252W (64%) e P253R (26%), aumentam a afinidade de ligação dos receptores das isoformas epiteliais e mesenquimais do receptor por quase todos os FGFs e levam à perda de especificidade aos ligantes. Entretanto, a literatura acerca das características celulares aberrantes causadas por mutações desta síndrome é controversa. Atualmente, muitos estudos têm apontado a importância do periósteo, tecido fibroso rico em células que recobre os ossos, na regeneração óssea, não só através de sinalização parácrina, mas também como fonte de células osteoprogenitoras. Neste contexto, há poucos trabalhos na literatura. Nossa hipótese principal é verificar se o periósteo contribui para a fusão, prematura e pós-cirúrgica, das suturas coronais na Síndrome de Apert. Neste caso, a nossa expectativa é as células que compõem este tecido, como por exemplo, fibroblastos e células-tronco mesenquimais, tenham funções celulares como proliferação, migração e diferenciação anômalas em resposta a vias de sinalização intracelulares alteradas. Assim sendo, nossos objetivos foram verificar se a mutação S252W tem um efeito funcional/celular semelhante em duas diferentes potenciais células osteoprogenitoras: fibroblasto e células-tronco mesenquimais; e verificar se diferentes ligantes a FGFR2, os FGFs, atuam diferentemente nas funções destas mesmas células com mutação S252W. De forma geral, nossos resultados revelaram as diferenças funcionais entre fibroblastos e células-tronco mesenquimais (MSCs) provenientes de pacientes com síndrome de Apert, sendo que as funções dos fibroblastos mutados estão mais comprometidas do que as funções das MSCs. Além disso, os fibroblastos S252W têm efeito positivo sobre as MSCs, selvagem ou mutadas, enquanto que o oposto não ocorre. A inibição da fosforilação da JNK anula o efeito da mutação no processo de diferenciação osteogênica atípica de fibroblastos. Também mostramos que FGF2, FGF10 e FGF19 têm diferentes influências sobre o fenótipo de células com a mutação, que também difere entre os tipos celulares. O FGF19 é o fator que mais interfere no processo de ossificação nas células S252W. Nossa análise de perfil de expressão gênica mostrou que os FGFs modulam diferentes vias de sinalização em fibroblastos de pacientes com síndrome de Apert: o FGF2 está ligado a genes do sistema nervoso central, corroborado pelo estudo no modelo animal; o FGF10, a resposta imune e o FGF19 à ossificação. O estudo de células com mutação atípica mostra que a expressão ectópica da isoforma epitelial de FGFR2 está associada ao fenótipo clínico da Síndrome de Apert e parece ser também responsável pelo fenótipo atípico associado à transição epitélio-mesenquimal. Estes resultados nos possibilitaram inferir que o periósteo contribui para o processo de reossificação das suturas na Síndrome de Apert, e que tanto fibroblastos como células-tronco mesenquimais podem estar envolvidos neste processo. / The skull is composed of structures that interact with each other forming a complex system, sucha as the bones of the skull that are united by fibrous tissue (suture), which plays important role during the development of the individual until adulthood. The phenomenon of premature fusion of sutures is named as craniosynostosis, which are caused by mutations in the FGFR2 gene in 32% of the cases with molecular diagnosis. The FGF signaling pathway has been implicated in both mitogenic biological processes, regulatory, morphological and endocrine processes. Apert syndrome accounts for 4% of all cases of craniosynostosis and the two most frequent mutations found in these patients, S252W (64%) and P253R (26%), increase the binding affinity in mesenchymal and epithelial isoforms of the receptor for nearly all FGFs and lead to loss of ligand specificity. However, literature concerning the aberrant cellular characteristics caused by Apert syndrome mutations is controversial. Currently, many studies have highlighted the importance of the periosteum (a fibrous tissue rich in cells that covers the bones) in bone regeneration, not only through paracrine signaling, but also as a source of osteoprogenitor cells. In this regard, there are few studies in literature. Our main hypothesis is to verify whether the periosteum contributes to premature and post-surgical fusion of the coronal sutures in Apert syndrome. In this case, we expect that the cells that compose this tissue, such as fibroblasts and mesenchymal stem have abnormal cell functions such as proliferation, migration and differentiation in response to altered intracellular signaling pathways. Our objectives were to verify if the S252W mutation has a similar functional/cellular effect in two different potential osteoprogenitor cells: fibroblasts and mesenchymal stem cells; and to verify whether different ligands to FGFR2, the FGFs, act differently in these cells with S252W mutation. Overall, our results reveal functional differences between fibroblasts and mesenchymal stem cells (MSCs) from patients with Apert syndrome, and that these functions are more impaired in the mutant fibroblasts. Moreover, the S252W fibroblasts have positive effect on the osteogenic differentiation of MSCs (wild-type and mutant) whereas the opposite does not occur. Inhibition of JNK phosphorylation nullifies the effect of atypical osteogenic differentiation of mutant fibroblasts. We also show that FGF2, FGF10 and FGF19 have different influences on the phenotype of mutant cells, which also differs between cell types. The FGF19 is the main factor that interferes with the process of ossification of S252W cells. Our analysis of gene expression profile showed that FGFs modulate different signaling pathways in fibroblasts from Apert syndrome patients: while FGF2 gene is linked to the central nervous system, supported by studies in animal model, FGF10 is associated to immune response and FGF19, to ossification. The study of cells with atypical mutation shows that the ectopic expression of the epithelial isoform of FGFR2 generates the clinical phenotype of Apert syndrome, but also leads to an atypical phenotype associated with epithelial-mesenchymal transition. These results enabled us to infer that the periosteum contributes to the process of suture reossification in Apert syndrome, and that both fibroblast and mesenchymal stem cells may be involved in this process.

Os tumores de glândula mamária, à semelhança do que ocorre na espécie humana, são as neoplasias que mais comumente acometem as fêmeas caninas, sendo os cães apontados como importante modelo de estudo desta doença. Com cerca da metade dos tumores mamários caninos considerados malignos, um problema crucial no manejo deste tipo de neoplasia é a busca por fatores prognósticos que auxiliem na escolha do tratamento adjuvante e na predição do curso clínico da doença, uma vez que neoplasias de baixo grau de malignidade , podem apresentar curso agressivo, contrariando os indicadores prognósticos clínicos usuais. Este trabalho teve por objetivo estudar alterações genéticas e epigenéticas em neoplasias mamárias de fêmeas caninas, buscando também avaliar seu valor prognóstico de sobrevida. Para tanto, neoplasias mamárias espontâneas de cães foram colhidas e classificadas de acordo com o tipo e grau histológico, além do imunofenótipo, obtido da marcação de ERα, PR, HER2 e Ki67. O padrão de metilação global do DNA e o perfil de expressão gênica dos marcadores tumorais BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 foram correlacionados com aqueles parâmetros. Para o estudo do padrão de metilação global do DNA foram utilizados 109 fragmentos de tecido mamário neoplásico, conservados em parafina, oriundos do arquivo do Hospital Veterinário da Universidade Metropolitana de Santos. Para imunofenotipagem e estudo imunoistoquímico da expressão de BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 foram colhidos em estudo prospectivo 78 fragmentos de tecido mamário neoplásico e não neoplásico, provenientes de 70 fêmeas da espécie canina com diagnóstico clínico de neoplasia mamária e que foram submetidas a tratamento cirúrgico. O material assim obtido foi conservado em nitrogênio líquido, para os estudos de expressão de RNAm por qPCR e em blocos de parafina, para os estudos histopatológicos e imunoistoquímicos. O estadiamento clínico mostrou-se fator prognóstico importante, assim como diâmetro tumoral, grau histológico do tumor, uso de quimioterapia adjuvante e recorrência. Os estudos epigenéticos demonstraram que o padrão de metilação do DNA independe do tipo histológico do tumor e de seu grau histológico, guardando correlação apenas com o grau de malignidade dos tumores; no entanto, este marcador demonstrou-se interessante previsor de recidiva tumoral, com diferença estatística significativa entre os animais que apresentaram recidiva e aqueles que não a apresentaram. Nos estudos de imunofenotipagem, foi possível observar por meio da técnica de imunoistoquímica que, tanto a expressão de ERα quanto de PR nas fêmeas caninas guardam, à semelhança da mulher, relação com o estado reprodutivo e hormonal das pacientes. Também foi observado que os marcadores ERα, PR e HER2 em sua maioria se correlacionam com o tipo e grau histológico quando transformados em variável categórica; porém, não apresentam valor prognóstico de sobrevida. No entanto, Ki67 demonstrou forte correlação com tipo e grau histológico dos tumores, com a presença de linfonodos positivos e metástase pulmonar, apresentando-se como fator prognóstico independente nas neoplasias mamárias caninas. Na busca por candidatos a marcadores tumorais, observou-se que, em sua maioria, os marcadores BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 não apresentaram correlação com tipo e grau histológico do tumor; porém, FGFR2 mostrou-se fator prognóstico de sobrevida para as fêmeas caninas portadoras de neoplasia. A finalidade de estudos integrados que correlacionem aspectos clínicos, morfológicos e moleculares das neoplasias é avançar em seu conhecimento e obter novas perspectivas para o sucesso no tratamento destas doenças. Esperamos que, com este trabalho, tenhamos contribuído para atingir estes objetivos. / Tumors of the mammary gland, similar to what occurs in the human species, are the most common cancers that affect the female dogs, being this species pointed out as an important model for the study of this disease. With about half of canine mammary tumors considered malignant, a crucial issue in the management of this type of cancer is the search for prognostic factors that assist in the choice of adjuvant therapy and in predicting the clinical course of the disease, since low-grade neoplasms malignancy can present aggressive course, contrary to the usual clinical prognostic indicators. This work aimed to study genetic and epigenetic changes in mammary tumors in female dogs, seeking also to evaluate its prognostic value for survival. For this purpose , spontaneous mammary tumors of dogs were collected and classified according to the histological type and grade, plus the immunophenotype obtained by evaluating ERα, PR , HER2 and Ki67 . The pattern of global DNA methylation and gene expression of tumor markers BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 profile were correlated with those parameters . Pattern of DNA global methylation was studied in 109 formalin-fixed paraffin-embedded neoplastic mammary tissue, obtained from the archives of the Veterinary School Hospital of the Universidade Metropolitana de Santos. Immunophenotyping and immunohistochemical study of the expression of BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 were performed in a prospective study with 78 fragments of neoplastic and non-neoplastic mammary tissue from 70 female dogs, with clinical diagnosis of mammary cancer and that underwent surgical treatment. The material was stored in liquid nitrogen for studies of mRNA expression by qPCR and in paraffin for histopathological and immunohistochemical studies. Clinical staging was an important prognostic factor, as well as tumor size, histological and tumor grade, use of adjuvant chemotherapy and recurrence. Epigenetic studies have shown that the pattern of DNA methylation is independent of the histological and tumor grade, keeping, however, correlation with the degree of malignancy of the tumors and interesting predictor value for tumor recurrence. Immunophenotyping studies showed that both ERα and PR expression, like in women, presented correlation with reproductive and hormonal status of the patients. It was also observed that ERα, PR and HER2 tumor markers mostly correlate with histological type and grade when considered a categorical variable, but they have not shown any prognostic survival value. However Ki67 showed strong correlation with histological type and grade of the tumors, the presence of positive lymph nodes and lung metastasis, and can be considered an independent prognostic factor in canine mammary tumors. In search for candidates for tumor markers, we found that, mostly BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 markers showed no correlation with histological type and grade of the tumor, although FGFR2 showed prognostic survival value for female dogs affected by breast cancer. The purpose of integrated studies correlating clinical, morphological and molecular aspects of cancer is to gain further knowledge and to glimpse new perspectives for success in treating these diseases. We hope that with this work, we have contributed to achieve these goals.

Os tumores de glândula mamária, à semelhança do que ocorre na espécie humana, são as neoplasias que mais comumente acometem as fêmeas caninas, sendo os cães apontados como importante modelo de estudo desta doença. Com cerca da metade dos tumores mamários caninos considerados malignos, um problema crucial no manejo deste tipo de neoplasia é a busca por fatores prognósticos que auxiliem na escolha do tratamento adjuvante e na predição do curso clínico da doença, uma vez que neoplasias de baixo grau de malignidade , podem apresentar curso agressivo, contrariando os indicadores prognósticos clínicos usuais. Este trabalho teve por objetivo estudar alterações genéticas e epigenéticas em neoplasias mamárias de fêmeas caninas, buscando também avaliar seu valor prognóstico de sobrevida. Para tanto, neoplasias mamárias espontâneas de cães foram colhidas e classificadas de acordo com o tipo e grau histológico, além do imunofenótipo, obtido da marcação de ERα, PR, HER2 e Ki67. O padrão de metilação global do DNA e o perfil de expressão gênica dos marcadores tumorais BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 foram correlacionados com aqueles parâmetros. Para o estudo do padrão de metilação global do DNA foram utilizados 109 fragmentos de tecido mamário neoplásico, conservados em parafina, oriundos do arquivo do Hospital Veterinário da Universidade Metropolitana de Santos. Para imunofenotipagem e estudo imunoistoquímico da expressão de BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 foram colhidos em estudo prospectivo 78 fragmentos de tecido mamário neoplásico e não neoplásico, provenientes de 70 fêmeas da espécie canina com diagnóstico clínico de neoplasia mamária e que foram submetidas a tratamento cirúrgico. O material assim obtido foi conservado em nitrogênio líquido, para os estudos de expressão de RNAm por qPCR e em blocos de parafina, para os estudos histopatológicos e imunoistoquímicos. O estadiamento clínico mostrou-se fator prognóstico importante, assim como diâmetro tumoral, grau histológico do tumor, uso de quimioterapia adjuvante e recorrência. Os estudos epigenéticos demonstraram que o padrão de metilação do DNA independe do tipo histológico do tumor e de seu grau histológico, guardando correlação apenas com o grau de malignidade dos tumores; no entanto, este marcador demonstrou-se interessante previsor de recidiva tumoral, com diferença estatística significativa entre os animais que apresentaram recidiva e aqueles que não a apresentaram. Nos estudos de imunofenotipagem, foi possível observar por meio da técnica de imunoistoquímica que, tanto a expressão de ERα quanto de PR nas fêmeas caninas guardam, à semelhança da mulher, relação com o estado reprodutivo e hormonal das pacientes. Também foi observado que os marcadores ERα, PR e HER2 em sua maioria se correlacionam com o tipo e grau histológico quando transformados em variável categórica; porém, não apresentam valor prognóstico de sobrevida. No entanto, Ki67 demonstrou forte correlação com tipo e grau histológico dos tumores, com a presença de linfonodos positivos e metástase pulmonar, apresentando-se como fator prognóstico independente nas neoplasias mamárias caninas. Na busca por candidatos a marcadores tumorais, observou-se que, em sua maioria, os marcadores BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 não apresentaram correlação com tipo e grau histológico do tumor; porém, FGFR2 mostrou-se fator prognóstico de sobrevida para as fêmeas caninas portadoras de neoplasia. A finalidade de estudos integrados que correlacionem aspectos clínicos, morfológicos e moleculares das neoplasias é avançar em seu conhecimento e obter novas perspectivas para o sucesso no tratamento destas doenças. Esperamos que, com este trabalho, tenhamos contribuído para atingir estes objetivos. / Tumors of the mammary gland, similar to what occurs in the human species, are the most common cancers that affect the female dogs, being this species pointed out as an important model for the study of this disease. With about half of canine mammary tumors considered malignant, a crucial issue in the management of this type of cancer is the search for prognostic factors that assist in the choice of adjuvant therapy and in predicting the clinical course of the disease, since low-grade neoplasms malignancy can present aggressive course, contrary to the usual clinical prognostic indicators. This work aimed to study genetic and epigenetic changes in mammary tumors in female dogs, seeking also to evaluate its prognostic value for survival. For this purpose , spontaneous mammary tumors of dogs were collected and classified according to the histological type and grade, plus the immunophenotype obtained by evaluating ERα, PR , HER2 and Ki67 . The pattern of global DNA methylation and gene expression of tumor markers BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 profile were correlated with those parameters . Pattern of DNA global methylation was studied in 109 formalin-fixed paraffin-embedded neoplastic mammary tissue, obtained from the archives of the Veterinary School Hospital of the Universidade Metropolitana de Santos. Immunophenotyping and immunohistochemical study of the expression of BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 were performed in a prospective study with 78 fragments of neoplastic and non-neoplastic mammary tissue from 70 female dogs, with clinical diagnosis of mammary cancer and that underwent surgical treatment. The material was stored in liquid nitrogen for studies of mRNA expression by qPCR and in paraffin for histopathological and immunohistochemical studies. Clinical staging was an important prognostic factor, as well as tumor size, histological and tumor grade, use of adjuvant chemotherapy and recurrence. Epigenetic studies have shown that the pattern of DNA methylation is independent of the histological and tumor grade, keeping, however, correlation with the degree of malignancy of the tumors and interesting predictor value for tumor recurrence. Immunophenotyping studies showed that both ERα and PR expression, like in women, presented correlation with reproductive and hormonal status of the patients. It was also observed that ERα, PR and HER2 tumor markers mostly correlate with histological type and grade when considered a categorical variable, but they have not shown any prognostic survival value. However Ki67 showed strong correlation with histological type and grade of the tumors, the presence of positive lymph nodes and lung metastasis, and can be considered an independent prognostic factor in canine mammary tumors. In search for candidates for tumor markers, we found that, mostly BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 markers showed no correlation with histological type and grade of the tumor, although FGFR2 showed prognostic survival value for female dogs affected by breast cancer. The purpose of integrated studies correlating clinical, morphological and molecular aspects of cancer is to gain further knowledge and to glimpse new perspectives for success in treating these diseases. We hope that with this work, we have contributed to achieve these goals.

Mutações do tipo ganho de função em FGFR2 causam a síndrome de Apert, uma doença rara caracterizada por craniossinostose e defeitos ósseos nos membros devidos a anormalidades na diferenciação e remodelamento ósseos. Apesar do periósteo ser uma importante fonte de células durante o remodelamento ósseo, seu papel nas craniossinostoses ainda é pouco conhecido. A S. de Apert é causada por mutações (p.S252W ou p.P253R) que levam a perda de especificidade de FGFR2 por seus ligantes e causam a ativação exacerbada do mesmo. Sabe-se que FGFR2 ativa vias de sinalização intracelulares como MEK/ERK, PI3-K e PLC. Nossa hipótese é que as células tronco mesenquimais (MSCs) e fibroblastos de pacientes com S. de Apert tem fenótipos celulares e vias de sinalização alterados que contribuem para o fechamento recorrente das suturas coronais. MSCs e fibroblastos foram obtidos do periósteo de pacientes portadores da S. de Apert (S252W) e indivíduos controles (WT). Nós analisamos a proliferação, migração e diferenciação osteogênica dessas células. A mutação S252W teve efeitos opostos em tipos celulares diferentes: MSCs S252W proliferaram menos que as S252W controle, enquanto fibroblastos S252W proliferaram mais que fibroblastos controle, além de terem aumento da migração. A presença da mutação S252W aumentou a diferenciação osteogênica in vitro e in vivo em ambos os tipos celulares estudados. Esse aumento de diferenciação osteogênica foi revertido pela inibição de JNK. Nós demonstramos que fibroblastos S252W podem induzir a diferenciação osteogênica em MSCs de periósteo, porém não em MSCs de outras fontes. Trabalhos anteriores mostraram que o gene da fosfatase DUSP2 está mais expresso em fibroblastos do periósteo de pacientes portadores da S. de Apert do que em controles. DUSP2 é capaz de desfosforilar membros das MAPKs, dentre estes p-JNK. Nesse trabalho mostramos que a ativação de FGFR2 regula os níveis proteicos de DUSP2 tanto em pacientes quanto em controles, porém por vias diferentes em cada caso, e que DUSP2 está regulando negativamente a fosforilação de JNK.Nós propomos que células do periósteo tem um papel mais importante no fechamento precoce das suturas cranianas do que se imaginava anteriormente e que moléculas da via JNK são fortes candidatas para o tratamento de pacientes da S. de Apert. / Apert Syndrome is cause by gain of Function mutations in FGFR2, a rare condition characterized by craniosynostosis and bone limb defects due to abnormalities in osteogenic differentiation and cone remodeling. Even though the periosteum acts as an important cell source during bone remodeling, its role in craniosynostosis is yet unknown. Apert syndrome is caused by one of two mutations (p.S252W or p.P253R) leading to loss of specificity of FGFR2 by its ligands leading to increased activation of the receptor. It is known that FGFR2 activates the MEK/ERK, PI3-K and PLC signaling pathways. Our hypothesis is that Apert syndrome patients\'\' Mesenchimal Stem Cells (MSCs) and fibroblasts have altered cellular phenotye and signaling pathways which may contribute to the premature closure of the coronal sutures. MSCs and fibroblasts were obtained from the periosteum of Apert syndrome patients bearing the p.S252W mutation and from wild-type (WT) individuals. The p.S252W mutation had opposite effects on different cell types: MSCs p.S252W proliferated less than WT, while p.S252W fibroblasts showed increased proliferation and migration when compared to WT fibroblasts. The presence of the p.S252W mutation increased the osteogenical differentiation in vitro and in vivo in both cell types. We also demonstrated that p.S252W fibroblasts can increase the osteogenic differentiation of MSCs from the periosteum, but not from other sources. is negatively controlling the phosphorylation of JNK. We propose that cells from the periosteum have a more significant role in the premature closure of the cranial sutures than previously thought and that molecules of the JNK pathway are strong candidates for the treatment of Apert syndrome. Previous works have shown that the DUSP2 gene had increased expression in periosteum derived fibroblasts of Apert syndrome patients then in WT. DUSP2 is a phosphatase capable of dephosphorylate members of the MAPK family, including p-JNK. In this work we have shown that FGFR2 activation regulates the proteic levels of DUSP2 in both patients and control derived fibroblasts, however this control is exercised by different pathways in each case. We also demonstrated that DUSP2

Mutações do tipo ganho de função em FGFR2 causam a síndrome de Apert, uma doença rara caracterizada por craniossinostose e defeitos ósseos nos membros devidos a anormalidades na diferenciação e remodelamento ósseos. Apesar do periósteo ser uma importante fonte de células durante o remodelamento ósseo, seu papel nas craniossinostoses ainda é pouco conhecido. A S. de Apert é causada por mutações (p.S252W ou p.P253R) que levam a perda de especificidade de FGFR2 por seus ligantes e causam a ativação exacerbada do mesmo. Sabe-se que FGFR2 ativa vias de sinalização intracelulares como MEK/ERK, PI3-K e PLC. Nossa hipótese é que as células tronco mesenquimais (MSCs) e fibroblastos de pacientes com S. de Apert tem fenótipos celulares e vias de sinalização alterados que contribuem para o fechamento recorrente das suturas coronais. MSCs e fibroblastos foram obtidos do periósteo de pacientes portadores da S. de Apert (S252W) e indivíduos controles (WT). Nós analisamos a proliferação, migração e diferenciação osteogênica dessas células. A mutação S252W teve efeitos opostos em tipos celulares diferentes: MSCs S252W proliferaram menos que as S252W controle, enquanto fibroblastos S252W proliferaram mais que fibroblastos controle, além de terem aumento da migração. A presença da mutação S252W aumentou a diferenciação osteogênica in vitro e in vivo em ambos os tipos celulares estudados. Esse aumento de diferenciação osteogênica foi revertido pela inibição de JNK. Nós demonstramos que fibroblastos S252W podem induzir a diferenciação osteogênica em MSCs de periósteo, porém não em MSCs de outras fontes. Trabalhos anteriores mostraram que o gene da fosfatase DUSP2 está mais expresso em fibroblastos do periósteo de pacientes portadores da S. de Apert do que em controles. DUSP2 é capaz de desfosforilar membros das MAPKs, dentre estes p-JNK. Nesse trabalho mostramos que a ativação de FGFR2 regula os níveis proteicos de DUSP2 tanto em pacientes quanto em controles, porém por vias diferentes em cada caso, e que DUSP2 está regulando negativamente a fosforilação de JNK.Nós propomos que células do periósteo tem um papel mais importante no fechamento precoce das suturas cranianas do que se imaginava anteriormente e que moléculas da via JNK são fortes candidatas para o tratamento de pacientes da S. de Apert. / Apert Syndrome is cause by gain of Function mutations in FGFR2, a rare condition characterized by craniosynostosis and bone limb defects due to abnormalities in osteogenic differentiation and cone remodeling. Even though the periosteum acts as an important cell source during bone remodeling, its role in craniosynostosis is yet unknown. Apert syndrome is caused by one of two mutations (p.S252W or p.P253R) leading to loss of specificity of FGFR2 by its ligands leading to increased activation of the receptor. It is known that FGFR2 activates the MEK/ERK, PI3-K and PLC signaling pathways. Our hypothesis is that Apert syndrome patients\'\' Mesenchimal Stem Cells (MSCs) and fibroblasts have altered cellular phenotye and signaling pathways which may contribute to the premature closure of the coronal sutures. MSCs and fibroblasts were obtained from the periosteum of Apert syndrome patients bearing the p.S252W mutation and from wild-type (WT) individuals. The p.S252W mutation had opposite effects on different cell types: MSCs p.S252W proliferated less than WT, while p.S252W fibroblasts showed increased proliferation and migration when compared to WT fibroblasts. The presence of the p.S252W mutation increased the osteogenical differentiation in vitro and in vivo in both cell types. We also demonstrated that p.S252W fibroblasts can increase the osteogenic differentiation of MSCs from the periosteum, but not from other sources. is negatively controlling the phosphorylation of JNK. We propose that cells from the periosteum have a more significant role in the premature closure of the cranial sutures than previously thought and that molecules of the JNK pathway are strong candidates for the treatment of Apert syndrome. Previous works have shown that the DUSP2 gene had increased expression in periosteum derived fibroblasts of Apert syndrome patients then in WT. DUSP2 is a phosphatase capable of dephosphorylate members of the MAPK family, including p-JNK. In this work we have shown that FGFR2 activation regulates the proteic levels of DUSP2 in both patients and control derived fibroblasts, however this control is exercised by different pathways in each case. We also demonstrated that DUSP2

Single nucleotide polymorphisms present in the second intron of the fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) gene have been linked with increased risk of breast cancer in several genome wide association studies. The potential effect of those SNPs appeared to be mediated through the differential binding of cis-regulatory elements, such as transcription factors, since all the SNPs in linkage disequilibrium were located in a regulatory DNA region. Preliminary studies have shown that a Runx2 binding site is functional only in the minor, disease associated allele of rs2981578, resulting in increased expression of FGFR2 in cancers from patients homozygous for that allele. Moreover, the increased risk conferred by the minor FGFR2 allele is associated most strongly in oestrogen receptor alpha positive (ERα) breast tumours, suggesting a potential interaction between ERα and FGFR signalling. Here, we have developed a human cell line model system to study the effect of those SNPs on cell behaviour. In an ERα positive breast cancer cell line, rs2981578 was edited using Zinc Finger Nucleases. Unexpectedly, the acquisition of the single risk allele in MCF7 cells failed to affect proliferation or cell cycle progression. Binding of Runx2 to the risk allele was not observed. However FOXA1 binding, an important ERα partner, appeared decreased at the rs2981578 locus in the risk allele cells. Additionally, differences in allele specific expression (ASE) of FGFR2 were not observed in a panel of 72 ERα positive breast cancer samples. Thus, the apparent increased risk of developing ERα positive breast cancer is not caused by rs2981578 alone. Rather, the observed increased risk of developing breast cancer might be the result of a coordinated effect of multiple SNPs forming a risk haplotype in the second intron of FGFR2.

Nonsyndromic cleft lip and/or palate (NS CL/P) is a common birth defect with estimated birth prevalence of 1/1000 worldwide. NS CL/P etiology may be explained by the action of as few as two or as many as 14 different genes (Schliekelman et al. 2002) as well as several environmental factors (e.g. smoking and folic acid) (Shi et al. 2008; Wehby et al. 2010). Convincing genetic and/or biologic evidence exists for the contribution of many genes: IRF6, 8q24, FGFR2, FOXE1, BMP4, TGFβ3, MSX1, MAFB , PAX7, ABCA4, and VAX1, to NS CL/P (Dixon et al. 2011). Clefts place substantial burdens on families and society with the estimated costs of cleft care and surgical repair around $100,000 in the United States (Jugessur et al. 2009). The health burden of NS CL/P does not end after the last surgery - impaired social development, surgical morbidity, and cancer are all reported in older children and adults with NS CL/P. Genes involved in clefting during development may be involved in other processes throughout life. We hypothesize that non-coding variation of the FGFR2 gene is associated with NS CL/P and these variants correlate with levels of gene expression. We investigate links between clefting, wound healing, and genes implicated in cancer in NS CL/P families. Analysis of family genotype data with the Transmission Disequilibrium Test (TDT), demonstrated suggestive association for two non-coding SNPs, rs2912770 with CL/P (p = 0.002 -USA) and rs2114684 with cleft palate (p = 0.002 - USA and all populations) but not for SNPs located within intron 2 - where genome wide association (GWA) signals overlap in both NS CL/P and breast cancer studies. Studies of foreskin tissue supported correlation of rs2912770 genotype with level of FGFR2 expression, though the magnitude of the effect was modest and did not remain significant after correction for multiple comparisons. Transcriptome array analysis suggested novel regions of regulated transcription, but their function as novel exons was not validated by real-time PCR (RT-PCR). As we expanded our focus from FGFR2, we examined association of cleft candidate genes with wound healing complications (WHC) with case-control and TDT analysis. Allelic and genotypic case-control analysis suggests association of rs2981582 with WHCs (p < 0.08). TDT analysis revealed WHC potential association with rs6478437 located upstream of the ( FOXE1) gene (p = 0.04). This study has medical implications, as the identification of children at high-risk for WHCs prior to surgical treatment and interventions may prevent post-surgical wound healing complications. We finally examined NS CL/P association with genes that had prior evidence for a role in clefting and cancer. In this analysis, we observed TDT association of rs4746409, located in intron 4 of the zinc finger 365 ( ZNF365) gene (p = 0.0003). Interestingly, this gene and SNP were tested due to suggestive association with breast cancer (Turnbull et al. 2010) and NS CL/P from GWA analyses (Beaty et al. 2010), which strengthens the connection between NSCL/P and breast cancer risk. Identification of NS CL/P patients at increased cancer risk could save lives and extend healthy life for current cleft patients as the field continues to seek ways to intervene and prevent cleft lip and palate from occurring.

No description available.

Yes / Recent evidence suggests that the ion channel TRPA1 is implicated in lung adenocarcinoma (LUAD) where its role and mechanism of action remain unknown. We have previously established that the membrane receptor FGFR2 drives LUAD progression through aberrant protein-protein interactions mediated via its C-terminal proline rich motif. Here, we report that the N-terminal ankyrin repeats of TRPA1 directly bind to the C-terminal proline rich motif of FGFR2 inducing the constitutive activation of the receptor, thereby prompting LUAD progression and metastasis. Furthermore, we show that upon metastasis to the brain, TRPA1 gets depleted, an effect triggered by the transfer of TRPA1-targeting exosomal microRNA (miRNA-142-3p) from brain astrocytes to cancer cells. This downregulation, in turn, inhibits TRPA1-mediated activation of FGFR2 hindering the metastatic process. Our study reveals a direct binding event and characterizes the role of TRPA1 ankyrin repeats in regulating FGFR2-driven oncogenic process; a mechanism that is hindered by miRNA-142-3p. / Faculty of Biological Sciences at the University of Leeds, Wellcome Trust Seed Award, Royal Society Research Grant RG150100, MR/K021303/1, Swedish Research Council (2014-3801) and the Medical Faculty at Lund University.