DNA methylation (DNAm) is the covalent modification of DNA by addition of a methyl group primarily at the cytosine directly upstream of a guanine. DNAm level plays a central role in transcriptional regulation and is linked to disease. Therefore, understanding genetic and environmental influences on DNAm level in healthy tissue is an important step in the elucidation of trait and disease etiology. However, at present only a minority of easy to access human tissues and ethnicities have been investigated. Therefore, we studied DNAm level measured in five human tissues: cerebellum, frontal cortex, pons, temporal cortex and colon in either North American or South American samples. We applied a novel statistical approach to estimate the heritability attributable to genomic regions (regional heritability, ĥ²/r,g ) for DNAm level at thousands of individual DNAm sites genome-wide. In all five tissues, DNAm level was significantly associated with the local genomic region for more DNAm sites than expected by chance. Moreover, DNAm level could be predicted from the local sequence variants with an accuracy that scaled with the estimated ĥ²/r,g . Our results inform on molecular mechanisms regulating DNAm level and trait etiology in several ways. Firstly, DNAm level at DNAm sites located in genomic risk regions and measured in a tissue relevant to the disease can be influenced by the local genetic variants. Specifically, we found that genetic variation within a region associated with Fluid Intelligence was also associated with local DNAm level at the proline-rich coiled-coil 1 (PRRC1) gene in healthy temporal cortex tissue. Additionally, we replicated the finding of a Colorectal Cancer risk variant (rs4925386) associated with two DNAm sites in healthy colon tissue. More generally, we showed that DNAm sites located within a susceptibility region and measured in a relevant tissue exhibit a similar overall pattern of estimated ĥ²/r,g to DNAm sites outwith a susceptibility region. Secondly, the propensity for DNAm level to be associated with the local sequence variation differs with respect to CpG dinucleotide density and genic location. Most notably, DNAm sites located in CpG dense regions of the genome are less likely to be heritable than DNAm sites located in CpG sparse regions of the genome. Additionally, within both CpG dense and CpG sparse regions of the genome intergenic DNAm sites are more likely to be heritable than intragenic DNAm sites. Overall, our study suggests that variation in DNAm level at some DNAm sites is at least partially controlled by nuclear genetic variation. Moreover, DNAm level in healthy tissue has the potential to act as an intermediary in trait variation and etiology.

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La plupart des caractères ayant un intérêt médical ou agronomique sont dits complexes. Ce qui signifie qu'ils sont influencés par plusieurs gènes, des facteurs environnementaux et des interactions gènes-environnement. L'identification de gènes affectant de tels caractères est un des sujets les plus importants de la génétique moderne: d'un point vu médical, cela offrirait de nouvelles perspectives, tant d'ordre diagnostic quethérapeutique, tandis que sur un plan agronomique, cela ouvrirait de nouvelles voies dans la sélection et la manipulation des animaux domestiques. L'approche la plus efficace pour identifier des gènes impliqués dans des caractères complexes est le clonage positionnel. Cette approche comporte trois étapes: (i) identifier les régions génomiques contenant les facteurs génétiques impliqués dans les caractères étudiés, (ii) identifier les mutations causales (iii) et enfin étudier le fonctionnement cellulaire et moléculaire des gènes responsables. La première étape du clonage positionnel, appelé cartographie génétique consiste à regarder au sein d'un groupe d'individus, sil existe une corrélation entre l'histoire des différents chromosomes et celle du caractère étudié. Les outils génétiques permettant de suivre l'état d'un chromosome chez un individu, ont connu ces dernières années des progrès remarquables, notamment grâce à l'apparition des plates-formes de génotypage à haut débit et au développement de nouveaux marqueurs génétiques. Actuellement, la principale difficulté en cartographie génétique réside dans le choix de la meilleure stratégie pour détecter des variations génétiques affectant des caractères complexes, qui le plus souvent sont associés à des effets relativement modestes. Le choix d'une approche dépendra: (i) du caractère étudié caractère discret ou continu (ii) du dataset les individus sont apparentés ou non et (iii) des outils génétiques disponibles. Les travaux réalisés au cours de cette thèse s'inscrivent précisément dans cette problématique, c'est à dire développer des approches statistiques afin d'identifier des gènes affectant des caractères complexes ayant un intérêt médical ou agronomique. La plupart des études de cartographie QTL (Quantitative Trait Loci, loci influençant un caractère continu), dans des populations de bovins laitiers, exploitent la structure en GDD (Grand Daughter Design) des pedigrees et procèdent en regardant au sein de familles de demi-frères paternelles, sil existe des différences phénotypiques entre les taureaux en fonction de l'homologue reçu. Étant donné que ce type d'approche exploite la transmission de chromosome de taureau à taureau et que le chromosome X est d'origine maternelle chez les mâles, la cartographie de QTL sur le chromosome X dans ce type d'espèce a longtemps été exclue. Pour cartographier des QTL sur le X, nous avons proposé une approche retraçant l'histoire des différents segments chromosomiques dans notre échantillon, sur base de son mode de transmission et de la structure de la population. Cette approche suppose que sil existe un QTL au niveau d'une région donnée, deux individus ayant reçu le même segment chromosomique se ressembleront davantage que deux individus ayant reçu deux segments chromosomiques différents. Cette approche suppose également qu'il existe une corrélation, appelée déséquilibre de liaison (DL) entre les allèles QTL et allèles marqueurs. Afin d'évaluer l'intérêt d'une telle approche, nous avons caractérisé les niveaux de DL sur le X. Nous avons montré que le X exhibait dans ce type de population des niveaux de DL particulièrement élevé et inattendu. Parmi les 48 caractères laitiers étudiés, nous avons trouvé en utilisant une méthode de type maximum de vraisemblance restreint (REML, Residual maximum likelihood estimation) 5 QTL significatifs sur le X. Au cours de ces dernières années, le nombre de publications chez les espèces de productions mettant en évidence de l'empreinte parentale (y compris chez les oiseaux) comme étant associé aux QTL découverts (imprinted QTL,l'effet d'un allèle QTL dépendra de son origine parentale) n'a cessé de croitre. Ces résultats contredisent ceux de la biologie moléculaire, qui montrent que l'empreinte parentale est un phénomène rare et uniquement observé chez les mammifères placentaires. Une précédente étude, pointe le problème d'ordre statistique soulevé par toutes ces études détectant de l'empreinte parentale de façon quasi systématique. Ces études emploient un design de type line-cross qui suppose, pour cartographier des QTL et tester une hypothèse d'empreinte parentale, d'un coté que les lignées parentales sont fixées pour les allèles QTL et de l'autre qu'elles peuvent ségréger pour différents allèles marqueurs. Si cette hypothèse est fausse et que les lignées parentales ne sont pas fixées pour les allèles QTL, tous les individus en F1 ne sont pas hétérozygotes ou pas hétérozygotes pour les mêmes allèles QTL. Si le nombre de parents en F1 est restreint (cas typique du coté paternel), il sera possible d'avoir un effet de substitution allélique qui dépendra de l'origine parentale en F2 et de conclure erronément à de l'empreinte parentale. Dans notre étude, nous avons montré que ce problème pouvait être exacerbé de 40 à 80% en cas de DL. Pour tester une hypothèse d'empreinte parentale, il faut que les parents en F1 soient hétérozygotes pour des allèles marqueurs différents. En cas de DL la probabilité que des allèles marqueurs différents soient associés à des allèles QTL augmente et la détection de fausse empreinte parentale également. Depuis 2007, le nombre de loci à risque associés à des maladies complexes humaines et découverts dans des études d'association génome-entier (GWAS = Genome Wide Association Study n'a cessé de croire. Beaucoup de ces loci tombent dans des régions non-codantes et une hypothèse avancée pour expliquer leur rôle biologique est qu'ils moduleraient le niveau d'expression de certains gènes à travers des éléments cis. Des investigations combinant des études d'expression sur un grand nombre de gènes avec des études GWA ont été mises en uvre afin de répertorier dans des bases de données les effets trans et cis de polymorphismes (appelés eQTL pour Expression Quantitative Trait Locus) sur le niveau d'expression de ces gènes. En utilisant ces bases de données d'eQTL, nous avons pu découvrir: (i) des SNP à risque pour la maladie de Crohn et présent dans une région dépourvue de gène, régulaient probablement le niveau d'expression du gène PTGER4 (protaglandin E receptor 4), codant pour un récepteur à une prostaglandine et candidat sérieux à ce type désordre. (ii) Parmi les 39 SNPs à risque dans la maladie, on observe 5 effets de type cis eQTL, non dus au hasard. Ces effets eQTL ouvrent de nouvelles perspectives dans l'architecture génétique d'une maladie complexe: la maladie de Crohn. L'intensité des recombinaisons ainsi que leur position dans le génome sont dictées par le rôle fondamental que joue la recombinaison dans la ségrégation correcte des chromosomes lors de la première division méiotique. Néanmoins, on observe, des différences entre individus de même sexe et de même âge aussi bien dans l'intensité que dans la position des recombinaisons. Une idée pour explorer les causes génétiques sous-tendant ces variations est d'appliquer des méthodes de cartographie QTL classique à la recombinaison elle-même, qui sera traitée comme un phénotype quantitatif. Nous avons réalisé ce type d'étude à différente échelle, sur une population de taureaux laitiers génotypés pour des milliers de marqueurs de type SNP, en exploitant le fait: (i) qu'un grand nombre d'entre eux disposent d'un nombre suffisant de descendants pour estimer précisément leur taux de recombinaison, (ii) qu'ils appartiennent à des familles de demi-frères paternelles, pour employer des méthodes de cartographie QTL exploitant le DL et la liaison génétique. Dans cette étude, nous caractérisons préalablement les niveaux de recombinaison sur différentes échelles: (i) distribution du phénotype, (ii) répétabilité du caractère (iii) suivi d'une étude d'héritabilité. Nous montrons que plusieurs QTL affectent de manière significative les taux de recombinaisons et cela à différentes échelles. Plusieurs conclusions peuvent être tirées de ces études de cartographie génétiques tentant d'identifier des gènes influençant des caractères complexes d'intérêt agronomique ou médical. D'un point vu statistique, on montre que dans la plupart des cas les loci identifiés représentent une faible part de la variation génétique totale (10-15%). Plusieurs hypothèses sont avancées pour expliquer la variation génétique restante. (i) La première est que les études actuelles ne sont pas suffisamment puissantes pour détecter des loci même associés à des effets moyens. Cette faiblesse est illustrée par le fait qu'en réalisant une GWAS, dans laquelle on regroupe les données de GWAS individuelles, on augmente considérablement la puissance de détection de loci associés au caractère étudié. (ii) Une autre hypothèse est que les études de cartographie actuelles utilisent des outils génétiques qui ciblent un seul type de polymorphismes: des variations génétiques fréquentes dans la population. Or un caractère complexe peut très bien être influencé par des variations génétiques peu fréquentes dans la population, voire des mutations rares ou encore des polymorphismes structuraux (p.e: CNV: Copy Number Variant). (iii) La plupart des études actuelles ne recherchent que des effets de type additif. Il est fort probable qu'il existe des effets de type gène-gène, appelés épistasie, qui affectent des caractères complexes. Cependant, détecter de tels effets nécessite de mettre en uvre des études beaucoup plus puissantes que celles existantes actuellement. D'un point vu biologique, si certains loci détectés se trouvent dans des gènes dont on connait le rôle dans le caractère étudié, beaucoup d'entre eux se trouvent dans des régions non-codantes. Ce résultat n'a rien de surprenant quand on sait que seulement 5 % du génome est conservé et donc fonctionnel et que parmi ces 5%, un tiers correspond à des gènes. Toutefois, comprendre le rôle biologique de ces loci dans des caractères complexes est un challenge. Une hypothèse avancée est que le niveau d'expression de certains gènes est peut-être régulé par ces polymorphismes influençant des caractères complexes. Pour améliorer nos connaissances sur les caractères complexes, il sera nécessaire, au cours des prochaines années: (i) d'étendre le design des études génétiques afin d'en augmenter leur puissance de détection. Ceci passera notamment par: (1) une augmentation de la taille des échantillons, (2) étudier le même phénotype dans des populations ayant une origine différente (un polymorphisme, ayant le même effet dans deux populations différentes peut être plus facilement détecté dans la population où il est le plus fréquent), (3) améliorer la précision de l'estimation des phénotypes (4) étudier des phénotypes apparentés ou des sous-phénotypes (p.e. Crohn et les colites ulcéro-hémorragiques) (5) s'intéresser davantage aux facteurs environnementaux. (ii) Il faudra également étendre la palette des outils génétiques disponibles, pour rechercher des polymorphismes peu fréquents ou des polymorphismes structuraux pouvant affecter des caractères complexes. Ceci devrait être prochainement réalisable grâce à l'essor des technologies de séquençage à haut débit qui devrait permettre de cataloguer des polymorphismes avec une fréquence > 1% dans une population (1000 Genome Project).On peut penser également qu'il sera possible dans quelques années de séquencer complètement tous les individus d'une étude de cartographie et d'identifier ainsi des mutations génétiques rares. Néanmoins, ces nouveaux outils génétiques bouleverseront les méthodes de cartographie génétique actuelles. Les approches futures devront exploiter toute l'information disponible simultanément, c'est-à-dire combiner l'information concernant toutes les variations génétiques possibles ainsi que les phénotypes et d'éventuels effets environnementaux. En génétique animale, le problème des loci influençant un caractère complexe et écartés par manque de puissance statistique a été contourné par une approche dite de sélection génomique. Celle-ci a pour but de prendre en compte les signaux dassociation sur lentièreté du génome, indépendamment des seuils de signification associés, et de les intégrer en une prédiction la plus précise possible de la valeur délevage dun individu. Lobjectif passe donc de lidentification la plus précise possible de loci individuels à la prédiction la plus précise possible dune valeur délevage individuelle globale, sans nécessairement savoir exactement quels sont les loci qui y contribuent, mais en intégrant plutôt de façon pondérée sur lensemble des possibilités. Or il serait tout à fait imaginable d'adapter ce type d'approche à des maladies complexes humaines et de déterminer à partir d'une GWAS un « risque relatif génome entier » (GWRR) pour chaque individu.

Orofacial clefts are a heterogeneous group of craniofacial malformations that affect the lip and/or palate and represent the most common craniofacial birth defect in humans. In 30% of patients the cleft is accompanied by additional physical or cognitive abnormalities. Hundreds of these clefting syndromes have been described, many of which have Mendelian inheritance patterns. The most common of these is Van der Woude syndrome (VWS), caused by mutations in the transcription factor IRF6 (Kondo et al. 2002). The other 70% of patients lack additional features and are considered nonsyndromic. The etiology of nonsyndromic clefts is complex and involves the combined action of multiple genetic variants interacting with environmental factors. A common approach for identifying genetic risk factor for complex disorders such as nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) is the genome wide association study (GWAS). We pursued a locus on 1p22 shown to be associated with NSCL/P by Beaty et al. (2010). Through a combination of expression studies in a mouse model and mutation screening in NSCL/P patients, we identified ARHGAP29 as a novel gene for NSCL/P and the likely etiologic gene at this locus. We identified eight rare variants in NSCL/P patients absent in controls including a nonsense and a frameshift mutation. These rare variants are reminiscent of previous resequencing studies that reported rare coding mutations in 20 different candidate genes for NSCL/P. We reviewed these variants and compared them with variants found in over 7000 exomes from the 1000 Genomes Project (1kGP) and NHLBI Exome Sequencing Project (ESP) to identify the variants and genes most likely to contain etiologic rare variants. We found good support for a role for rare variants in NSCL/P, particularly for MSX1 and genes of the FGF signaling pathway. We next performed several studies to understand the genetic architecture of syndromic forms of clefting, focusing on VWS and popliteal pterygium syndrome (PPS), which is allelic to VWS. We compiled all of the nearly 300 published IRF6 mutations and compared the distribution of these mutations with IRF6 variants obtained from the 1kGP and ESP exomes. We found that mutations causing VWS were significantly over-represented in the DNA-binding domain and for the most part were absent from control exomes, indicating that they are likely to be truly causative for VWS or PPS. These mutations in VWS and PPS only account for 70% of VWS and 97% of PPS. We next hypothesized that mutations in RIPK4, which causes an autosomal recessive pterygia syndrome, could underlie the remaining VWS and/or PPS cases. We found novel homozygous mutations in RIPK4 in two PPS patients. This result has significant clinical ramifications, as counseling of recurrence risk is very different for PPS patients whose disease is caused by dominant IRF6 mutations compared to recessive RIPK4 mutations. Finally, to understand the variable expressivity of VWS and PPS we performed an association study to identify genetic modifiers. We also looked for genotype-phenotype correlations between the type and location of IRF6 mutations. Although we did not find strong evidence that the candidate genes we selected from GWAS of NSCL/P or other clefting syndromes are modifiers of the VWS or PPS phenotypes, several marginal associations suggest that members of the IRF6 gene regulatory network could act as modifiers. Finally, we found evidence of a larger genotype-phenotype correlation by demonstrating that mutation-negative VWS families have a deficiency of cleft lip phenotypes. Together this work has advanced our understanding of the genetic basis of this diverse set of cleft lip and palate disorders, informing both the biology of craniofacial development and the clinical care of patients affected by these disorders.

Nonsyndromic cleft lip and/or palate (NS CL/P) is a common birth defect with estimated birth prevalence of 1/1000 worldwide. NS CL/P etiology may be explained by the action of as few as two or as many as 14 different genes (Schliekelman et al. 2002) as well as several environmental factors (e.g. smoking and folic acid) (Shi et al. 2008; Wehby et al. 2010). Convincing genetic and/or biologic evidence exists for the contribution of many genes: IRF6, 8q24, FGFR2, FOXE1, BMP4, TGFβ3, MSX1, MAFB , PAX7, ABCA4, and VAX1, to NS CL/P (Dixon et al. 2011). Clefts place substantial burdens on families and society with the estimated costs of cleft care and surgical repair around $100,000 in the United States (Jugessur et al. 2009). The health burden of NS CL/P does not end after the last surgery - impaired social development, surgical morbidity, and cancer are all reported in older children and adults with NS CL/P. Genes involved in clefting during development may be involved in other processes throughout life. We hypothesize that non-coding variation of the FGFR2 gene is associated with NS CL/P and these variants correlate with levels of gene expression. We investigate links between clefting, wound healing, and genes implicated in cancer in NS CL/P families. Analysis of family genotype data with the Transmission Disequilibrium Test (TDT), demonstrated suggestive association for two non-coding SNPs, rs2912770 with CL/P (p = 0.002 -USA) and rs2114684 with cleft palate (p = 0.002 - USA and all populations) but not for SNPs located within intron 2 - where genome wide association (GWA) signals overlap in both NS CL/P and breast cancer studies. Studies of foreskin tissue supported correlation of rs2912770 genotype with level of FGFR2 expression, though the magnitude of the effect was modest and did not remain significant after correction for multiple comparisons. Transcriptome array analysis suggested novel regions of regulated transcription, but their function as novel exons was not validated by real-time PCR (RT-PCR). As we expanded our focus from FGFR2, we examined association of cleft candidate genes with wound healing complications (WHC) with case-control and TDT analysis. Allelic and genotypic case-control analysis suggests association of rs2981582 with WHCs (p < 0.08). TDT analysis revealed WHC potential association with rs6478437 located upstream of the ( FOXE1) gene (p = 0.04). This study has medical implications, as the identification of children at high-risk for WHCs prior to surgical treatment and interventions may prevent post-surgical wound healing complications. We finally examined NS CL/P association with genes that had prior evidence for a role in clefting and cancer. In this analysis, we observed TDT association of rs4746409, located in intron 4 of the zinc finger 365 ( ZNF365) gene (p = 0.0003). Interestingly, this gene and SNP were tested due to suggestive association with breast cancer (Turnbull et al. 2010) and NS CL/P from GWA analyses (Beaty et al. 2010), which strengthens the connection between NSCL/P and breast cancer risk. Identification of NS CL/P patients at increased cancer risk could save lives and extend healthy life for current cleft patients as the field continues to seek ways to intervene and prevent cleft lip and palate from occurring.

<p>The goal of my thesis is to understand the genetics of a complex behavioral trait, vocal learning, which serves as a critical substrate for human spoken language. With the available genomes of 23 mammals, I developed a novel approach based on molecular homoplasy to reveal Single Non-random Amino Acids Patterns (SNAAPs) that are associated with convergent traits, a task that proved intractable for standard approaches, e.g. dN/dS analyses. Of 73 genes I identified in mammalian vocal learners, ~25% function in neural connectivity, auditory or speech processing. Remarkably, these include a group of 6 genes from the ROBO1 axon guidance pathway. In birds, I found ROBO1 and its ligand SLIT1 show convergent differential expression in the motor output song nucleus of the three independent lineages of vocal learners but not in analogous brain areas of vocal non-learners, and ROBO1 is developmentally regulated during song learning critical periods in songbirds. In a different set of genes, I came across an unexpected discovery of the excess sharing of homoplastic substitutions in humans and domesticated species. I revealed biased nucleotide transitions (mostly favoring A/G mutation) for above amino acid substitutions and found that this rule was significantly relaxed during domestication for artificial selection. Overall, my thesis has resulted in a novel approach for studying convergent complex traits and provided critical insights into the evolution of vocal learning specifically, and complex traits generally.</p> / Dissertation

Genome-wide association studies (GWAS) have greatly improved our understanding of the genetic basis of complex traits. However, there are two major limitations with GWAS. First, most common variants identified by GWAS individually or in combination explain only a small proportion of heritability. This raises the possibility that additional forms of genetic variation, such as rare variants, could contribute to the missing heritability. The second limitation is that GWAS typically cannot identify which genes are being affected by the associated variants. Examination of rare variants, especially those in coding regions of the genome, can help address these issues. Moreover, several studies have recently identified low-frequency variants at both known and novel loci associated with complex traits, suggesting that functionally significant rare variants exist in the human population.

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La plupart des maladies humaines ont une étiologie complexe avec des facteurs génétiques et environnementaux qui interagissent. Utiliser des phénotypes corrélés peut augmenter la puissance de détection de locus de trait quantitatif. Ce travail propose d’évaluer différentes approches d’analyse bivariée pour des traits corrélés en utilisantl’information apportée par les marqueurs au niveau de la liaison et de l’association. Legain relatif de ces approches est comparé aux analyses univariées. Ce travail a étéappliqué à la variation de la densité osseuse à deux sites squelettiques dans une cohorted’hommes sélectionnés pour des valeurs phénotypiques extrêmes. Nos résultats montrentl’intérêt d’utiliser des approches bivariées en particulier pour l’analyse d’association. Parailleurs, dans le cadre du groupe de travail GAW16, nous avons comparé lesperformances relatives de trois méthodes d’association dans des données familiales. / The majority of complex diseases in humans are likely determined by both genetic andenvironmental factors. Using correlated phenotypes may increase the power to map theunderlying Quantitative Trait Loci (QTLs). This work aims to evaluate and compare theperformance of bivariate methods for detecting QTLs in correlated phenotypes by linkageand association analyses. We applied these methods to data on Bone Mineral Density(BMD) variation, measured at the two skeletal sites, in a sample of males selected forextreme trait values. Our results demonstrate the relative gain, in particular for associationanalysis, of bivariate approaches when compared to univariate analyses. Finally, we studythe performances of association methods to detect QTLs in the GAW16 simulated familydata.