El glaucoma és una de les principals causes de ceguesa no traumàtica i afecta a milions de persones a tot el món. Aquesta patologia es caracteritza per una degeneració progresiva de les cèl·lules ganglionars de la retina i del nervi òptic i d'una pèrdua gradual del camp visual. Un dels principals factors de risc del glaucoma és l'augment de la pressió intraocular (IOP).L'humor aquós contingut a les cambres anterior i posterior de l'ull i l'equilibri entre la seva síntesi i evacuació determina la IOP. Quan l'evacuació de l'humor aquós disminueix, aquest fluid s'acumula a les cambres oculars i provoca un excés de pressió. En humans l'humor aquós s'evacua a través de la xarxa trabecular i el canal d'Schlemm. La xarxa trabecular és una estructura en forma de malla que modula l'evacuació de l'humor aquós mitjançant diferents mecanismes. Alteracions en aquest teixit comporten un augment de la resistència al pas de l'humor aquós, produint un augment de la IOP. Entre d'altres factors, el volum de les cèl·lules trabeculars modula activament la resistència al pas de l'humor aquós. Les cèl·lules trabeculars presenten un mecanisme homeostàtic en resposta a un augment de volum que es coneix amb el nom de regulatory volume decrease (RVD) i els permet recuperar el seu volum inicial amb l'eflux d'ions de potassi (K+), clorur (Cl-) i la sortida pasiva d'aigua.Ja que els canals de Cl- són claus en la regulació del volum cel·lular i que aquest mecanisme és un factor determinant en l'evacuació, és de gran interès estudiar els canals de Cl- a les cèl·lules trabeculars. Els resultats mostren que aquestes cel·lules expresen els canals de Cl- dependents de voltatge ClC-2, 3, 4,5,6 i 7. L'augment del volum cel·lular per hipotonicitat sobreexpressa el canal ClC-2 a les cel·lules trabeculars. L'elevada IOP durant una hora sobreexpressa el ClC-2 respecte el CIC-3. En canvi el canal ClC-3 se sobreexpressa en relació al ClC-2 després de 4 i 7 dies. Aquests resultats indiquen que ambdós canals podrien participar en el mecanisme homeostàtic que regula l'evacuació de l'humor aquós i estar relacionats amb la fisiopatologia del glaucoma.A les cel·lules trabeculars i amb la tècnica de patch clamp hem identificat els corrents de Cl- mitjançats pel canal ClC-2 que es caracteritzen per una rectificació d'entrada. La magnitud del corrent augmenta amb l'acidificació extracel·lular, l'AMPc i l'augment del volum cel·lular mentre que es bloqueja amb cadmi. La seqüència de permeabilitats aniòniques del corrent és Cl->Br->I->F->. Les cel·lules trabeculars també presenten corrents activats en condicions hipotòniques amb rectificació de sortida, inactivació dependent del temps als potencials positius i una seqüència de permeabilitats aniòniques de I-> Br->Cl->F>glucomnat-. L'activació del corrent requereix la presència d'ATP intracel·lular i es bloqueja amb Tamoxifen, DIDS i ATP extracel·lular. Les propietats electrofisiològiques i farmacològiques del corrent indiquen que es tracta del corrent de Cl- conegut amb el nom d' IClswell.Amb la tècnica fluorimètrica amb calceïna hem quantificat el mecanisme de RVD a les cel·lules trabeculars que els permet recuperar un 20% del seu volum después de 25 d'un augment del volum induït per hipotonicitat. L'aplicació de bloquejants específics dels diferents canals de Cl- indica que IClswell participa en el RVD de les cel·lules trabeculars mentre que el canal ClC-2 no col·labora en aquest mecanismo. Finalment, la hipotonicitat disminueix l'evacuació de l'humor aquós per l'augment del volum cel·lular i es recupera de manera progressiva per l'activació del RVD. Amb bloquejants específics hem determinat la implicació d' IClswell i del canal de K+ dependent de calci BKCa en la modulació de la facilitat d'evacuació mentre que el CIC-2 no hi té un paper rellevant. Per tant, les cèl·lules trabeculars poden modular de manera activa el seu volum i l'evacuació de l'humor aquós a travès dels canals Clswell i BKCa. / "Chrolide channels in the trabecular meshwork cells and their role in the aqueous humor outflow facility"In the eye, the balance between aqueous humor (AH) inflow and outflow determines intraocular pressure (IOP). The major AH outflow pathway in humans, is through the trabecular meshwork (TM) and the Schlemm's canal (SC). Impairment of AH outflow leads to ocular hypertension, which is the main risk factor to develop glaucoma. It is accepted that both TM cells and SC cells have an active role in modulating the IOP. Changes in TM cells volume may determine the AH outflow rate. Because cell volume is essential to TM function, we investigate cell volume and outflow facility regulation.The results showed that all members of the CLCN gene family but ClC-1 were detected in TM cells. After short periods of elevated pressure ClC-2 induction was significantly higher than that of ClC-3. In contrast, after long pressure insults ClC-3 mRNA was significantly increased. The expression of ClC-2 and ClC-3 were modified by cell swelling and dexamethasone, respectively.CIC-2 currents activated in TM cells were modified by changes in extracellular pH, 8Br-cAMP and hypotonicity-induced cell swelling. The anionic permeability sequence was CI->Br->I->F-. The electrophysiological data presented correlates nicely what the CIC-2 mRNA expression found in TM cells, thus we can conclude that TM cells express functional ClC-2 channels. Hypotonic media also activated a swelling-activated CI- current (Clswell) in TM cells. The current are characterized by an outward rectification, a time dependent decay at depolarizing voltages and an anion permeability sequence I>Br->Cl->F->gluconate-. The currents were inhibited by Tamoxifen, DIDS and external ATP.Cell swelling activates a regulatory volume decrease (RVD) mechanism that implies activation of K+ and Cl- currents. Our results obtained by blocking ClC-2 and Clswell currents showed that CIC-2 had no effect on RVD mechanism while the major contributor to CI- efflux is Clswell in TM cells. Hypotonic media decreased outflow facility in perfused anterior segments, which recovered to baseline levels. Clswell and BKCa channels are involved in a RVD because their selective blockade impair outflow facility recovery after cell swelling while CIC-2 block did not modify the outflow facility and are not involved in RVD mechanism.

La microbiota comensal del intestino se considera un factor clave en la homeostasis gastrointestinal. Las alteraciones funcionales gastrointestinales (síndrome del intestino irritable, SII) y las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) se han relacionado con alteraciones de la microbiota comensal (disbiosis). Estos pacientes muestran una activación inmune local anormal, con respuestas motoras y sensoriales alteradas, que en el SII se traducen en estados de hipersensibilidad visceral. El papel causal de la microbiota no se conoce con exactitud, pero la presencia de disbiosis y los efectos positivos asociados al tratamiento con antibióticos o ciertos probióticos sugieren un papel destacado. Este trabajo explora la importancia de la microbiota intestinal modulando los sistemas sensoriales intestinales relacionados con el dolor visceral y sus efectos en respuestas nociceptivas viscerales. Para ello, se ha trabajado con ratas y ratones en los cuales se ha inducido un estado real (cambios adaptativos espontáneos, cambios inducidos por tratamiento con antibióticos) o simulado (estimulación directa de sistemas de interacción hospedador-microbiota) de disbiosis cólica. La microbiota (luminal y adherida al epitelio) se caracterizó usando hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) y qPCR. La respuesta inmune local y los mecanismos de interacción hospedador-microbiota se valoraron determinando cambios en la expresión génica (RT-qPCR) de citoquinas, péptidos antimicrobianos, integrinas y receptores de tipo Toll (TLR), la producción de IgA secretora, alteraciones histopatológicas y el estado de la barrera de moco. Simultáneamente, se evaluaron cambios en la expresión de marcadores sensoriales. La sensibilidad visceral se valoró mediante el test de Writhing o la administración intracólica de capsaicina. La disbiosis cólica inducida por antibióticos, pero no la observada durante un proceso de adaptación espontánea al ambiente, se asoció a un estado de activación inmune local caracterizado por una regulación selectiva (tanto al alza como a la baja) de citoquinas pro-inflamatorias y de marcadores de interacción hospedador-microbiota y por cambios en los niveles luminales de IgA. Respuestas similares se observaron cuando se simuló al simular un estado de disbiosis mediante la estimulación local del TLR4 (lipopolisacárido) o del TLR7 (imiquimod). En ningún caso se observaron signos macroscópicos o microscópicos de colitis. Tanto en la rata como en el ratón, los estados de disbiosis cólica, real o simulada, se asociaron a una modulación local de la expresión de marcadores sensoriales (sistemas endocanabinoide, serotonérgico, opioide y vaniloide). Se observaron tanto regulaciones al alza como a la baja (RT-qPCR/inmunohistoquímica) dependiendo del modelo de disbiosis y del marcador sensorial considerado. Estos cambios moleculares se tradujeron en cambios funcionales relacionados con respuestas nociceptivas viscerales. Así, en ratones con disbiosis cólica inducida con antibióticos, las repuestas de dolor visceral determinadas con el test de Writhing o tras la administración intracólica de capsaicina mostraron una atenuación significativa con respecto a las observadas en animales control, sugiriendo un estado de hipoalgesia. Estos animales mostraron además una contractilidad cólica alterada (baño de órganos), indicativa de un estado de hipermotilidad. Estos resultados muestran que en estados de disbiosis intestinal se produce una activación inmune local, dirigida, probablemente, a la restauración de la composición de la microbiota. Se observa que la microbiota es capaz de modular la actividad de los sistemas sensoriales intestinales, generando cambios funcionales que se traducen, en las condiciones experimentales presentes, en una modificación de las respuestas de dolor visceral compatible con un estado de tipo analgésico. Mecanismos similares podrían explicar los efectos beneficiosos asociados al tratamiento con antibióticos o al uso de probióticos observados en pacientes con SII o EII. Estudios posteriores deberían centrarse en la caracterización de los grupos bacterianos específicamente responsables de estos efectos. Estos resultados muestran la importancia de la microbiota como factor patogénico en las alteraciones gastrointestinales y su interés como aproximación terapéutica para las mismas. / Gut commensal microbiota (GCM) is a key component of gastrointestinal homeostasis. Functional gastrointestinal disorders (mainly irritable bowel syndrome, IBS) and inflammatory bowel diseases (IBD) have been related to states of altered GCM (dysbiosis). Simultaneously, IBS and IBD patients show local states of abnormal immune activation with altered motor and sensory responses. In particular, in IBS patients sensory alterations lead to characteristic states of visceral hypersensitivity. The exact causal role of GCM remains unclear, but the presence of dysbiosis and the positive effects of antibiotics and some probiotics suggest a key role for the microbiota. The present work explores the potential role of gut microbiota affecting visceral pain-related sensory systems within the gut and the effects on nociceptive responses. For this purpose, states of real (spontaneous adaptive microbial changes, antibiotic treatment-derived microbial changes) or simulated (direct stimulation of host-bacterial interaction systems) colonic dysbiosis were generated in rats and mice. Colonic microbiota (luminal and wall-adhered) was characterized by fluorescent in situ hybridization (FISH) and qPCR. The immune status of the colon and bacterial-host interactions were determined assessing the expression (RT-qPCR) of pro- and anti-inflammatory cytokines; antimicrobial peptides, integrins and Toll-like receptors (TLRs), the production of secretory IgA (s-IgA), the presence of histopathological alterations and the state of the mucous barrier. Simultaneously, changes in sensory related markers were also assessed. Changes in viscerosensitivity were determined in conscious mice using the Writhing test or following the intracolonic administration of capsaicin. Overall, antibiotics-induced alterations of the GCM, but not spontaneous changes associated to environmental adaptation, generated a state of local immune activation within the colon. This state was characterized by selective up- and down-regulation of pro- and anti-inflammatory cytokines and host-bacterial interaction markers and changes in the amounts of s-IgA. Similar immune response was observed when a dysbiotic state was simulated in rats by the direct stimulation of colonic TLR4 with bacterial lipopolysaccharides (LPS) or TLR7 with the selective agonist imiquimod. Although these changes, and regardless the model considered, no macroscopical or microscopical signs of colonic inflammation were detected. In both, mice and rats, real or simulated colonic dysbiotic states were also associated to a local modulation of sensory-related markers (endocannabinoid, serotonergic, opioid and vanilloid systems), with specific treatment-related up- and down-regulatory responses (RT- qPCR and immunohistochemistry). These variations at the molecular level translated in functional changes as it relates to visceral pain-related responses. In mice with antibiotic-induced dysbiosis, visceral pain responses assessed using the Writhing test or the intracolonic administration of capsaicin were significantly attenuated when compared to non-dysbiotic animals; thus suggesting a hypoalgesic state. Moreover, colonic contractility assessed in vitro (organ bath) was also altered in dysbiotic mice, indicating a state of increased colonic motility. Generally, results obtained show that during states of dysbiosis of the GCM there is a complex host response that implies a local immune activation, probably directed towards the reshaping of the microbiota. Data obtained shows that the microbiota is able to influence gut sensory systems and that these changes translate at a functional level in the modulation of visceral pain, eliciting, at least in the present experimental conditions, analgesic-like responses. Similar underlying mechanisms might be responsible for the beneficial effects observed in IBD and, particularly, in IBS patients during antibiotic treatments or during the use of certain bacterial strains as probiotics. Further studies should address the characterization of the specific bacterial groups implicated in these effects. These results highlight the importance of the microbiota as pathogenic factor in gastrointestinal disorders and its potential as a therapeutic approach.

El receptor nuclear PPARgamma controla y regula variedad de procesos biológicos como la adipogénesis, respuestas inflamatorias, y la homeostasis de los carbohidratos y lípidos. En relación con la EHGNA, el aumento de expresión de PPARgamma es una característica general de la esteatosis hepática demostrada tanto en estudios clínicos como en experimentales. Aunque se ha demostrado que la administración de TZDs mejora la esteatosis hepática en pacientes con EHGNA. En el contexto de la inflamación y fibrosis hepática no se ha establecido el papel que ejerce PPARgamma. Se han descrito las funciones antiinflamatorias que puede ejercer PPARgamma modulando el estado de activación de los macrófagos. Por otro lado, múltiples publicaciones demuestran que la recuperación de la expresión de PPARgamma en las células hepáticas estrelladas (CHE) revierte el estado de activación característico de la fibrosis hacia el de quiescencia. No obstante, otros estudios muestran resultados opuestos considerando que las acciones antiinflamatorias de las TZDs pueden ser limitadas, no aplicables para todas las fases de la EHGNA y actuar de forma independiente a la activación de PPARgamma. Debido que a PPARgamma se le han atribuido funciones controvertidas sin definir sus funciones exactas en los estadios de la enfermedad hepática, el objetivo principal de la tesis fue determinar cómo contribuye la expresión de PPARgamma de las células del parénquima y sinusoide hepático en la patogénesis de la EHGNA. Para ello, hemos utilizado la tecnología Cre-LoxP para generar modelos genéticos (ratones knockout o KO condicionales) en los que se ha eliminado selectivamente el gen para PPARgamma de forma específica en hepatocito, en macrófago así como en las células de Kupffer (CK) y en CHE. El primer estudio proporciona evidencias que PPARgamma es un factor pro-esteatótico en los hepatocitos y su expresión contribuye en la progresión del hígado graso inducido por la obesidad. La eliminación del gen para este receptor nuclear en los hepatocitos, y en menor medida en los macrófagos, protege a los ratones frente al modelo de obesidad y esteatosis inducido por una dieta rica en grasa. Los experimentos in vitro en cultivos de cortes de alta precisión de hígado (CAPH) y cultivos primarios de hepatocitos demostraron que el agonista de PPARgamma (rosiglitazona) induce la acumulación intrahepática de triglicéridos, un efecto que fue bloqueado por el antagonista de PPARgamma BADGE. Finalmente, observamos que los hepatocitos y los cultivos de CAPH de ratones deficientes para PPARgamma en hepatocitos presentaron una respuesta mitigada frente al estímulo proesteatotico de ácido oleico. En el segundo estudio se examinó el papel específico de PPARgamma en la respuesta aguda y crónica frente un agente hepatotóxico (CCl4). Se observó que la deleción de PPARgamma en los macrófagos y CK origina una respuesta inflamatoria exacerbada que conduce a la acentuación del daño hepático y la fibrogénesis. Estos hechos se confirmaron in vitro en cultivos de CAPH de los ratones control y deficientes para PPARgamma en los macrófagos/CK tras someterlos a un estímulo inflamatorio agudo con LPS. Curiosamente, los ratones KO condicionales en los hepatocitos mostraron menor daño hepático frente al modelo crónico de CCl4, y se observó una protección parcial frente el daño agudo hepático a través de CCl4 o el estímulo con LPS en cultivos de CAPH. Al evaluar la respuesta de los ratones KO condicionales en las CHE frente al modelo crónico de daño hepático se observó daño hepático exacerbado y una respuesta fibrogénica agravada, por lo que la expresión de PPARgamma en las CHE también ejerce un papel antifibrótico importante. En conclusión, nuestros hallazgos sugieren la existencia de roles divergentes específicos de célula e incluso funciones opuestas para PPARgamma en la patogénesis de la EHGNA y el daño hepático. / PPARgamma plays an essential role in the transcriptional regulation of genes involved in lipid and glucose metabolism, insulin sensitivity and inflammation. In the project we investigated hepatic PPARgamma function by using Cre-loxP technology to generate hepatocyte (Albumin-Cre), macrophage (LyzM-Cre) and hepatic stellate cells (aP2-Cre) -specificPPARgamma conditional knockout mice. In the first study published in FASEB Journal (2011), we provided evidence that PPARgamma plays a causative role in hepatocyte lipid deposition, contributing to the pathogenesis of hepatic steatosis. Targeted deletion of PPARgamma in hepatocytes (and to a lesser extent in macrophages) protected mice against high-fat diet model. We demonstrated that Rosiglitazone (insulin sensitized drug) increased oleic acid-induced steatosis in both liver slices and primary hepatocytes, we provided rosiglitazone not only activates hepatic PPARgamma but also induces its expression. In the second study published in Journal of Hepatology (Nov 2013), we studied the role of PPARgamma in inflammatory and fibrogenic liver injury. Our results revealed that inflammatory and fibrogenic responses to chronic exposure to CCl4 are exacerbated in mice with macrophage-specific disruption ofPPARgamma . The deleterious effects of PPARgamma  disruption in liver macrophages were confirmed in an acute model of CCl4 injury as well as in PCLS incubated with LPS. Importantly, hepatic stellate cells-specific PPARgamma knockout mice also showed exacerbated liver damage and fibrogenic response to CCl4. In summary, these data suggest that PPARgamma exerts specific cell roles and even opposing functions in the pathogenesis of NAFLD and liver damage. While PPARgamma in hepatocytes is a pro-steatotic factor but it also has antiinflammatory and antifibrogenic roles in non-parenchymal liver cells in NAFLD’s progression.

Glucocorticoids (GC) induce cell cycle arrest and apoptosis in different cell types and therefore are widely used to treat a variety of diseases including autoimmune disorders and cancer. This effect is mediated by the GC receptor (GR), a ligandactivated transcription factor that translocates into the nucleus where it modulates transcription of target genes in a promoter-specific manner. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3) regulates GR response by genomic and nongenomic mechanisms, although the specific role of each isoform is not well defined. We used GSK3 pharmacological inhibitors and isoform-specific small interfering RNA to evaluate the role of GSK3 in the genomic regulation induced by GC. The study was made in cell lines from different origin. GSK3 inhibition reverted GC-induced apoptosis by preventing GC-dependent MCL-1 downregulation and caspase-3 and -9 activation. GSK3 inhibition also resulted in the reduction of GC-induced mRNA expression of GC-induced genes such as BIM, HIAP1, and GILZ. Knockdown of GSK3β but not GSK3α reduced endogenous GILZ induction in response to dexamethasone and GRdependent reporter gene activity. Interestingly, GSK3 inhibition did not affect GCinduced transrepression. Chromatin immunoprecipitation experiments revealed that GSK3 inhibition impaired the dexamethasone-mediated binding of GR and RNA polymerase II to endogenous GILZ promoter through a mechanism that affects GR protein localization by decreasing early GR nuclear levels. These results indicate that GSK3β is important for GR transactivation activity and that GSK3β inhibition suppresses GC-stimulated gene expression. Furthermore, we show that genomic regulation of the GR by GSK3 occurs through a mechanism not involving known GSK3β phosphorylation sites. We propose that GC-dependent transcriptional activation requires functional GSK3β signaling and that altered GSK3β activity influences cell response to GC. / Los glucocorticoides (GC) inducen la parada del ciclo celular y la apoptosis en diferentes tipos de células y por lo tanto se utilizan ampliamente para tratar una gran variedad de enfermedades incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer. Este efecto es mediado por el receptor de GC (GR), un factor de transcripción activado por ligando que transloca al núcleo donde modula la transcripción de genes diana de una manera específica de promotor. La glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3) regula la respuesta del GR por medio de mecanismos genómicas y no genómicas, aunque la función específica de cada isoforma no está bien definida. En este estudio se utilizaron inhibidores farmacológicos de la GSK3 y siRNAs específicos de cada isoforma para evaluar el papel de la GSK3 en la regulación génica inducida por los GC. La inhibición de la GSK3 resultó en la reducción de la expresión de ARNm inducida por GC de genes tales como BIM, HIAP1, y GILZ. El silenciamiento de la GSK3β pero no de la GSK3α redujo la inducción endógena de GILZ en respuesta a la dexametasona y la actividad luciferasa dependiente del GR. Curiosamente, la inhibición de la GSK3 no afectó la transrepresión inducida por GC. Los experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina revelaron que la inhibición de la GSK3 afecta la unión mediada por la dexametasona del GR y la ARN polimerasa II en el promotor endógeno de GILZ a través de un mecanismo que afecta la localización de la proteína del GR por medio de la disminución sus niveles nucleares. Estos resultados indican que la GSK3 es importante para la actividad de transactivadora del GR y que la inhibición de la GSK3 suprime la expresión génica estimulada por los GC. Además, se demuestra que la regulación genómica del GR por la GSK3 ocurre a través de un mecanismo que no implica los sitios conocidos de fosforilación por la GSK3. Por lo tanto, proponemos que la activación transcripcional dependiente de GC requiere una señalización funcional de la GSK3ß y que la alteración de la actividad de la GSK3β influye en la respuesta celular a los GC.

This study provides a baseline data description of 117 individuals, a prospective approach and a therapeutical performance analysis of 83 individuals with cardiovascular risk factors in order to establish the strength of association of hearing with endothelial function. The main objective is to study the association of the auditory function of patients with high cardiovascular risk with the endothelial function and the arterial stiffness, measured at small arteries, before and after one-year lifestyle intervention. The most relevant conclusions of the study are: 1. A major arterial stiffness and therefore a high increase rate corresponds with a worst hearing function. 2. The endothelial function measured by the hyperaemic reactivity rate shows no relationship with the auditory function. 3. Changes in lifestyle for a year did not contribute to improve neither the vascular risk factors nor the vascular function parameters and therefore no hearing function improvement was observed. 4. Patients with cardiovascular risk factors have worse hearing function than individuals without risk factors. 5.The alteration of the hearing function is associated in a statistically significant way to the presence of hipertriglyceridemia, high abdominal circumference and high ApoB levels. 1. In this study hearing loss was directly associated to the increase of E-selectin, showing no relationship with other biochemical parameters of oxidative stress, inflammation and endothelial dysfunction. 2. Arterial stiffness and abdominal circumference were the main determinants of auditory function. / Se trata de un estudio descriptivo de los datos basales que consta de 117 individuos y prospectivo y de actuación terapéutica sobre 83 individuos con factores de riesgo cardiovascular para establecer la fuerza de asociación de la audición con la función endotelial. El objetivo principal es estudiar la asociación de la función auditiva de pacientes con elevado riesgo cardiovascular con la función endotelial y la rigidez arterial medidas en las arterias de pequeño calibre antes y después de intervención de un año sobre el estilo de vida. Las conclusiones más relevantes del estuido son: 1. Una mayor rigidez arterial y por tanto un índice de aumento elevado se corresponde con una peor función auditiva. 2. La función endotelial medida por el índice de reactividad hiperémica no muestra relación con la función auditiva 3. Los cambios en los hábitos de vida durante un año no supusieron una mejoría de los factores de riesgo vascular ni de los parámetros de función vascular, consecuentemente tampoco observamos mejoría en la función auditiva. 4. Los pacientes con factores de riesgo cardiovascular tienen peor función auditiva que los individuos sin factores de riesgo. 5. La alteración de la función auditiva se asocia de forma estadísticamente significativa a la presencia de hipertrigliceridemia, perímetro abdominal elevado y APOB elevada. 6. La pérdida de audición en nuestro estudio se asoció de forma directa con el incremento de E-selectina, no mostrando relación con el resto de parámetros bioquímicos de estrés oxidativo, inflamación y disfunción endotelial. 7. Las rigidez arterial y el perímetro abdominal fueron los principales determinantes de la función auditiva

No description available.

In the last years our research has been focused on analyzing the signaling pathways induced by TGF-β in liver tumor cells, to understand the molecular mechanisms that confer resistance to its suppressor effects. TGF-β induces apoptosis in fetal and neonatal murine hepatocytes, as well as in liver tumor cells, and chronic exposure of these cells to TGF-β iinduces a process of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT). In the present work we wanted to identify TGF-β-regulated genes that being involved in EMT and cell invasion could also participate in the control of growth, apoptosis and/or differentiation. Firstly we analyzed the role of genes regulated by TGF-β and implicated in EMT that might participate in apoptosis control in hepatocytes, focusing on Snail and SPARC. Inhibition of Snail, through targeting knock-down with specific siRNA, impairs TGF-β-induced EMT in murine hepatocytes and significantly enhances their apoptotic response, which indicates that Snail plays a relevant role in conferring resistance to TGF-β-induced cell death. TGF-β also induces anti-apoptotic signals, mediated by the activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). Snail downregulation impairs the TGF-β-induced EGFR ligands expression and inhibits the phosphorylation of Akt, Erks and c-Src family, which is coincident with activation of mitochondrial-dependent apoptotic events and an earlier Smad3 phosphorylation in TGF-β-treated cells. We also demonstrate a role for Snail in sensitizing murine hepatocytes to cell death by anoikis, which is a relevant phenomenon in metastatic processes. Snail1 downregulation in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells, which are partially or fully resistant to TGF-β suppressor effects, restores the apoptotic response to TGF-β. TGF-β induces SPARC expression in FaO rat liver tumor cells but not in neonatal murine untransformed hepatocytes. SPARC inhibition, through targeting knock-down with specific siRNA, reveals a role for SPARC in mediating TGF-β-induced EMT in liver tumor cells. Furthermore, SPARC knock-down significantly enhances the TGF-β-induced apoptotic response. Interestingly, SPARC effects might be mediated by Snail, since SPARC silencing impairs Snai1 up-regulation by TGF-β in FaO cells. We next wanted to study the tumorigenesis of FaO cells after in vitro chronic treatment with TGF-β for 4 weeks (TβT-FaO). For this, we injected these cells through both subcutaneous and intrasplenic procedures. Liver tumor formation derived from intrasplenic injection of FaO cells induced a multifocal highly proliferative hepatocarcinoma in all mice, whereas parallel inoculation of TβT-FaO cells promoted low proliferative unifocal and heterogeneous hepatic lesions which showed higher staining for phospho-Smad2. Detailed analysis of tumors revealed lesions with bile duct characteristics and lesions with a dedifferentiated (hepatoblast) phenotype. Primary culture of tumor cells from both FaO- and TβT-FaO-induced intrasplenic lesions indicated that only cells obtained from FaO-induced tumors undergo apoptosis in response to TGF-β, whereas TβT-FaO-derived tumors contain cells that are fully resistant. Analysis of the phenotype of tumors and their derived cells showed that intrasplenic injection of TβT-FaO cells may produce cholangiocarcinoma-like and hepatoblastoma-like tumors. In summary, chronic in vitro TGF- β treatment of FaO cells changed their tumorigenic potential. Tumor growth was slower but cells are resistant to apoptosis. Futhermore, phenotype of lesions reflected a stem-like phenotype which provokes the appearance of less differentiated tumors (hepatoblastomas) or transdifferentiation to a different liver tumor lineage (cholangiocarcinomas). / En el trabajo actual hemos querido identificar genes regulados por TGF-β que estando implicados en EMT e invasión celular puedan también participar en el control del crecimiento, apoptosis y/o diferenciación, centrándonos en Snail y SPARC. La inhibición de la expresión de Snail impide la EMT inducida por TGF-β en hepatocitos murinos y aumenta su respuesta apoptótica, indicando un papel importante de Snail confiriendo resistencia a la muerte inducida por TGF-β. El TGF-β también induce señales anti-apoptóticas, mediadas por la activación del EGFR. La cancelación de Snail impide la inducción mediada por TGF-β de los ligandos del EGFR e inhibe la fosforilación de Akt, ERKs y familia c-Src, hecho coincidente con la activación de eventos apoptóticos dependientes de la mitocondria y con una fosforilación temprana de Smad3 en las células tratadas con TGF-β. También demostramos el papel de Snail en la sensibilización de los hepatocitos a la muerte celular por anoikis. La disminución de los niveles de Snail1 en células de carcinoma hepatocelular humano (HCC), restaura la respuesta apoptótica al TGF-β. El TGF-β induce la expresión de SPARC en las células tumorales FaO de hepatoma de rata pero no en los hepatocitos neonatales murinos no transformados. La inhibición de la expresión de SPARC revela un papel de SPARC en la inducción de EMT y en la respuesta apoptótica mediada por TGF-β en células tumorales hepáticas. A continuación quisimos estudiar el potencial tumorogénico de las células FaO después de un tratamiento in vitro crónico con TGF-β durante 4 semanas (TβT-FaO). Inyectamos estas células en ratones inmunodeprimidos para provocar la formación de tumores tanto subcutáneos como ortotópicos (inyección intraesplénica). La inoculación intraesplénica de células FaO indujo un carcinoma hepatocelular multifocal altamente proliferativo en todos los ratones, mientras que la inoculación paralela de células TβT-FaO promovió la formación de lesiones unifocales, heterogéneas y con baja proliferación que mostraron un fuerte marcaje para Smad2 fosforilado. Un análisis detallado de los tumores mostró lesiones con características de ducto biliar y lesiones con un fenotipo desdiferenciado (hepatoblastos). El cultivo primario de las células provenientes de estos tumores indicó que sólo las células obtenidas de los tumores FaO sufren apoptosis en respuesta al TGF-β, mientras que los tumores derivados de los TβT-faO contienen células que son completamente resistentes. En resumen, el tratamiento crónico in vitro con TGF-β de las células FaO cambió su potencial tumorogénico. El crecimiento tumoral fue más lento pero las células son resistentes a la apoptosis. Además, el fenotipo de las lesiones refleja un fenotipo tipo célula progenitora que provoca la aparición de tumores menos diferenciados o la transdiferenciación a una línea tumoral hepática distinta.

La tesi que es presenta tracta l’estudi cinemàtic i dinàmic de la marxa humana mitjançant tècniques de dinàmica de sistemes multisòlid. Per a aquest propòsit, s’utilitzen dos models biomecànics: un model pla format per 11 segments i 14 graus de llibertat i un model tridimensional format per 18 segments i 57 graus de llibertat. La formulació dinàmica multisòlid ha estat desenvolupada en coordenades mixtes (naturals i relatives). La marxa de l’individu s’enregistra al laboratori utilitzant un sistema de captura del moviment mitjançant el qual s’obté la posició de cadascun dels 37 marcadors situats sobre el cos del subjecte. Les dades de posició es filtren utilitzant un algorisme basat en el singular spectrum analysis (SSA) i les coordenades naturals del model es calculen mitjançant relacions algebraiques entre les posicions dels marcadors. Posteriorment, un procés de consistència cinemàtica assegura les restriccions de sòlid rígid. El processament cinemàtic continua amb l’aproximació de les posicions mitjançant corbes B-spline d’on se n’obtenen, per derivació analítica, els valors de velocitat i acceleració. En una anàlisi dinàmica inversa de la marxa humana, s’acostumen a utilitzar com a dades d’entrada els paràmetres antropomètrics (geomètrics i inercials) dels segments, les dades cinemàtiques i les mesures de les plaques de força. En contraposició al que fan la majoria d’autors, en aquesta tesi, les mesures de les plaques de força no són utilitzades directament en l’anàlisi sinó que només s’usen per solucionar el problema del repartiment del torsor resultant de les forces de contacte durant la fase de doble suport. En aquesta fase, els dos peus es recolzen sobre el terra i les mesures cinemàtiques són insuficients per determinar el torsor en cada peu. El nou mètode de repartiment que es proposa (anomenat contact force plate sharing, CFP) és una de les aportacions de la tesi i destaca pel fet que permet determinar un conjunt de forces i moments dinàmicament consistents amb el model biomecànic, sense haver de modificar-ne les coordenades cinemàtiques ni afegir forces o moments residuals en algun dels segments. Encara dins l’àmbit de l’estudi dinàmic invers, s’ha analitzat la sensitivitat dels parells articulars a errors comesos en estimar els paràmetres antropomètrics, a errors que poden contenir les mesures de les plaques de força i a errors que es poden cometre en el processament cinemàtic de les mesures. L’estudi permet concloure que els resultats són molt sensibles als errors cinemàtics i a les forces mesurades per les plaques, sent els errors en els paràmetres antropomètrics menys influents. La tesi també presenta un nou model tridimensional de contacte peu-terra basat en el contacte esfera-pla i els seus paràmetres s’estimen mitjançant dos enfocaments diferents basats en tècniques d’optimització. El model s’utilitza com un mètode alternatiu per solucionar el problema del repartiment durant la fase de doble suport en dinàmica inversa, i també s’utilitza en simulacions de dinàmica directa per estimar les forces de contacte entre el model biomecànic i el seu entorn. En l’anàlisi dinàmica directa és necessària la implementació d’un controlador que està basat, en aquest cas, en el filtre de Kalman estès. Les contribucions més importants de la tesi, en el cas de l’anàlisi dinàmica inversa, es centren en el mètode CFP i en l’ús del model de contacte per solucionar el repartiment de forces de contacte en la fase de doble suport. Referent a l’anàlisi de la influència dels errors en les dades d’entrada del problema dinàmic invers, la modelització estadística dels errors conjuntament amb la pertorbació conjunta de més d’un paràmetre antropomètric a la vegada (mantenint constant l’alçada i el pes de la persona) és també una novetat. Per altra banda, el model de contacte presentat és també una contribució original. En l’estat de l’art actual no es troben models que usin dades reals capturades al laboratori i que a la vegada s’utilitzin per solucionar el problema de repartiment en el doble suport i per simular el contacte peu-terra en una anàlisi dinàmica directa. Finalment, el fet de desenvolupar un model que s’utilitzi tant per a l’anàlisi dinàmica directa com inversa és també una de les aportacions d’aquesta tesi. Tot i que les dues anàlisis, per separat, són temes de recerca comuns en l’àmbit de la Biomecànica, es troben a faltar estudis que comprovin la validesa dels resultats que se n’obtenen. En aquesta tesi, els resultats de la dinàmica inversa s’han utilitzat com a dades d’entrada de l’anàlisi dinàmica directa, el resultat de la qual (el moviment) ha pogut ser comparat amb el que s’obté de la captura del laboratori (entrada de la dinàmica inversa). D’aquesta manera, el cercle es tanca i es pot verificar la validesa tant dels models com dels resultats obtinguts. / This thesis presents the kinematic and dynamic study of human motion by means of multibody system dynamics techniques. For this purpose, two biomechanical models are used: a 2D model formed by 11 segments with 14 degrees of freedom, and a 3D model that consists of 18 segments with 57 degrees of freedom. The movement of the subject is recorded in the laboratory using a motion capture system that provides the position along time of 37 markers attached on the body of the subject. Position data are filtered using an algorithm based on singular spectrum analysis (SSA) and the natural coordinates of the model are calculated using algebraic relations between the marker positions. Afterwards, a kinematic procedure ensures the kinematic consistency and the data processing continues with the approximation of the position histories using B-spline curves and obtaining, by analytical derivation, the velocity and acceleration values. This information is used as input of an inverse dynamic analysis. Differing to most published works, in this thesis the force plates measurements are not used directly as inputs of the analysis. When both feet contact the ground, kinematic measurements are insufficient to determine the individual wrench at each foot. One of the contributions of the thesis is a new strategy that is proposed to solve the this indeterminacy (called corrected force plate sharing, CFP) based on force plates data. Using this method, a set of two contact wrenches dynamically consistent with the movement are obtained with no need neither to add residual wrenches nor to modify the original motion. Also in the IDA field, the sensitivity of the joint torques to errors in the anthropometric parameters, in the force plate measurements and to errors committed during the kinematic data processing is studied. The analysis shows that the results are very sensitive to errors in force measurements and in the kinematic processing, being the errors in the body segment parameters less influential. A new 3D foot-ground contact model is presented and its parameters are estimated using optimization techniques. The model is used as an alternative method to solve the mentioned sharing problem during the double support phase and it is also used, in a forward dynamic analysis, to estimate the contact forces between the biomechanical model and its environment. The forward dynamic simulation requires the implementation of a controller that is based, in this case, on the extended Kalman filter. The most important contributions of the thesis in IDA are focused on the CFP sharing method and regarding the analysis of the influence of errors in input data on the inverse dynamics results, the statistical modelling of the uncertainties together with the perturbation of more than one parameter at same time (remaining height and weight as a constant parameters) is also new in the literature. Moreover, the presented foot-ground contact model is also original. In the current state of the art, there are no models that use real data captured in the laboratory to solve the contact wrench sharing problem during the double support phase. Furthermore, there are few studies simulating the foot-ground interaction in a forward dynamic analysis using a continuous foot-ground contact model. Finally, developing a model that is used for both forward and inverse dynamic analysis is a relevant aspect of the methodology used. Although the two approaches separately are common research topics in the field of biomechanics, a small number of studies prove the validity of the obtained results. In this thesis, the results of the inverse dynamics are used as input data for the forward dynamic analysis, and the results of the latter (the motion) have been compared with the motion capture in the laboratory (input of the inverse dynamics analysis). Thus, the circle has been closed which allows us to validate the accuracy of both the models and the obtained results.

Antecedents del tema: La mesura de la força muscular es molt útil en la rehabilitació. Tant per planificar-la com per monitoritzar-la. Igualment es una eina fonamental en l’avaluació del dany corporal o seqüeles. La dinamometria isocinètica és una eina fiable de mesura de la força muscular dinàmica. No obstant per la seva validesa s’ha de garantir que el subjecte avaluat faci un esforç màxim. En certes poblacions (com ara els pacients laborals) avaluar el nivell de col•laboració durant la realització d'una prova esdevé crucial per les possibles implicacions mèdico-legals. En diferents articulacions i accions i, en concret, pel que fa a rotadors externs d'espatlla s'ha trobat que la diferència entre les ràtios excèntric-concèntric a velocitat alta i baixa (DEC) és un bon paràmetre per identificar esforços submàxims en una població de voluntaris sans. No obstant això, no es tenen dades sobre la seva utilitat en pacients laborals reals. Hipòtesi: El DEC és un paràmetre vàlid per estimar el nivell de col•laboració durant la realització d'una prova isocinètica de rotadors externs a una població de pacients laborals reals. Objectius: Analitzar el comportament, i eventual utilitat, del DEC en una mostra de pacients reals afectats de patologia de l'espatlla i avaluats mitjançant dinamometria isocinètica al final del procés de rehabilitació. Metodologia: Estudi observacional de 74 pacients laborals amb patologia musculoesquelètica d'espatlla avaluats mitjançant dinamometria isocinètica de rotadors externs al costat afecte i contralateral. La prova es realitza a 30º/s i 120º/s a modalitat concèntrica i excèntrica .Es recullen dades demogràfiques (edat, sexe i pes), clíniques (diagnòstic, durada del procés i situació funcional a l'alta) i dinamomètriques (Pic de moment de força, Ràtios excèntrics concèntrics, DEC i dèficits comparant extremitat afecta i sana). Les dades s'analitzen per separat per a dones i homes i en relació al resultat del DEC. Resultats: Utilitzant el nivell de tall de DEC marcat per l'estudi previ en subjectes sans (0.81) la proporció de pacients etiquetats de no col•laboradors, especialment dones, era enorme. Per tant es va decidir usar els valors de l'extremitat sana per avaluar l'afectació. Aplicant aquest criteri, cinquanta-dos pacients van mostrar el costat afecte uns valors de DEC dins dels rangs considerats com normals i, per tant, es van etiquetar de col• laboradors. Deu tenien uns DEC superiors al límit superior i es van considerar no col•laboradors. Finalment hi havia 12 pacients amb uns valors de DEC extremadament baixos que es van considerar com no col•laboradors. La comparació entre sexes va mostrar una gran diferència significativa proporció de col•laboradors a favor dels homes . En els col•laboradors els dèficits registrats dels pacients sense incapacitat al final del procés mostraven uns valors molt significativament més baixos que els pacients que van acabar en incapacitat. Conclusions: El DEC pot ser una bona eina pel mesurament del nivell de col•laboració -i per tant per assegurar la validesa- durant la realització d'una prova isocinètica de rotadors externs d'espatlla en pacients laborals. No obstant això, es necessiten més estudis en dones i poblacions no laborals per definir millor la seva utilitat. La validesa de la dinamometria isocinètica, i implícitament la del DEC, en poblacions laborals es indicada per relació significativa entre els dèficits de força analitzats i el nivell d’incapacitat. / Introduction: Muscle strength measurement is crucial in rehabilitation Planning and results assessment. Isokinetic dynamometry is a reliable and valid strength measurement tool. However, its validity depends on the veracity of the measurements. Among other factors, patient collaboration during test performance is crucial. Thus an estimate of collaboration is highly desirable. The DEC (High and low velocity eccentric to concentric ratios difference) has been proven to be an efficient tool to assess maximility of effort in a number of joints and actions. However, its usefulness in real patient shoulder external rotator effort measurement has not been previously assessed. Hypothesis: The DEC is a valid parameter to assess the collaboration level in work injury patient during shoulder external rotator isokinetic tests. Objectives: to analyze DEC behavior and usefulness in maximality of effort assessment in a sample of shoulder work injury patient undergoing rehabilitation. Methods: Observational study of 74 shoulder injury patients evaluated through shoulder external rotator isokinetic tests. Concentric and eccentric performances of injured and uninjured sides were recorded at 30 and 120º/s. Results: Fifty-two patients had their injured side DEC values within the normal range and were thus labeled as maximal performers. Ten patients had higher than cutoff DEC values, indicating submaximal effort whereas 12 patients had exceedingly low DEC values. Gender comparison showed a significantly different proportion of maximal performers. Strength deficits registered in patients demonstrating maximal performance correlated with the final outcome. The findings support the application of the DEC for determination of the extent of weakness of shoulder external rotators in male patients. Conclusion: In terms of shoulder external rotators status in male worker injury, the results support the application of isokinetic tests both in the clinical and medico legal sense. However, the gender discrepancy warrants further research.

The primary goals of this study were to develop a cell-free in vitro assay for the assessment of nonthermal electromagnetic (EMF) bioeffects and to develop theoretical models in accord with current experimental observations. Based upon the hypothesis that EMF effects operate by modulating Ca2+/CaM binding, an in vitro nitric oxide (NO) synthesis assay was developed to assess the effects of a pulsed radiofrequency (PRF) signal used for treatment of postoperative pain and edema. No effects of PRF on NO synthesis were observed. Effects of PRF on Ca2+/CaM binding were also assessed using a Ca2+-selective electrode, also yielding no EMF Ca2+/CaM binding. However, a PRF effect was observed on the interaction of hemoglobin (Hb) with tetrahydrobiopterin, leading to the development of an in vitro Hb deoxygenation assay, showing a reduction in the rate of Hb deoxygenation for exposures to both PRF and a static magnetic field (SMF). Structural studies using pyranine fluorescence, Gd3+ vibronic sideband luminescence and attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy were conducted in order to ascertain the mechanism of this EMF effect on Hb. Also, the effect of SMF on Hb oxygen saturation (SO2) was assessed under gas-controlled conditions. These studies showed no definitive changes in protein/solvation structure or SO2 under equilibrium conditions, suggesting the need for real-time instrumentation or other means of observing out-of-equilibrium Hb dynamics. Theoretical models were developed for EMF transduction, effects on ion binding, neuronal spike timing, and dynamics of Hb deoxygenation. The EMF sensitivity and simplicity of the Hb deoxygenation assay suggest a new tool to further establish basic biophysical EMF transduction mechanisms. If an EMF-induced increase in the rate of deoxygenation can be demonstrated in vivo, then enhancement of oxygen delivery may be a new therapeutic method by which clinically relevant EMF-mediated enhancement of growth and repair processes can occur.