A Leucemia Mieloide Aguda (LMA) é uma neoplasia originada a partir da expansão clonal de blastos da linhagem mieloide em medula óssea, sangue periférico e outros tecidos. Entre as mutações mais frequentemente detectadas nas LMAs, se encontra a mutação do tipo duplicação interna em tandem (FLT3-ITD) que é detectada em aproximadamente 25% dos pacientes adultos. Esta mutação no receptor de tirosina quinase FLT3 é uma inserção de 3 a 400 pares de base na região juxtamembrana do receptor, a qual é responsável pelo controle da atividade enzimática dos domínios tirosina quinase. Quando esta mutação se encontra presente, a região juxtamembrana perde a capacidade de controlar a ativação dos domínios tirosina quinase e o receptor fica constitutivamente ativo conferindo uma vantagem proliferativa ao clone leucêmico. Esta mutação é considerada de mal prognóstico e já foram desenvolvidos inibidores de tirosina quinase específicos para o receptor FLT3 (FLT3 TKI). Porém, os resultados dos primeiros ensaios clínicos não apresentaram a efetividade esperada e continua a busca de novas combinações de drogas que contribuam a aumentar a efetividade destes inibidores. É por isso que este trabalho teve por objetivo testar a combinação de FLT3 TKIs com o ácido trans-retinoico (ATRA) já aplicado no tratamento da Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) com PML-RARA. A combinação de FLT3 TKIs com ATRA induziu a morte celular programada de forma precoce tanto na linhagem de LMA MV4-11 como na MOLM-13. Esta morte celular observada foi inibida com pré- tratamento com inibidor de caspases QVD. O tratamento combinado in vivo em camundongos Nod Scid Gamma (NSG) transplantados com células MOLM-13, aumentou a sobrevida dos animais e diminuiu a percentagem de células CD45 humanas em medula óssea, baço e sangue periférico. No seu conjunto, nossos dados sugerem que o ATRA aumenta o efeito citotóxico dos FLT3-TKIs. Este achado poderá ser relevante para o tratamento de pacientes com LMA portadores de mutaçãoes ITD no gene FLT3 / Acute Myeloid Leukemia (LMA) is hematological disease that arises from the clonal expansion of a myeloid blast in bone marrow, peripheral blood and other tissues. Among LMAs mutations most frequently detected, 25% of adult patients carry the FLT3-ITD mutation. This mutation is a pair base insertion of 3 to 400 in the juxtamembrane domain of the receptor and leads to the constitutive activation of the kinase domains. It gives the leukemic clone a proliferative advantage and it is associated with a bag prognosis. FLT3 tyrosine kinase inhibitors (FLT3 TKI) were already developed in order to improved patients\' treatment. However, results from the first clinical trials were not as promising as expected. Therefore, there is still room for testing new drug combinations that could improve FLT3 TKIs efficacy. The main objective of this work was to test FLT3 TKIs in combination with all-trans retinoic acid (ATRA) already used in Acute Promyelocytic Leukemia (APL) with PMLRARA treatment. The combination of FLT3-TKIs and ATRA induced early programmed cell death in both the MV4-11 and MOLM-13 LMA lines. This early cell death was inhibited with QVD caspase inhibitor pre-treatment. In vivo combined treatment in Nod Scid Gamma (NSG) mice transplanted with MOLM-13 cells, increased animals survival and decreased the percentage of human CD45 cells in bone marrow, spleen and peripheral blood. Taken together, our data suggest that ATRA increases the cytotoxic effect of FLT3- TKIs. This finding may be relevant for the treatment of patients with AML with ITD mutations in the FLT3 gene

Nous avons étudié la régulation et les fonctions de Cell division cycle 25A (CDC25A), phosphatase impliquée dans l'activation des cyclin-dependent kinases durant le cycle cellulaire, dans les leucémies aiguës myéloïdes portant la mutation de la tyrosine kinase Fms-Like Tyrosine kinase 3 (FLT3) FLT3-ITD, de mauvais pronostic. Nous montrons que CDC25A est une cible précoce en aval de FLT3-ITD, contrairement aux autres protéines du cycle cellulaire, par un mécanisme impliquant STAT5. L'inhibition de CDC25A était à l'origine d'une inhibition de la prolifération et d'une réinduction de la différenciation des cellules primaires ou de lignées FLT3-ITD, in vitro et in vivo, en faisant une cible prometteuse dans les LAM avec la mutation FLT3-ITD. Enfin, nous avons évalué la valeur pronostique de l'expression de CDC25A au niveau ARN messager et protéique sur une série de patients traités au CHU de Toulouse par chimiothérapie intensive. / We studied the regulation and functions of Cell division cycle 25A (CDC25A), a phosphatase involved in the activation of the cyclin-dependent kinases during the cell cycle, in acute myeloid leukemia baring the mutation of the tyrosine kinase Fms-Like Tyrosine kinase 3 (FLT3) FLT3-ITD, which confers adverse prognosis. We show that CDC25A is an early target downstream of FLT3-ITD, contrarily to other cell cycle proteins, by a mechanism involving STAT5. CDC25A inhibition gives rise to inhibition of proliferation and reinduction of differentiation in FLT3-ITD primary cells and FLT3-ITD cell lines, in vitro and in vivo. CDC25A appears as a promising target in FLT3-ITD acute myeloid leukemia. We finally evaluated the prognostic value of CDC25A expression, at the mRNA and proteic level in a series of patients treated by intensive chemotherapy at Toulouse University Hospital.

Les mutations FLT3-ITD et KITD816V sont fréquemment retrouvées dans les leucémies aiguës myéloïdes où elles sont associées à un pronostic défavorable. Ces deux récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) mutés sont des acteurs clés de la leucémogenèse régulant la prolifération, la survie et la différenciation cellulaire. L'objectif de ce travail de thèse a été d'étudier la régulation de l'expression protéique de FLT3 en réponse aux inhibiteurs du protéasome, le rôle de l'autophagie dans les LAM KITD816V et l'impact du 2-deoxy-D-glucose sur la localisation intracellulaire des récepteurs. Les travaux réalisés ont démontré trois manières originales de cibler des cellules portant les oncogènes FLT3-ITD ou KIT en jouant sur leur dégradation, leur localisation intracellulaire et l'autophagie. / FLT3-ITD and KITD816V mutations are recurrently found in acute myeloid leukemia, where they are associated with a poor prognosis. These two Tyrosine Kinase Receptors (TKR) are involved in leukemogenesis, regulating proliferation, survival and cell differentiation. The aim of this thesis was to study the regulation of FLT3 protein expression in response to proteasome inhibitors, the role of autophagy in KITD816V-driven AML and the impact of 2-deoxy-D-glucose (2-DG) on the intracellular localization of TKRs. Our studies investigated three original ways to target cells bearing FLT3-ITD or oncogenic KIT mutations playing on their degradation, intracellular localization and autophagy.

Loss of heterozygosity (LOH) is detectable in many forms of cancer including leukaemia. It contributes to tumorigenesis through the loss of one of the two alleles of one tumor suppressor gene at a given locus, caused by deletion or uniparental disomy (UPD). UPD can only be the result of homologous recombination. Little is known about the mechanisms of UPD and what connection this aberration has with the outcome of this disease. In this study, 146 patients with primary AML were analysed using a novel technique based on single nucleotide polymorphisms (SNPs). Leukaemic cells and healthy T-cells from each patient were obtained using FACS-Vantage cell sorting. In cases with very few sorted cells whole genome preamplification was done. Genome-wide SNP analysis was carried out according to the standard GeneChip Mapping Assay protocol (Affymetrix, USA) using the Human Mapping 10K Arrays. Moreover, the impact of the FLT3-ITD mutation on the homologous recombination using pmHPRT-DRGFP /pCbASce vectors system and yHA2x assay was investigated. Of 146 patients with normal karyotype LOH was found in 30 cases. The potential LOH regions, were confirmed by microsatellite analysis of short tandem repeat (STR) markers. In 21 of these cases STR-analysis of T-cells, representing the corresponding tumor-free material, confirmed the regions of partial UPD. This aberration affected different chromosomes, but most commonly chr. 2, 6, 11, 21, 13, and 7, and covered between 11.5 and 88 Mb. Interestingly, in 6 LOH cases, long stretches of homozygosity present at the same positions as in the healthy cells and in the blasts were found. The impact of this phenomenon is unknown. Additionally, chromosome losses were detected in 3 patients classified with normal karyotype according to current methods. These 9 cases were not included in the UPD positive group. No differences were observed regarding any clinical factors including age, WBC-counts and sex. The FAB M1 subtype was observed in 47.6% of the UPD positive patients, compared to only 19.2% of the UPD negative patients (P=0.04, n=146). In addition, no correlation between FLT3-ITD, MLL-PTD and NPM1 mutations in the UPD patients was found, but the data indicate that patients with UPD have a higher rate of treatment failure. Moreover, in this study the relationship between UPD and gene aberrations was able to be confirmed. In some cases, UPD found on chromosomes 21, 19 and 11 was correlated with mutations in the RUNX1, CEBPA and WT genes, respectively. Furthermore, AML cases with and without UPD showed different but specific gene expression profiles, revealing different expression levels for genes involved in double strand break repairs. Furthermore, it was found that different mutations could be responsible for the increase in efficiency of HR, such as FLT3-ITD or BCR-ABL. Moreover, cells with a FLT3-ITD mutation (without wt expression) rapidly increased the HR efficiency compared with heterozygous (FLT3-ITD/wt) cells. Preliminary results showed that the high repair efficiency was mainly dependent on the translocation of RAD51. In conclusion, SNP array technology allow the identification and mapping of LOH in AML patients with normal karyotype. The obtained data also point out the necessity of analysing tumour-free material to confirm the somatic origin of the alteration. Furthermore, the available results indicate that compared to patients without UPD, patients with UPD have a higher relapse rate, which might be used as a prognostic marker in the future. Also, it could be hypothesized that downregulation of RAD51 (for example by FLT3 inhibition) might be beneficial DNA damage occurs through the genotoxic agent by reducing the relapse risk of AML.

Die Erforschung von Mechanismen der malignen Transformation ermöglicht das Verständnis von zahlreichen Signalwegen in der Zelle. In dieser Arbeit wurden Mechanismen untersucht, in die die Proliferation und das Homing leukämischer Progenitorzellen involviert sind. Diese Ergebnisse wurden im Anschluss mit gesunden Kontrollen korreliert. Die Migration von Stammzellen ist ein wichtiger zellulärer Mechanismus in der hämatopoetischen Stammzell-Biologie und in der Leukämie-Forschung. CXCR4 und sein Ligand SDF-1 sind wichtige Regulatoren der Stammzell-Migration und des Homings. Sie beeinflussen physiologische, pathologische und zelluläre Migrationsprozesse, die unter anderem für die Vaskularisierung (Nagasawa, 2001), aber auch für die Metastasierung von Tumorzellen (Helbig et al., 2003) von zentraler Bedeutung sind. FLT3 mutierte AML-Zellen zeigen erhöhte CXCR4-Level und ein verbessertes Anwachsen den Zellen im Knochenmark nach Transplantation in NOD/SCID-Mäuse. Tierexperimentelle Daten deuten darauf hin, dass ein verstärktes Homing von leukämischen Zellen mit einer erhöhten Resistenz gegenüber Chemotherapie assoziiert ist. Möglicherweise ist dies eine der Hauptursachen für das Therapieversagen bei diesen Patienten. Das Ziel des Projektes, dem diese Arbeit zugrunde liegt, war es, Interaktionen zwischen FLT3-ITD und CXCR4 zu untersuchen und mögliche Auswirkungen dieser Interaktionen für Migration und Homing von Stammzellen zu ermitteln. Letztlich können diese Erkenntnisse sowohl zur Verbesserung der klinischen Stammzell-Transplantationen und zur Definition neuer Strategien zur Behandlung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie beitragen. Untersuchungsgegenstände dieser Arbeit waren zum einen die Gewinnung von Erkenntnissen über die Wirkung einer FLT3-ITD-Überexpression auf die Expression verschiedener Signalmoleküle und ihr möglicher Einfluss auf CXCR4/SDF-1 vermittelte Signalwege. Des Weiteren die Rolle der CXCR4/SDF-1-Achse und der Einfluss einer Mikroumgebung auf AML-Zellen. Zum anderen die Wirkung des CXCR4 Inhibitiors AMD3100 auf AML-Blasten sowie die Blockierung der CXCR4/SDF-1-Achse als mögliche Therapie gegen AML. Interne Tandemduplikation (ITD)-Mutationen des FLT3-Rezeptors sind mit einer hohen Inzidenz von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) verbunden. Die Expression des CXCR4-Rezeptors in FLT3-ITD-positiven AML-Blasten ist mit schlechten Prognosen für die Patienten verbunden. Die Blockierung von CXCR4 führt zu einer Sensibilisierung von AML-Blasten gegenüber einer Chemotherapie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Blasten von Patienten mit FLT3-ITD oder FLT3-wt-AML verwendet. Darüber hinaus wurden humane CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen (HSCs) bis zu 80% mit retroviralen Vektoren transduziert, die ein humanes FLT3-ITD-Transgen beinhalteten. Im Gegensatz zu früheren Daten von murinen Zellen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass eine Überexpression des FLT3-ITD-Transgens in humanen HSCs eine signifikant reduzierte Migration zu SDF-1-in vitro aufweist. Dies spiegelte sich außerdem in einem reduzierten Knochenmark-Homing in NOD/SCID-Mäusen wider. Ko-Kultivierungsexperimente von sowohl FLT3-ITD-positiven AML-Blasten als auch von FLT3-ITD-positiven HSCs auf Stromazellen des Knochenmarks führten zu einem signifikanten Proliferationsvorteil und zu erhöhten zeitigen CAFCs im Vergleich zu FLT3-wt-AML-Blasten bzw. zu kontrolltransduzierten HSCs. Die Zugabe des CXCR4-Inhibitors AMD3100 zeigte während der Ko-Kultur eine deutliche Reduktion der Proliferation und von CAFCs bei FLT3-ITD-positiven Zellen, aber nicht bei FLT3-wt-Blasten. Zusammenfassend liefert diese Studie den Beweis für eine Stroma-vermittelte Resistenz von FLT3-ITD-positiven HSCs und Blasten. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass die Hemmung von CXCR4 die zellulären Wechselwirkungen von Stromazellen und leukämischen Zellen behindert. Somit bestätigt sich eine funktionelle Bedeutung der CXCR4/SDF-1-Achse bei AML. Um die Kontrolle über leukämische Zellen und ihre Proliferation zu bekommen, könnte die Hemmung von CXCR4 eine neue therapeutische Strategie bei Patienten mit fortgeschrittener FLT3-ITD-positiver AML sein.

La duplication interne en tandem au sein du gène du Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) est l’une des mutations les plus fréquemment observées dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM). Elle est corrélée à un mauvais pronostic. Des inhibiteurs de tyrosine kinase anti-FLT3 (FLT3-ITK) sont en cours de développement mais les premiers essais cliniques ont été décevants. Les rémissions sont de courte durée, et si une clairance leucémique sanguine est observée, la LAM persiste au sein de la moelle osseuse. Dans ce travail, nous avons démontré que les cytokines activatrices de STAT5, telles que l’interleukine-3 et la thrombopoïétine, et les basses pressions en oxygène, telles que celles observées au sein de la niche hématopoïétique augmentent l’expression et l’activité du récepteur tyrosine kinase AXL qui protège les cellules de LAM FLT3-ITD de l’apoptose induite par le FLT3-ITK quizartinib (AC220). Nous avons démontré dans un modèle murin que les cellules de LAM FLT3-ITD « knock-down » pour AXL sont plus sensibles au quizartinib, et que cette différence se révèle spécifiquement dans un modèle de prise de greffe hématopoïétique. La combinaison de stratégies inhibitrices du FLT3-ITD et d’AXL permettra d’améliorer l’efficacité des FLT3-ITK en atteignant la fraction de cellules responsable des rechutes, nichée dans son microenvironnement. A l’issue, nous avons démontré que le gilteritinib (ASP2215), double FLT3/AXL-ITK est plus efficace que le quizartinib pour atteindre ces cellules leucémiques médullaires. Enfin, nous avons démontré que la combinaison d’un anticorps monoclonal anti-AXL avec un FLT3-ITK ou de la cytarabine était une stratégie thérapeutique prometteuse dans les LAM FLT3-ITD ou sauvage. / Internal tandem duplication in Fms-like tyrosine kinase 3 gene (FLT3-ITD) is the most frequent mutation observed in acute myeloid leukemia (AML), and correlates with poor prognosis. FLT3 tyrosine kinase inhibitors (FLT3-TKI) have been promising for therapeutic strategies but clinical trials have revealed rarely long-lasting remission with persistent leukemic cells present in the bone marrow. In this work, we show that the hematopoietic niche microenvironment protects FLT3-ITD AML cells from FLT3-TKI quizartinib (AC220) through convergent up-regulation of AXL expression and activity. Cytokine-dependent activation of STAT5 enhances AXL gene transcription and expression, while low O2 concentration up-regulates AXL protein levels. Moreover, cytokines such as thrombopoietin or interleukin-3 directly activate AXL. RNA interference-based inhibition of AXL expression in FLT3-ITD AML cells allowed a selective purge of leukemic cells within their microenvironment when combined with FLT3-TKI in immuno-compromised mice. Altogether, our data support a strategy combining FLT3-TKI and anti-AXL therapy to eradicate FLT3-ITD AML cells, including those protected by the hematopoietic niche. In such a setting, we performed a study to test the efficacy of gilteritinib (ASP2215) and we showed in vitro and in vivo that this dual FLT3/AXL-TKI is more efficient to eradicate leukemic cells in their microenvironment than quizartinib which is a more specific FLT3-TKI. Finally, we also studied an anti-AXL monoclonal antibody on primary AML cells and showed that its efficacy could be interesting with FLT3-TKI and cytarabine in both FLT3-wild type and FLT3-ITD AML.

Die Erforschung von Mechanismen der malignen Transformation ermöglicht das Verständnis von zahlreichen Signalwegen in der Zelle. In dieser Arbeit wurden Mechanismen untersucht, in die die Proliferation und das Homing leukämischer Progenitorzellen involviert sind. Diese Ergebnisse wurden im Anschluss mit gesunden Kontrollen korreliert. Die Migration von Stammzellen ist ein wichtiger zellulärer Mechanismus in der hämatopoetischen Stammzell-Biologie und in der Leukämie-Forschung. CXCR4 und sein Ligand SDF-1 sind wichtige Regulatoren der Stammzell-Migration und des Homings. Sie beeinflussen physiologische, pathologische und zelluläre Migrationsprozesse, die unter anderem für die Vaskularisierung (Nagasawa, 2001), aber auch für die Metastasierung von Tumorzellen (Helbig et al., 2003) von zentraler Bedeutung sind. FLT3 mutierte AML-Zellen zeigen erhöhte CXCR4-Level und ein verbessertes Anwachsen den Zellen im Knochenmark nach Transplantation in NOD/SCID-Mäuse. Tierexperimentelle Daten deuten darauf hin, dass ein verstärktes Homing von leukämischen Zellen mit einer erhöhten Resistenz gegenüber Chemotherapie assoziiert ist. Möglicherweise ist dies eine der Hauptursachen für das Therapieversagen bei diesen Patienten. Das Ziel des Projektes, dem diese Arbeit zugrunde liegt, war es, Interaktionen zwischen FLT3-ITD und CXCR4 zu untersuchen und mögliche Auswirkungen dieser Interaktionen für Migration und Homing von Stammzellen zu ermitteln. Letztlich können diese Erkenntnisse sowohl zur Verbesserung der klinischen Stammzell-Transplantationen und zur Definition neuer Strategien zur Behandlung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie beitragen. Untersuchungsgegenstände dieser Arbeit waren zum einen die Gewinnung von Erkenntnissen über die Wirkung einer FLT3-ITD-Überexpression auf die Expression verschiedener Signalmoleküle und ihr möglicher Einfluss auf CXCR4/SDF-1 vermittelte Signalwege. Des Weiteren die Rolle der CXCR4/SDF-1-Achse und der Einfluss einer Mikroumgebung auf AML-Zellen. Zum anderen die Wirkung des CXCR4 Inhibitiors AMD3100 auf AML-Blasten sowie die Blockierung der CXCR4/SDF-1-Achse als mögliche Therapie gegen AML. Interne Tandemduplikation (ITD)-Mutationen des FLT3-Rezeptors sind mit einer hohen Inzidenz von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) verbunden. Die Expression des CXCR4-Rezeptors in FLT3-ITD-positiven AML-Blasten ist mit schlechten Prognosen für die Patienten verbunden. Die Blockierung von CXCR4 führt zu einer Sensibilisierung von AML-Blasten gegenüber einer Chemotherapie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Blasten von Patienten mit FLT3-ITD oder FLT3-wt-AML verwendet. Darüber hinaus wurden humane CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen (HSCs) bis zu 80% mit retroviralen Vektoren transduziert, die ein humanes FLT3-ITD-Transgen beinhalteten. Im Gegensatz zu früheren Daten von murinen Zellen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass eine Überexpression des FLT3-ITD-Transgens in humanen HSCs eine signifikant reduzierte Migration zu SDF-1-in vitro aufweist. Dies spiegelte sich außerdem in einem reduzierten Knochenmark-Homing in NOD/SCID-Mäusen wider. Ko-Kultivierungsexperimente von sowohl FLT3-ITD-positiven AML-Blasten als auch von FLT3-ITD-positiven HSCs auf Stromazellen des Knochenmarks führten zu einem signifikanten Proliferationsvorteil und zu erhöhten zeitigen CAFCs im Vergleich zu FLT3-wt-AML-Blasten bzw. zu kontrolltransduzierten HSCs. Die Zugabe des CXCR4-Inhibitors AMD3100 zeigte während der Ko-Kultur eine deutliche Reduktion der Proliferation und von CAFCs bei FLT3-ITD-positiven Zellen, aber nicht bei FLT3-wt-Blasten. Zusammenfassend liefert diese Studie den Beweis für eine Stroma-vermittelte Resistenz von FLT3-ITD-positiven HSCs und Blasten. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass die Hemmung von CXCR4 die zellulären Wechselwirkungen von Stromazellen und leukämischen Zellen behindert. Somit bestätigt sich eine funktionelle Bedeutung der CXCR4/SDF-1-Achse bei AML. Um die Kontrolle über leukämische Zellen und ihre Proliferation zu bekommen, könnte die Hemmung von CXCR4 eine neue therapeutische Strategie bei Patienten mit fortgeschrittener FLT3-ITD-positiver AML sein.

Aberrant subcellular localization of mutant transmembrane receptors is increasingly acknowledged as a possible mechanism for an altered signaling quality leading to transformation. There is evidence that mutated receptor tyrosine kinases of subclass III, for example the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) and KIT-protein, are aberrantly localized in human cancers. In order to further analyze this phenomenon, we investigated the localization of FLT3, a subclass III receptor tyrosine kinase frequently mutated in leukemia. By immunofluorescence staining and confocal laser scanning microscopy we found that in retrovirally transduced COS7 cells, wild type FLT3 receptor protein is localized primarily at the cell surface. In contrast, a mutant FLT3 receptor protein with an internal tandem duplication (ITD) accumulates in a perinuclear region and is not detectable at the plasma membrane. Surprisingly, and in contrast to previously published data, intracellular FLT3-ITD accumulation could neither be detected in the endoplasmic reticulum (ER) nor in the Golgi apparatus. Furthermore, transient overexpression per se leads to accumulation of wild type FLT3 receptor protein in the ER in addition to surface localization, probably due to inefficient intracellular transport by the overloaded sorting machinery of the secretory pathway. Based on our data and the immature glycosylation pattern of FLT3-ITD, we speculate that the mutant protein resides most probably in an unidentified compartment of the secretory pathway between the ER and the Golgi apparatus. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Aberrant subcellular localization of mutant transmembrane receptors is increasingly acknowledged as a possible mechanism for an altered signaling quality leading to transformation. There is evidence that mutated receptor tyrosine kinases of subclass III, for example the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) and KIT-protein, are aberrantly localized in human cancers. In order to further analyze this phenomenon, we investigated the localization of FLT3, a subclass III receptor tyrosine kinase frequently mutated in leukemia. By immunofluorescence staining and confocal laser scanning microscopy we found that in retrovirally transduced COS7 cells, wild type FLT3 receptor protein is localized primarily at the cell surface. In contrast, a mutant FLT3 receptor protein with an internal tandem duplication (ITD) accumulates in a perinuclear region and is not detectable at the plasma membrane. Surprisingly, and in contrast to previously published data, intracellular FLT3-ITD accumulation could neither be detected in the endoplasmic reticulum (ER) nor in the Golgi apparatus. Furthermore, transient overexpression per se leads to accumulation of wild type FLT3 receptor protein in the ER in addition to surface localization, probably due to inefficient intracellular transport by the overloaded sorting machinery of the secretory pathway. Based on our data and the immature glycosylation pattern of FLT3-ITD, we speculate that the mutant protein resides most probably in an unidentified compartment of the secretory pathway between the ER and the Golgi apparatus. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Loss of heterozygosity (LOH) is detectable in many forms of cancer including leukaemia. It contributes to tumorigenesis through the loss of one of the two alleles of one tumor suppressor gene at a given locus, caused by deletion or uniparental disomy (UPD). UPD can only be the result of homologous recombination. Little is known about the mechanisms of UPD and what connection this aberration has with the outcome of this disease. In this study, 146 patients with primary AML were analysed using a novel technique based on single nucleotide polymorphisms (SNPs). Leukaemic cells and healthy T-cells from each patient were obtained using FACS-Vantage cell sorting. In cases with very few sorted cells whole genome preamplification was done. Genome-wide SNP analysis was carried out according to the standard GeneChip Mapping Assay protocol (Affymetrix, USA) using the Human Mapping 10K Arrays. Moreover, the impact of the FLT3-ITD mutation on the homologous recombination using pmHPRT-DRGFP /pCbASce vectors system and yHA2x assay was investigated. Of 146 patients with normal karyotype LOH was found in 30 cases. The potential LOH regions, were confirmed by microsatellite analysis of short tandem repeat (STR) markers. In 21 of these cases STR-analysis of T-cells, representing the corresponding tumor-free material, confirmed the regions of partial UPD. This aberration affected different chromosomes, but most commonly chr. 2, 6, 11, 21, 13, and 7, and covered between 11.5 and 88 Mb. Interestingly, in 6 LOH cases, long stretches of homozygosity present at the same positions as in the healthy cells and in the blasts were found. The impact of this phenomenon is unknown. Additionally, chromosome losses were detected in 3 patients classified with normal karyotype according to current methods. These 9 cases were not included in the UPD positive group. No differences were observed regarding any clinical factors including age, WBC-counts and sex. The FAB M1 subtype was observed in 47.6% of the UPD positive patients, compared to only 19.2% of the UPD negative patients (P=0.04, n=146). In addition, no correlation between FLT3-ITD, MLL-PTD and NPM1 mutations in the UPD patients was found, but the data indicate that patients with UPD have a higher rate of treatment failure. Moreover, in this study the relationship between UPD and gene aberrations was able to be confirmed. In some cases, UPD found on chromosomes 21, 19 and 11 was correlated with mutations in the RUNX1, CEBPA and WT genes, respectively. Furthermore, AML cases with and without UPD showed different but specific gene expression profiles, revealing different expression levels for genes involved in double strand break repairs. Furthermore, it was found that different mutations could be responsible for the increase in efficiency of HR, such as FLT3-ITD or BCR-ABL. Moreover, cells with a FLT3-ITD mutation (without wt expression) rapidly increased the HR efficiency compared with heterozygous (FLT3-ITD/wt) cells. Preliminary results showed that the high repair efficiency was mainly dependent on the translocation of RAD51. In conclusion, SNP array technology allow the identification and mapping of LOH in AML patients with normal karyotype. The obtained data also point out the necessity of analysing tumour-free material to confirm the somatic origin of the alteration. Furthermore, the available results indicate that compared to patients without UPD, patients with UPD have a higher relapse rate, which might be used as a prognostic marker in the future. Also, it could be hypothesized that downregulation of RAD51 (for example by FLT3 inhibition) might be beneficial DNA damage occurs through the genotoxic agent by reducing the relapse risk of AML.