Ce travail porte sur l’identification, la fonction et la régulation des molécules maternelles d’ARNm qui dirigent la compétence développementale juste après la fécondation chez les bovins. Tout d’abord, en utilisant le modèle du temps écoulé jusqu’au premier clivage zygotique et à travers l’évaluation du transcriptome des embryons à 2-cellules, il fut possible de déterminer la signature moléculaire des niveaux extrêmes de compétence au développement et sélectionner des molécules candidates pour des études postérieures. Les résultats ont montré que les embryons de capacité développementale variable diffèrent dans certaines fonctions comme la réparation de l’ADN, le traitement de l’ARN, la synthèse de protéines et l'expression génique définies par des ARNm synthétisés par l’ovocyte. Pour obtenir une confirmation fonctionnelle, une paire de transcrits maternels (l’un détecté dans notre sondage précédent et l’autre étant une molécule reliée) ont été inhibés par « knock-down » dans des ovocytes. Les effets du knock-down de ces facteurs de transcription sont apparus avant la formation des blastocystes dû à une diminution de la capacité au clivage et celle à progresser après le stage de 8-cellules. L’analyse moléculaire des embryons knock-down survivants suggère qu’un de ces facteurs de transcription est un contrôleur crucial de l’activation du génome embryonnaire, qui représente une fenêtre développementale dans l’embryogenèse précoce. Dans la dernièr étude, nous avons testé si les facteurs de transcription d'intérêt sont modulés au niveau traductionnel. Des ARNm rapporteurs couplés à la GFP (Protéine fluorescente) contenant soit la version courte ou la version longue de la séquence 3’-UTR des deux molécules furent injectées dans des zygotes pour évaluer leur dynamique traductionnelle. Les résultats ont montré que les éléments cis-régulateurs localisés dans les 3’-UTRs contrôlent leur synchronisation traductionnelle et suggèrent une association entre la compétence développementale et la capacité de synthèse de ces protéines. Ceci conduit à l’idée que ces facteurs de transcription cruciaux sont aussi contrôlés au niveau traductionnel chez les embryons précoces. Les connaissances acquises ont joué un rôle essentiel pour définir le contrôle potentiel des molécules maternelles sur les embryons au début de leur développement. Cette étude nous montre aussi une utilisation potentielle de cette information ainsi que les nouveaux défis présents dans le secteur des technologies reproductives. / This work explores the identity, the function, and the regulation of maternal mRNA molecules that drive developmental competence shortly after fertilization in cattle. First of all, by using the model of the time of first zygotic cleavage and assessing the transcriptome of 2-cell embryos, it was possible to determine the molecular fingerprint of extreme levels of developmental competence and select candidate molecules for further monitoring. Data implied that early embryos of variable developmental capacity differ in functions including DNA repair, RNA processing, protein synthesis, and gene expression that are dictated by oocyte-synthesized mRNA. To obtain a functional confirmation, a pair of maternal transcripts (one detected in our previous survey and other related molecule) were knocked-down in oocytes that were further cultured. The effects of ablating these transcription factors were evident before blastocyst formation due to a decrease in cleavage capacity, as well as progression past the 8-cell stage. The molecular analysis of surviving knocked-down embryos suggested that one of these transcription factors is a pivotal orchestrator of the activation of the embryonic genome, a critical developmental window in early embryogenesis. In the last survey, we asked whether the transcription factors of interest are modulated at the translational level. Reporter mRNAs containing either short or long versions of the 3’-UTR sequences of both molecules were injected in zygotes to look at their translational dynamics. Results showed that cis-acting elements located in the 3’-UTRs govern their timely translation and suggested an association between developmental competence and protein synthesis capacity. This led to the notion that these crucial transcription factors are also controlled at the translational level in early embryos. The acquired knowledge was instrumental to define the possible control operated by maternal molecules on embryos at the onset of their development, as well as some of the challenges and potential use of this information in the field of reproductive technologies.

La connaissance des mécanismes de régulation des gènes est essentielle pour combattre certaines maladies et pour comprendre certains concepts biologiques importants. L'utilisation de nouvelles technologies qui permettent d'analyser les gènes en tenant compte de la complexité de l'environnement intracellulaire contribue efficacement à élucider ces mécanismes. Dans la première partie de notre travail, nous avons optimisé le fonctionnement d'une de ces technologies, la réaction de polymérisation en chaîne permise par un adaptateur (ligation-mediated polymerase chain reaction, LMPCR), et en avons facilité l'application, surtout pour les séquences difficiles à analyser. Nous avons par la suite utilisée cette technique pour caractériser le promoteur du gène du retard mental lié à l'X fragile-1 et celui du récepteur B1 des bradykinines à même le noyau de cellules vivantes. Pour ces deux gènes, nous avons identifié les éléments de séquences qui sont associés à la régulation de leur transcription et proposé des mécanismes de régulation de la transcription.

Lors d'un stress, les cellules eucaryotes activent des mécanismes de défense afin de s'adapter aux conditions extrêmes et de survivre. Ces mêmes mécanismes peuvent être exploités par les cellules cancéreuses pour survivre au stress thérapeutique. La réponse intégrée au stress (ISR) est une réaction cellulaire qui joue un rôle crucial dans l'adaptation des cellules face à différents stress notamment en régulant la transcription et la traduction de nombreux gènes cibles spécifiques. Durant cette réponse, les cellules stressées réduisent aussi leur métabolisme général, entre autres en inhibant la traduction des ARNm, et économisent ainsi l'énergie nécessaire pour réparer les dommages causés par le stress. En conditions de stress, la traduction générale des ARNm est inhibée principalement au niveau de son étape d'initiation. Un des mécanismes clés induisant l'inhibition de l'initiation de la traduction est la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF2a (eukaryotic translation initiation factor 2a). Bien que cette phosphorylation d'eIF2a, induite par le stress, entraine une inhibition globale de la synthèse protéique, elle induit d'une part la formation d'entités cytoplasmiques à ARN appelées granules de stress mais elle favorise également la traduction spécifique des ARNm spécifiques codant pour des facteurs de réponse au stress, dont le facteur de transcription ATF4. Ce facteurjoue un rôle clé lors de la réponse au stress soit en activant les voies de survie ou au contraire en favorisant celles de mort cellulaire. Ces fonctions opposées d'ATF4 dans la réponse cellulaire au stress dépendent largement de son niveau d'expression. Ainsi, nous avons cherché à caractériser le(s) mécanismes(s) de régulation de l'expression d'ATF4 lors de stress thérapeutiques au sein de cellules cancéreuses. Nous avons montré l'implication des granules de stress (GS) dans la régulation de l'expression de l'ARNm d'ATF4 lors d'un stress thérapeutique engendré par le traitement avec l'agent chimiothérapeutique sorafenib au sein de cellules d'hépatocarcinomes. Cette régulation implique la séquestration d'une fraction de l'ARNm d'ATF4 dans les GS induites par le traitement avec la sorafenib, prévenant sa surexpression létale ; ceci permet de maintenir un niveau d'expression d'ATF4 basal mais nécessaire à la survie des cellules cancéreuses. Afin de caractériser le(s) mécanisme(s) responsable(s) de l'expression basale d'ATF4, permettant la résistance des cellules cancéreuses aux traitements thérapeutiques, un RNA pull-down utilisant des fragments d'ARN biotinylés d'ATF4 a l'aide d'extraits de cellules cancéreuses soumises à un stress thérapeutique a été réalisé. L'analyse par ii spectrométrie de masse des complexes protéiques associés aux fragments d'ARN d'ATF4 biotinylés a permis l'identification d'une dizaine de protéines qui pourraient interagir avec l'ARNm d'ATF4, dont l'ARN hélicase DDX3. Nous avons observé que DDX3 promeut au niveau traductionnel l'expression d'AFT4. Des tests d'interaction protéine-protéine montrent que DDX3 est un composant du complexe d'initiation de la traduction eIF4F. L'interaction entre DDX3 et le complexe eIF4F est potentiellement médiée par le facteur eIF4G, qui est également nécessaire à la traduction d'ATF4 induite en condition de stress. Enfin, la diminution de l'expression d'ATF4 au sein de cellules issues d'hépatocarcinomes résistants via la déplétion de DDX3 sensibilise les cellules cancéreuses à la mort induite par le traitement avec la sorafenib. Cette étude caractérise de nouveaux mécanismes de régulation de l'expression du facteur ATF4 qui se produit lors de stress et qui pourraient être ciblés afin de prévenir la chimiorésistance. / During physiological or environmental stress, cells activate defense mechanisms to survive. These same mechanisms may be exploited by cancer cells to survive therapeutic stresses. The integrated stressresponse (ISR) is one of the cell responses that play a crucial role in the adaptation of cells to various stresses such as the transcriptional and translational régulation of many specific target genes. During this cell response, stressed cells reduce their general metabolism in part by inhibiting mRNA translation, thereby saving energy needed to repair stress-induced damages. Under stress conditions, the regulation oftranslation occurs mainly at its initiation step through the phosphorylation of the translation initiation factor eIF2a. While this phosphorylation, induced by stress, causes a global inhibition ofprotein synthesis, it induces on the one hand the formation of cytoplasmic RNA entities called stress granules (GS) but it also promotes the preferential translation of specific mRNAs coding for stress response factors. Among those, ATF4 is a master transcription factor that orchestrates gene expression during various stresses including those involved in cancer, by either activating survival pathways or on the contrary promoting those of cell death. These opposite ATF4 functions in the cellular stress response depend largely on its expression level linked to its translational regulation by the phosphorylation of eIF2a. Thereby, we sought to characterize the mechanisms(s) that regulate the expression ofATF4 during therapeutic stresses in cancer cells. We described the implication of stress granules in the regulation of ATF4 expression during stress induced by the treatment with sorafenib, a chemotherapeutic agent used to treat hepatocellular carcinoma (HCC). This novel mechanism involves the formation of stress granules that sequester a fraction of ATF4 mRNA in its repressed form, thus preventing its lethal overexpression. This resulted in a basal level of ATF4 expression which is necessary for the survival of cancer cells. Then, in order to characterize the mechanism(s) (e.g. RNAbinding proteins and translation initiation factors such as eIF4G) responsible for the basal translation of ATF4 mRNA allowing the resistance of cancer cells to therapeutic treatments, we performed a biotinylated RNA-pulldown assay with cancer cells extracts subjected to sorafenib. Mass spectrometry analyses of the protein complexes associated with ATF4 biotinylated-RNA fragments led to the identification ofthe DEAD-boxRNA helicase DDX3, as potential interactor with ATF4 mRNA. By combining depletion experiments with various biochemical assays (e.g. luciferase assays), we showed that DDX3 drives sorafenib-induced iv ATF4 mRNA expression at the translational level. Protein-interaction assays identified DDX3 as a component of the translation initiation complex eIF4F. The interaction between DDX3 and the eIF4F complex is potentially mediated by eIF4GI, which we found to be required forsorafenib-induced ATF4 expression. Furthermore, reducing ATF4 expression in resistant HCC cellsthrough DDX3 depletion sensitizes cancer cellsto Sorafenib-induced cell death. Thus, this study identified new regulatory pathways of ATF4 factor that could be targeted to prevent drug resistance in cancer cells and improve the conventional therapies.

Les bactéries lactiques contribuent à la qualité des produits laitiers fermentes par leurs activités enzymatiques. Cette activité est reflétée en partie par le transcriptome, qui représente l'ensemble des gènes exprimés en ARN. Le but de cette recherche est donc d'estimer l'activité de Lactococcus lactis ssp. cremoris par suivi de l'expression des gènes lors de l'étape de la fermentation du lait de fromagerie. Pour étudier les transcriptomes, une technique de RAP-PCR fluorescente a été développée puis appliquée à un ferment mixte composé de trois souches de lactocoques. Les résultats de cette technique montrent que le lait UHT présente un bon compromis entre hygiène et altération thermique des constituants. Dans le lait entier, le CO2 interagit avec les ferments en changeant leur profil de transcription, cette influence n'apparait pas dans le lait écrémé pasteurisé. Comparativement à l'ajout d'une base, l'agitation du lait carboné est une bonne méthode pour réduire l'influence du CO2 sur le ferment. Lors d'une fermentation de type Cheddar, le profil de transcription d'un ferment mixte est très influencé par un excès de NaCl et par un manque d'activité de la présure. La RAP-PCR fluorescente peut identifier les souches par leurs profils d'ARN et analyser les particularités d'une association bactérienne. Selon les conditions observées, le ferment mixte composé par trois souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris (LL074, LL225 et LL390) est formé d'une association stable de deux souches : LL225 avec LL390 alors que la souche LL074 est éliminée. La souche LL225 apparait la plus réactive en réagissant identiquement par la modulation de certains gènes en présence des souches LL074 ou LL390. Une modulation de la transcription de certains gène de la souche de LL390 apparait en présence de la souche LL225 mais aucune en présence de LL074, LL390 ne faisant que dominer cette souche. L'association des souches LL225 avec LL390 se fait en rapport égal et induit une modulation de leurs gènes aussitôt que les souches sont en présence. Les données ont été validées en analysant la transcription de gènes par RT-PCR en temps réel et par di-sondes FRET adjacentes et sont en adéquation avec les incompatibilités entre souches dues aux types de proteinases de membrane. L'activité d'un ferment mixte lors d'une fabrication de type Cheddar est donc influencée par le type de lait utilisé et par une dynamique d'association entre les souches.

Le cortex cérébral est composé d’un grand nombre de types de neurones organisés radialement en couches cellulaires et tangentiellement en aires corticales fonctionnellement distinctes. Son développement est régulé par des signaux fonctionnant comme morphogènes sécrétés par des centres organisateurs situés à la périphérie du télencéphale dorsal. Ces morphogènes contrôlent l’expression dans les progéniteurs corticaux de gènes codant pour des facteurs de transcription qui régulent la prolifération, la différenciation et la spécification des progéniteurs corticaux. Les cascades de gènes impliquées dans la mise en place du cortex cérébral dans lesquelles ces signaux et facteurs de transcription interviennent restent cependant actuellement mal connues.<p>Les gènes Dmrt3 et Dmrt5 appartiennent à une famille de gènes fortement conservée évolutivement codant pour des facteurs de transcription à doigt de zinc connus pour leur rôle dans le développement sexuel. Des résultats obtenus dans le laboratoire ayant montré que Dmrt5 joue un rôle crucial dans la neurogenèse au niveau du système olfactif chez le xénope, j’ai voulu savoir, dans un premier temps, si la fonction de Dmrt5 dans la neurogenèse était une fonction ancestrale. Pour répondre à cette question, j’ai recherché des gènes Dmrts chez une espèce de Cnidaire, Nematostella vectensis, et ai étudié leur expression au cours du développement. L’un d’entre-eux, NvDmrtB, est fortement exprimé dans le système nerveux et s’est avéré être requis pour la différenciation des cellules nerveuses chez N. vectensis, suggérant que les gènes Dmrts avaient déjà un rôle dans la neurogenèse dans l’ancêtre commun des Bilatériens et des Cnidaires.<p>Par ailleurs, d’autres travaux ont montré que chez la souris les gènes Dmrt5 et Dmrt3 sont exprimés dans le cerveau en développement au niveau du télencéphale dorsal. Afin d’approcher leur fonction dans le développement cortical, j’ai analysé leur expression au cours du développement embryonnaire, caractérisé les anomalies de développement du cortex cérébral des souris knockout Dmrt5-/- et Dmrt3-/- ainsi que des souris double knockout Dmrt3-/-;Dmrt5-/- et étudié leur régulation. Mes résultats ont montré que Dmrt3 et Dmrt5 sont coexprimés dans les progéniteurs corticaux en gradient avec un maximum d’expression du côté caudo-médian. J’ai également observé que l’absence de Dmrt5 induit une réduction de la taille des vésicules télencéphaliques et que les structures de la partie caudo-médiane du cortex telles que le plexus choroïde et l’hippocampe sont altérées ainsi que les aires visuelle et somato-sensorielle. Au niveau moléculaire, mes résultats ont montré que Dmrt5 est requis pour l’expression de différents gènes codant pour les signaux Wnt et Bmp sécrétés au niveau de la région caudo-médiane des vésicules télencéphaliques, et qu’il contrôle négativement Pax6 et positivement Emx2, des déterminants respectivement de l’identité rostro-latérale et caudo-médiane du cortex cérébral. Bien que la taille des vésicules télencéphaliques n’apparaisse pas affectée chez les souris Dmrt3-/-, l’expression de différents composants de la voie Wnt et celle d'Emx2 et Pax6 est légèrement altérée, comme chez les souris Dmrt5-/-. Chez les souris double knock-out Dmrt3-/-;Dmrt5-/-, une réduction de la taille du cortex et des altérations de l’expression des gènes similaires et plus sévères que celle des souris Dmrt5-/- ont été observées. Nous avons également mis en évidence que l’expression de Dmrt3 est réduite chez les souris Dmrt5-/- et que inversement celle de Dmrt5 est légèrement augmentée chez les souris Dmrt3-/-. Enfin, nous avons observé que l’expression de ces deux gènes est dépendante du facteur de transcription Gli3 et que seul l’expression de Dmrt3 requiert les facteurs de transcription Pax6 et Emx2.<p>Ensemble, nos résultats indiquent que les facteurs de transcription Dmrt5 et Dmrt3 contrôlent le développement de la partie caudo-médiane du cortex, Dmrt5 agissant en amont de Dmrt3. Ils suggèrent également que ces facteurs y joueraient des rôles partiellement redondants en régulant l’expression de cibles communes tels les gènes Wnt3a et Pax6.! / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les neurones exprimant l'hormone de mélano-concentration (MCH) sont observés dans l'hypothalamus postérieur de tous les vertébrés, de la lamproie à l'Homme. Ces neurones sont impliqués dans diverses fonctions comme le cycle veille/sommeil ou la prise alimentaire. Ils forment une population non homogène et au moins deux sous-populations sont reconnues, chez le rat. La première sous-population est composée de neurones nés au 11ème jour de vie embryonnaire (E11) qui projettent massivement sur les régions les plus postérieures du système nerveux central. La seconde est générée à E12/E13 et les neurones la caractérisant projettent sur les régions les plus antérieures du cerveau et expriment le peptide CART (cocaine and amphetamine regulated transcript) et le récepteur NK3 (neurokinine). L'objectif de notre travail était de comprendre l'origine de ces deux sous-populations. Pour cela, nous avons utilisé des approches histologiques, moléculaires et in vitro. Les neurones à MCH sont parmi les premiers neurones à naître et à différencier leur phénotype chimique le long d'une région longitudinale définie par une prolifération intense, appelée " cell cords " par Keyser en 1972. Cette bande longitudinale est caractérisée par l'expression de gènes comme Sonic Hedgehog (Shh), Nkx2.1, Nkx2.2 et a été récemment renommée " diagonale intrahypothalamica " ou ID. La différenciation des neurones à MCH dépend de l'expression du facteur morphogène Shh et ces neurones expriment Nkx2.1 et Nkx2.2, facteurs de transcription régulés positivement par Shh. Les neurones de la première sous-population envoient des projections le long du premier tractus longitudinal à se mettre en place, le tractus postopticus (tpoc). Ceux issus de la deuxième sous-population se différencient concomitamment au développement des régions télencéphaliques et leurs projections changent de direction pour innerver les régions antérieures du cerveau sous la dépendance de protéines de guidage axonal, Nétrine1 et Slit2. Nétrine1 permet d'attirer les axones MCH exprimant le récepteur DCC précocement vers la moelle épinière et plus tardivement vers le télencéphale alors que Slit2 contraint les axones MCH exprimant Robo2 à sortir de l'hypothalamus. L'étude du modèle " MCH " permet de mettre en lumière un changement d'organisation précocement au cours du développement dans l'axe longitudinal du prosencéphale. La bande longitudinale d'expression des facteurs de transcription Shh, Nkx2.2 peut être perçue comme une extension rostrale de la colonne neurogénique médiane déjà décrite chez des espèces d'invertébrés possédant une symétrie bilatérale. Les neurones générés le long de cette colonne le sont très tôt au cours du développement. / Neurons expressing melanin-concentrating hormone (MCH) are observed in the vertebrate posterior hypothalamus, from lampreys to humans. These neurons are involved in various functions such as sleep/wake cycle or food intake. They form a non-homogeneous population and at least two sub-populations are indentified in the rat. The first sub-population is composed of neurons born on the 11th embryonic day (E11) that project heavily on posterior regions of the central nervous system. The second is characterized by neurons born at E12/E13, projecting in anterior regions of the brain and expressing the peptide CART (cocaine and amphetamine Regulated Transcript) and the NK 3 receptor (neurokinin). The aim of this study was to understand the origin of these two sub-populations. For this, we used histological, molecular and in vitro approaches. MCH neurons are among the first neurons to be born and to differentiate their chemical phenotype along a longitudinal region defined by intense proliferation and called " cell cord " by Keyser in 1972. This longitudinal band is characterized by the expression of genes such as Sonic Hedgehog (Shh), Nkx2.1, Nkx2.2 and was recently named " diagonal intrahypothalamica " or ID. Differenciation of MCH neurons depends on expression of the morphogenetic factor Shh and these neurons express Nkx2.1 and Nkx2.2, transcription factors upregulated by Shh. The neurons of the first sub-population send projections along the tractus postopticus (tpoc), which is the first longitudinal tract to develop. Neurons of the second sub-population differentiate concomitantly to the development of the basal forebrain and their projections innervate anterior brain regions. Our results obtained in vitro showed that Netrin1 attracts MCH axons and that this reponse is mediated by DCC. Slit2 repulses MCH axons and this reponse is mediated by the Robo2 receptor. Overall, our study of the development of the MCH system shed light on an organizational change in the longitudinal axis of the forebrain during early development : a primary longitudinal organization characterized by the longitudinal expression of Shh and Nkx2.2 and the path of the tractus postopticus in the diencephalon and mesencephalon. MCH neurons of the first sub-population develop during this stage. Then, as the basal telencephalon extends and expresses Netrin1, the medial forebrain bundle differentiates, inducing a change in the main axis of the forebrain ; meanwhile MCH neurons of the second sub-population appear. MCH sub-populations reflect distinct developmental stages of the forebrain.

Comment le plan d’organisation d’un organisme est-il mis en place est une question centrale de la biologie du développement. Les séquençages complets de plusieurs génomes de métazoaires ont montré qu’un nombre restreint de molécules régulatrices soutiennent la diversité des plans d’organisation des animaux, suggérant que ces molécules sont utilisées de manière répétée dans des contextes différents. Cela soulève la question de la diversité d’action : comment ces molécules acquièrent-elle une diversité fonctionnelle ? De plus, la plupart des molécules régulatrices partagent des motifs (fonctionnels/structuraux) communs, soulevant la question de la spécificité : comment des molécules partageant des propriétés biochimiques similaires contrôlent-elles des programmes développementaux spécifiques ?Mon équipe d’accueil s’intéresse à ces questions en utilisant les facteurs de transcription Hox de la Drosophile comme paradigme d’étude.Durant ma thèse, j’ai développé trois lignes de recherches : (1) J’ai adapté la technique de complémentation bi-moléculaire de fluorescence (BiFC) de visualisation des interactions protéines-protéines à l’embryon de drosophile en développement.(2) J’ai employé la BiFC pour disséquer la formation des complexes Hox-protéines PBC. Mes résultats remettent en question le paradigme établit : (a) en soulignant la multiplicité des modes d’interaction Hox-PBC existants, (b) en démontrant que cette diversité peut être source de spécificité d’action.(3) La BiFC a ensuite été exploitée dans un crible par approche gènes candidats pour identifier de nouveaux partenaires des protéines Hox. / My current laboratory aims to tackle the issue of specificity and diversity of regulatory molecules, taking the Drosophila Hox transcription factors as a paradigm for the analysis. During my PhD, I developed three connected research lines.Project 1: Visualization of protein interactions in living Drosophila embryos by the BiFC assayOur results establish the general suitability of BiFC for revealing and studying protein interactions in their physiological context during the rapid course of Drosophila embryonic development.Project 2: Investigation of Hox/PBC complex formation in vivo using BiFC Our findings challenge the current paradigm of Hox/Pbx complex assembly: (a) highlighting the existence of alternative modes of Pbx recruitment, (b) demonstrating that unique Hox-PBC interaction modes can provide specific regulatory function in absence of DNA-binding selectivity.To achieve this project BiFC was also performed with vertebrate Hox proteins in chicken embryos.Project 3: Realization of a candidate interaction screen based on BiFC to identify novel Hox protein partners in vivo(a) We have revealed that Hox proteins establish specific interactions with different subunits of the general mediator complex. These results constituted one of the rare studies making a direct link between the Hox regulators and components of the basal transcriptional machinery, in a physiological context.(b) We have discovered that Hox proteins can interact with importin proteins. This result allows us to assess the importance of controlling the nuclear localization of Hox proteins for controlling their regulatory activities during embryogenesis.

Les facteurs de transcription FLI-1 et SPI-1/PU.1 appartiennent à la famille ETS et reconnaissent le même motif sur l’ADN GGAA. Leur activation est observée de manière récurrente dans les érythroleucémies murines induites par le virus de Friend. Ces observations suggèrent un rôle crucial de ces deux facteurs dans la transformation de la lignée érythrocytaire potentiellement par la dérégulation de gènes cibles communs. Mon travail de thèse a consisté à tester la contribution de ces deux facteurs au phénotype des cellules érythroleucémiques et à rechercher les gènes cibles directs communs.Nous avons pu montrer que FLI-1 et SPI-1/PU.1 ont des contributions additives au phénotype des cellules érythroleucémiques surexprimant les deux facteurs. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié une grande proportion de gènes cibles directs communs à FLI-1 et à SPI-1/PU.1 impliqués dans différentes étapes de la biogenèse des ribosomes. La déplétion de ces facteurs induit une réduction de la biogenèse des ribosomes qui n’induit pas de stress ribosomique stabilisant p53. Néanmoins, nous avons mis en évidence une contribution spécifique de RPL11, un médiateur essentiel du stress ribosomique, à la différenciation des cellules érythroleucémiques induites par l’absence de ces facteurs.Nous avons mené en parallèle l’inventaire par ChIP-Seq des sites de recrutement de FLI-1 et de SPI-1/PU.1 sur le génome entier de 3 lignées érythroleucémiques indépendantes. Cette stratégie nous a permis de montrer que les régions de recrutement communes sont la conséquence de la proximité de consensus spécifiques et distincts et du recrutement de FLI-1 et de SPI-1/PU.1 sur leur propre consensus. / The transcription factors FLI-1 and SPI-1/PU.1 belong to the ETS family and recognize the same DNA motif GGAA. Their activation is recurrently observed in murine erythroleukemia induced by Friend virus. These observations suggest a crucial role of these two factors in erythroid lineage transformation potentielly by deregulating common target genes. My thesis work consisted of testing both factors contribution to the phenotype of erythroleukemia cells and of searching for common direct target genes.We showed that FLI-1 and SPI-1/PU.1 have additive contributions to the phenotype of erythroleukemia cells overexpressing both factors. By a transcriptomic approach, we identified a high proportion of common direct target genes of FLI-1 and SPI-1/PU.1 involved in ribosome biogenesis at different levels. The déplétion of these factors induced a decrease of ribosome number which doesn’t induce a ribosomal stress leading to the p53 stabilization. However, we highlighted a specific contribution of RPL11, an essential ribosomal stress médiator, in erythroleukemia cell differentiation induced by depletion of both factors. In parallel, we mapped at whole génome scale by ChIP-Seq the recruitment site of FLI-1 and SPI-1/PU.1 in 3 independent erythroleukemia cell lines. This strategy allowed us to show that the common recruitment régions are the conséquence of a very close association of clearly distinct and specific consensus binding sites for FLI-1 and SPI-1/PU.1 and that each of those factor sis recruited to its own consensus.

Les cellules entéroendocrines sécrétrices d’hormones représentent 1% de l’épithélium intestinal mais sont des régulateurs essentiels du métabolisme énergétique et l’altération de leur différenciation provoque de graves pathologies métaboliques. Leur différenciation est régie par une cascade de régulations transcriptionnelles qui est encore peu décrite, particulièrement chez l’homme. L’objectif de ce projet de thèse était d’évaluer l’implication de plusieurs facteurs de transcription préalablement identifiés chez la souris (NGN3, RFX6, ARX, PAX4) dans la différenciation entéroendocrine humaine. Pour ce faire, ces gènes ont été inactivés par la technique CRISPR/Cas9 dans des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs), qui ont ensuite été différenciées in vitro en organoïdes intestinaux (HIOs). Les analyses des HIOs déficients pour NGN3 ne permettent pas de conclure quant à un rôle dans la différenciation entéroendocrine mais indiquent une altération de la régionalisation du tissu formé chez les mutants. RFX6 semble important pour la différenciation et/ou la fonction des cellules entéroendocrines, bien que sa fonction précise n’ait pas pu être déterminée. / Hormone-producing enteroendocrine cells represent 1% of the intestinal epithelium but are key regulators of the energetic metabolism and alteration of their differentiation is associated with severe metabolic disorders. Enteroendocrine differentiation is governed by a transcriptional regulatory cascade that is poorly described, especially in humans. This thesis project aimed to evaluate the implication of several transcription factors, previously identified in mice (NGN3, RFX6, ARX, PAX4), in human enteroendocrine differentiation. To do so, these genes were disrupted with the CRISPR/Cas9 system in human inducible pluripotent stem cells (hiPSCs), which were then differentiated in intestinal organoids (HIOs). Preliminary analysis of NGN3-deficient HIOs did not allow a firm conclusion regarding NGN3 implication in enteroendocrine differentiation but showed a tissue regionalization alteration. RFX6 seems important for the differentiation/function of enteroendocrine cells, although its precise function is still to be determined.

Le blé tendre, Triticum aestivum, est une des céréales les plus cultivées dans le monde. Le changement climatique qui se développe actuellement contraint fortement les cultures et altère leur rendement. La compréhension des mécanismes de réponse du blé tendre aux stress abiotiques est donc une problématique d’actualité. Plusieurs grandes familles de facteurs de transcription, dont la famille NAC,interviennent dans le développement de la plante et dans sa réponse aux stress environnementaux. Cette thèse, structurée en 3 volets, est ciblée sur l’étude de la famille NAC chez le blé tendre : les TaNAC. Dans un premier temps, nous avons étudié la structuration génomique et phylogénétique des 488 membres de la famille TaNAC, recensés à partir de la base de données la plus récente du blé tendre.Nous avons aussi étudié l’histoire évolutive de cette famille, qui a été marquée par des événements de duplication et de rétroposition. Enfin, une analyse de sa diversité allélique a permis d’identifier des gènes qui présentent des SNP montrant une forte association avec des paramètres d’accumulation des protéines de réserve dans le grain. Le deuxième chapitre de cette thèse a porté sur l’étude de l’expression de ces 488 gènes TaNAC dans plusieurs organes et en réponse aux stress thermique et sécheresse. Une analyse globale a été réalisée à partir de données bio-informatiques, suivie d’une étude in planta de l’expression d’une sélection de 23 gènes. Les profils d’expression obtenus ont révélé l’existence de 4 gènes TaNAC, encore jamais décrits dans la littérature et qui interviennent dans le développement du grain de blé tendre mais aussi dans sa réponse adaptative à plusieurs stress abiotiques. Le troisième volet de cette thèse a donc porté sur la caractérisation génétique, moléculaire et physiologique de ces 4 facteurs de transcription TaNAC. Ils appartiennent à un clade rassemblant des séquences présentant des similitudes génomique et structurale. De plus, ils sont localisés dans le noyau et leurs profils d’expression sont similaires, avec toutefois un niveau variable entre gènes et entre homéologues pour chaque gène. En réponse à un stress thermique modéré, ce profil d’expression est accéléré au cours du développement du grain ; le stade 120°Cj étant le stade clé qui montre la plus grande différence d’expression de ces gènes entre les conditions contrôle et stressée. Pour des raisons techniques, la production de plantes transgéniques sur- et sous-exprimant ces gènes n’a pas permis de valider l’implication de ces 4 TaNAC dans le développement du grain et en réponse à la température. Une analyse de génétique d’association a toutefois permis de mettre en évidence un lien entre des marqueurs moléculaires situés dans ces gènes et l’accumulation des protéines de réserve.Globalement, les résultats obtenus ont montré que des membres de la famille TaNAC sont impliqués dans le développement du blé tendre et dans sa réponse aux stress abiotiques. Plus particulièrement, 4 facteurs de transcription TaNAC semblent jouer un rôle clé dans l’accumulation des protéines dans le grain en réponse à un stress thermique modéré. / Bread wheat, Triticum aestivum, is one of the most cultivated cereal in the world. The climate change that is currently developing strongly constrains crops and impairs their yield. Understanding the wheat response mechanisms to abiotic stresses is therefore a current issue. Several major families of transcription factors, including the NAC family, are involved in the plant development and its response to environmental stresses. This thesis, structured in three parts, is focused on the study of the NAC family in bread wheat (TaNAC).First, we studied the genomic and phylogenetic structure of the 488 members of the TaNAC family identified from the latest database of bread wheat. We also studied the evolutionary history of this family, which was marked by duplication and retroposition events. Finally, an analysis of its allelic diversity allows us to identify genes with SNP showing a strong association with storage protein accumulation parameters in the grain. In a second part, we studied the expression of these 488 TaNAC genes in several organs and in response to heat and drought. An overall analysis was performed using bioinformatic data, followed by an in planta study of the expression of a selection of 23 genes. The expression profiles revealed that four TaNAC genes, never described in the literature, are involved in the wheat grain development but also in its adaptive response to several abiotic stresses. In a third part, we focused on the genetic, molecular and physiological characterization of these four TaNAC transcription factors. They belong to a clade gathering sequences with genomic and structural similarities. Moreover, they are localized in the nucleus and their expression profiles are similar, with a variable level between genes and between homeologs for each gene. In response to moderate heat stress, this expression profile is accelerated during grain development and a key stage at 120°Cj was identified, it shows the greatest difference in genes expression level between control and stressed conditions. For technical reasons, the production of transgenic plants over- and under-expressing these genes did not validate the involvement of these 4 TaNAC in grain development and in its temperature response. An association genetic analysis, however, showed a link between molecular markers located in these genes and the storage proteins accumulation. Overall, the results showed that members of the TaNAC family are involved in the bread wheat development and its response to abiotic stresses. In particular, four TaNAC transcription factors appear to play a key role in grain protein accumulation in response to a moderate heat stress.