Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’apoptose ou mort cellulaire programmée joue un rôle prépondérant dans l’homéostasie cellulaire. Ce processus est très finement régulé par les protéines de la famille BCL-2 qui contrôlent la perméabilité de membrane mitochondriale externe et la libération du cytochrome c, deux événements majeurs précédant la mort cellulaire. Les protéines anti-apoptotiques de la famille BCL-2 contribuent à la tumorigenèse et sont impliquées dans la résistance des cancers aux molécules chimiothérapeutiques ; à ce titre, elles représentent des cibles importantes pour le développement de nouvelles thérapies. BCL2A1 est un membre anti-apoptotique de la famille BCL-2 impliqué dans la chimiorésistance de nombreuses tumeurs. La protéine BCL2A1 a pour caractéristique d’avoir une demi-vie courte due à sa dégradation constitutive par le système ubiquitine-protéasome. Ceci régule la stabilité et la fonction anti-apoptotique de BCL2A1 et représente un mécanisme suppresseur de tumeur majeur. Cependant, les enzymes qui contrôlent les modifications post-traductionnelles impliquées dans l’ubiquitination et la dégradation de BCL2A1 demeurent, à ce jour, inconnues. Dans la présente thèse, nous donnons un aperçu des acteurs et des mécanismes impliqués dans la régulation de l’ubiquitination de BCL2A1. Nous présentons des preuves que TRIM28 est une E3 ubiquitine-ligase pour BCL2A1. En effet, les protéines TRIM28 et BCL2A1 endogènes interagissent ensemble au niveau des mitochondries et la déplétion de TRIM28 diminue l’ubiquitination de BCL2A1. Nous montrons aussi que TRIM17 stabilise BCL2A1 en empêchant son interaction avec TRIM28 et son ubiquitination médiée par TRIM28, et que l’activité de GSK3 est impliquée dans l’inhibition de la dégradation de BCL2A1. Ainsi, BCL2A1 et son proche homologue MCL-1 sont régulés par des facteurs communs mais de façon opposé. Finalement, la surexpression de TRIM28 ou l’inactivation de TRIM17 diminue le niveau protéique de BCL2A1 et restaure la sensibilité des cellules de mélanomes aux thérapies utilisant des inhibiteurs de la kinase BRAF. Globalement, nos résultats décrivent un rhéostat moléculaire au sein duquel deux protéines de la famille TRIM régulent de façon antagoniste la stabilité de BCL2A1 et modulent ainsi la mort cellulaire. / Apoptosis or programmed cell death plays a crucial role in tissue homeostasis and is regulated by the Bcl-2 proteins, which control mitochondria membrane permeability and cytochrome c release, two events that precede cell demise. Anti-apoptotic Bcl-2 family members can contribute to tumorigenesis and cause resistance to anti-cancer regimens, therefore representing important targets for novel therapeutics. BCL2A1 is an anti-apoptotic member of the BCL-2 family that contributes to chemoresistance in a subset of tumors. BCL2A1 has a short half-life due to its constitutive processing by the ubiquitin-proteasome system. This constitutes a major tumor-suppressor mechanism regulating BCL2A1 function. However, the enzymes involved in the regulation of BCL2A1 protein stability are currently unknown. Here we provide the first insight into the regulation of BCL2A1 ubiquitination. We present evidence that TRIM28 is an E3 ubiquitin-ligase for BCL2A1. Indeed, endogenous TRIM28 and BCL2A1 bind to each other at the mitochondria and TRIM28 knock-down decreases BCL2A1 ubiquitination. We also show that TRIM17 stabilizes BCL2A1 by blocking TRIM28 from binding and ubiquitinating BCL2A1, and that GSK3 is involved in the phosphorylation-mediated inhibition of BCL2A1 degradation. BCL2A1 and its close relative MCL1 are thus regulated by common factors but with opposite outcome. Finally, overexpression of TRIM28 or knock-out of TRIM17 reduced BCLA1 protein levels and restored sensitivity of melanoma cells to BRAF-targeted therapy. Therefore, our data describe a molecular rheostat in which two proteins of the TRIM family antagonistically regulate BCL2A1 stability and modulate cell death.Sommaire

Les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) sont des maladies hématopoïétiques caractérisées par une prolifération incontrôlée de précurseurs myéloïdes bloqués à divers stades de différenciation. Le pronostic des LAM reste sombre à cause de la résistance aux traitements et des rechutes après rémission. En conséquence, des thérapies moins intensives et mieux tolérées doivent être développées ; ceci nécessite le développement de stratégies combinatoires associant des molécules avec des modes d’action différents pour augmenter l’efficacité des traitements. Plusieurs approches sont en cours d’étude préclinique et clinique [inhibiteurs des voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR, anticorps monoclonaux couplés à une drogue (Mylotarg®), inhibiteurs du protéasome (bortezomib)…] Des travaux récents ont relancé l’intérêt de l’étude des molécules d’origine naturelle pour le traitement des cancers. Ainsi, l’acide flavone-8-acétique (FAA) a suscité de nombreux espoirs au vu de son action sur les tumeurs greffées chez la souris ; il s’est néanmoins révélé inactif chez l’homme du fait d’une métabolisation différente de celle de la souris. L’objectif de ma thèse a été d’étudier les effets d’anticorps monoclonaux dirigés contre l’antigène tumoral CD13 (aminopeptidase-N) et de deux dérivés de FAA, la 2’,3-Dinitroflavone-8-acétique (DNFAA ; inhibiteur de l’activité enzymatique de CD13) et la 3,3’-Diamino-4’-méthoxyflavone (DD1) dans les LAM. Mon étude a montré que DNFAA n’affecte ni la prolifération ni la survie des cellules de LAM (lignées et cellules primaires). Cependant, le traitement de ces cellules par les anticorps anti-CD13, (MY7, SJ1D1, WM15 ; reconnaissant ou non le site enzymatique) induit l’apoptose en activant les voies extrinsèque et intrinsèque. Dans la voie intrinsèque, les anti-CD13 régulent négativement l’expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Mcl-1 et positivement l’expression de la protéine pro-apoptotique Bax. De plus, l’activation de la voie PI3K/Akt apparaît associée au processus apoptotique. Mon étude sur les effets du 3,3’-Diamino-4’-méthoxyflavone dans les cellules de LAM montre une induction d’apoptose résultant de la convergence de l’inhibition du protéasome et de l’activation des voies extrinsèque et intrinsèque. Les cibles de DD1 sont le protéasome, la kinase p70S6K (kinase en aval de mTOR), et les protéines pro-apoptotiques Bad et Bax. De plus, j’ai mis en évidence la dégradation de p70S6K sous l’action de la caspase 3, par le traitement avec DD1, nouvelle propriété partagée par DD1 et le bortezomib. En conclusion, mon travail a permis de mettre en évidence les capacités à induire in vitro des voies d’apoptose déficientes dans les cellules de LAM, d’anticorps monoclonaux anti-CD13 et de la flavone originale, 3,3’-Diamino-4’-methoxyflavone, en tant que nouvel inhibiteur du protéasome. Les propriétés de ces agents pro-apoptotiques méritent d’être analysées de façon plus approfondie. / Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a deadly disease characterized by the clonal expansion and accumulation of hematopoietic stem cells arrested at various stages of development. Clinical research efforts are currently focusing on targeted therapies that induce apoptosis in AML cells such as PI3K/Akt/mTOR pathway inhibitors, monoclonal antibodies (Mylotarg®), proteasome inhibitor (bortezomib)… Natural products such as flavonoids have been reported as anticancer agents due to their antioxidant properties as well as to their possible interactions with signalling cascades. Therefore, flavone-8-acetic acid (FAA) has raised considerable attention since the discovery of its exceptional activity on several murine solid tumours. Unfortunately, these promising properties were not confirmed on human due to differential metabolization between human and mouse. The aim of my PhD was to study effects of monoclonal antibody against aminopeptide-N/CD13 and FAA derivatives, 2’,3-Dinitroflavone-8-acetic (DNFAA ; APN/CD13 inhibitor) and 3,3’-Diamino-4’-methoxyflavone (DD1) on acute myeloid leukaemia cells. My studies have shown that DNFAA does not modify proliferation or survival of LAM primary and cell lines. However, treatment of these cells by CD13 antibodies (MY7, SJ1D1 and WM15) induces apoptosis by triggering extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Regarding the intrinsic pathway, anti-CD13 down-regulate anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Mcl-1 and up-regulate the pro-apoptotic protein Bax. Morever, PI3K/Akt signalling pathway seems to be associated with this apoptosis. My study about 3,3’-Diamino-4’-methoxyflavone effects on LAM cells has shown that DD1 induces apoptosis by proteasome inhibition and intrinsic and extrinsic pathways induction. DD1 targets p70S6 kinase (a downstream kinase of mTOR) and pro-apoptotic proteins Bad and Bax. Moreover, I have shown p70S6K degradation by caspase 3 during DD1 treatment, a new characteristic shared by DD1 and Bortezomib. As a conclusion, my works demonstrated that CD13 antibodies and a new synthetic flavone are able to induce apoptosis signalling pathway normally impaired on AML cells. Characteristics of these agents deserve to be more deeply analyzed.

Le cancer est un problème majeur de santé public, tuant chaque année plusieurs millions de personnes. L’inhibition de la mort cellulaire programmée, l’apoptose, est considérée comme l’un des paramètres principaux impliqués dans son initiation et son développement. La régulation de la voie intrinsèque (mitochondriale) de l’apoptose est régulée par la famille Bcl-2. Jusqu’à maintenant, on pensait que la protéine PUMA, une protéine pro-apoptotique, était principalement exprimée au niveau mitochondrial. Nous avons montré qu’à l’état basal, PUMA était exprimé au niveau du cytosol des lymphocytes B humains. Cependant, suite à un signal apoptotique, PUMA est capable de transloquer du cytosol à la mitochondrie, de façon indépendante des caspases mais dépendante de l’activation de la MAPKinase p38, permettant ainsi son interaction avec les protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Mcl-1 dont l’inhibition conduit à l’apoptose. Les protéines anti-apoptotiques, Mcl-1 notamment, sont souvent surexprimées dans les tumeurs. Mcl-1 est une protéine à courte demi-vie, rapidement dégradée par le protéasome. Cette dégradation dépend de son ubiquitination réalisée par des E3 ligases (E3). Quelques E3 et une déubiquitinase (DUB), hydrolysant les chaînes d’ubiquitine, régulant l’expression de Mcl-1 ont été décrites. Cependant, ces protéines sont soit très peu exprimées, soit leur inhibition n’a pas d’impact sur l’expression de Mcl-1 dans notre modèle. Nous avons donc entrepris de caractériser de nouvelles E3 et DUB régulant l’ubiquitination de Mcl-1. Après une immunoprécipitation de Mcl-1 dans nos cellules, suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, nous avons identifié la DUB USP14. Lorsque son expression est diminuée, l’expression et la stabilité de Mcl-1 augmentent de façon sélective. Nos résultats pourraient contribuer à une approche à double-tranchant dans le traitement du cancer, en retirant les freins à l’apoptose via une diminution de l’expression de Mcl-1 d’une part et en l’activant via PUMA de l’autre. / Cancer is a major public health issue, killing millions of people worldwide each year. The inhibition of apoptosis, a programmed cell death, in its onset and development has been well documented, making it one of the hallmarks of cancer. The regulation of the intrinsic (mitochondrial) pathway of apoptosis is regulated by the Bcl-2 (B cell lymphoma-2) family. Up until now, PUMA, a pro-apoptotic protein, was thought to be mainly expressed at the mitochondria, based on experiments where it had been overexpressed. We showed that endogenous PUMA is mainly expressed in the cytosol of activated or resting B cells. However, upon apoptotic stress, PUMA was able to translocate from the cytosol to the mitochondria, in a caspase-independent but p38-dependent manner, allowing PUMA to bind and inhibit the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Mcl-1, and thereby leading to cell death. The anti-apoptotic proteins, especially Mcl-1, are often overexpressed in tumors. Mcl-1 is a protein with a short half-life, degraded rapidly by the proteasome. This degradation is ubiquitin-dependent, requiring E3 ligases (E3). A handful of E3s and one deubiquitinase (DUB), that hydrolyses the ubiquitin chains, have been reported to regulate Mcl-1 expression. However, they were either very poorly expressed or their inhibition had no impact on Mcl-1 expression in our model. We thus undertook to characterize new E3s and DUBs mediating Mcl-1 ubiquitination. After an immunoprecipitation of Mcl-1 in our cells, followed by a mass spectrometry analysis, we identified the DUB USP14. When knockdown, Mcl-1 expression was selectively increased and its stability enhanced. Our results could help build “double-edge” therapies, removing the breaks on apoptosis on one hand via Mcl-1 downregulation while activating it on the other via PUMA translocation.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La progression tumorale est la conséquence de multiples altérations génotypiques et phénotypiques; L’une d’entre elles, nécessaire à la formation de métastases, est l’acquisition d’une résistance à l’anoïkis, forme d’apoptose induite par la perte d’attachement à la matrice extra-cellulaire. Afin d’étudier l’anoïkis, nous avons utilisé deux lignées colorectales humaines isogéniques : la lignée SW480 dérivée de la tumeur primaire et sensible à l’anoïkis et la lignée SW620 dérivée d’une métastase ganglionnaire de cette même tumeur et résistante à l’anoïkis. Nous avons établi que dans les cellules SW480, l’anoïkis est une forme d’apoptose intrinsèque c'est-à-dire débutant à la mitochondrie et donc sous le contrôle des protéines de la famille Bcl-2. Parmi celles-ci, nous avons trouvé que seule la protéine proapoptotique à BH3-seul Bim était régulée différemment dans les deux lignées : tandis que son expression augmente de manière très significative dans les cellules SW480 cultivées en suspension, elle n’augmente que très peu dans les cellules SW620. De manière très intéressante, et malgré cette différence, les deux lignées se sont montrées être sensibles au BH3-mimétique ABT-737 mais seulement lorsqu’elles sont cultivées en suspension. Ces résultats indiquent que, qu’elles soient sensibles ou non à l’anoïkis, les cellules détachées sont « prédisposées à la mort » et que des composés semblables à l’ABT-737 tels que le Navitoclax ou l’ABT-199 pourraient avoir des propriétés anti-métastiques dans les tumeurs solides. Dans la seconde partie de ce travail, nous montrons que la protéine transmembranaire CDCP1 ( CUB Domain Containing Protein 1) semble nécessaire mais non suffisante pour protéger ces cellules contre l’anoïkis. CDCP1 est un substrat de Src mais sa phosphorylation sur tyrosine n’est pas impliquée dans cette protection. Finalement, nous avons identifié deux nouvelles protéines qui interagissent avec CDCP1 : l’ITGB4 et l’EphA2 / Tumour progression is the consequence of multiple genotypic and phenotypic alterations. One of these, necessary for the formation of metastasis, is acquisition of a resistance to anoïkis, a form of apoptosis triggered by loss of attachment to the extra-cellular matrix. In order to study anoïkis, we used two isogenic human colon cell lines : SW480 cells derived from the primary tumour and sensitive to anoïkis, and SW620 cells derived from a lymph node metastasis in the same patient which are resistant to anoikis. We found that anoikis signaling in SW480 cells is a form of intrinsic apoptosis thus starting at the mitochondria and under the control of Bcl-2 family proteins. Among the members of this family, the BH3-only proapoptotic protein Bim was the only one that we found to be differentially regulated between the two cell lines: whereas Bim expression augments strongly during the culture in suspension of SW480, it only slightly does so in SW620 cells. Most interestingly, despite this difference, both cell lines turned to be sensisitive to the BH3-mimetic ABT-737 but only when they are in suspension. This shows that, whether or not they a sensitive to anoikis, detached colon cancer cells are “primed for death” and thus that ABT-737 related compounds such as Navitoclax or ABT-199 might have anti-metastatic properties in solid tumours. In the second part of this work, we show that the transmembrane protein CDCP1 (CUB Domain Containing Protein 1) appears be necessary but not sufficient to protect these cells against anoïkis. CDCP1 is a Src substrate but its tyrosine phosphorylation is not involved in this protection. Finally, we have identified two new proteins interacting with CDCP1: ITGB4 and EphA2.

Les protéines de la famille Bcl-2 sont des régulateurs-clés de l’apoptose (mort cellulaire), qui agissent en contrôlant la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe par un processus encore mal connu. La dérégulation des membres de cette famille est souvent associée à la progression tumorale et à la résistance à la chimiothérapie. Notre projet a cherché à éclaircir le mode d’action de ces protéines en se focalisant sur les déterminants structuraux régissant leur interaction avec les membranes biologiques. Les connaissances glanées ont permis (i) de mieux comprendre les déterminants à l’origine de la divergence évolutive entre membres pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 ; (ii) d’ouvrir la voie à la conception de ‘poropeptides’ conçus sur le modèle des hélices d’insertion membranaire des protéines Bcl-2, et qui pourraient être utilisés pour induire l’apoptose de cellules tumorales ou des cellules endothéliales entourant les tumeurs. / Bcl-2 family proteins, which include pro- and antiapoptotic members, positively or negatively regulate mitochondrial outer membrane permeabilization, i.e. a critical step in apoptosis. Over-expression of pro-survival members is associated with tumor progression and may be responsible for chemotherapy resistance. Detailed understanding of the precise mechanisms by which Bcl-2 family members control apoptosis is therefore of considerable therapeutic interest. The overall aim of our project was to delineate a structure-function relationship of Bcl-2 family proteins with emphasis on their membrane-active domains. This analysis has provided a basis (i) to elucidate the molecular mechanisms by which different Bcl-2 proteins evolved opposite functions ; (i) to develop a new generation of pore-forming peptides targeting the mitochondrial outer membrane that may be used to kill neoplastic or tumor endothelial cells.

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