Orientadores: Denise Pontes Cavalcanti, Luciana Cardoso Bonadia / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T19:05:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kanazawa_ThatianeYoshie_M.pdf: 1904408 bytes, checksum: 8b54672e34f366d597d94eb97bfafa4d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Entre as osteocondrodisplasias (OCD) destacam-se as displasias esqueléticas do grupo 1 (FGFR3) devido à sua alta frequência. Nesse grupo, além das displasias com fenótipo característico e considerável correlação genótipo-fenótipo, como a acondroplasia (Ach) e a displasia tanatofórica (DT), está a hipocondroplasia (Hch), cujo fenótipo em geral é mais leve, apresenta grande variabilidade clínico-radiológica e heterogeneidade etiológica. O objetivo desse estudo foi sequenciar o gene FGFR3 numa coorte de pacientes com fenótipo típico ou sugestivo. A análise molecular foi feita por sequenciamento direto, começando pelos hot spots e, seguindo com o sequenciamento completo do gene quando os primeiros foram negativos. Foram incluídos 63 pacientes na casuística: 30 Ach, 7 Hch, 10 Hch?, 13 DT-I e 3 DT-II. Dentre os casos de Ach, todos apresentaram a mutação mais comumente associada à Ach (p.G380R), inclusive um paciente com fenótipo atípico e suspeita de mosaicismo somático, não comprovado, devido à assimetria corporal. Dentre os casos de Hch, todos os sete apresentaram a mutação mais comum para este fenótipo (p.N540K) inclusive dois pacientes com uma Hch grave com manifestações clínicas e radiológicas no período neonatal e dez pacientes, diagnosticados como uma Hch duvidosa (Hch?) por apresentarem baixa estatura com alguns sinais radiológicos, não foi encontrada mutação, sendo que em cinco casos, o sequenciamento não foi concluído. Três mutações diferentes, que ocorrem com maior frequência, foram identificadas entre os casos de DT-I, a p.R248C em sete pacientes, entre eles um paciente atípico por apresentar maior sobrevida, p.S249C em três e a p.Y373C em dois. Em todos os casos de DT-II, como esperado, foi encontrada a única mutação até então descrita para este fenótipo (p.K650E). Os resultados deste estudo permitiram a identificação de casos interessantes, ressaltaram a ótima correlação genótipo-fenótipo do grupo FGFR3 e reforçaram a importância da investigação molecular do gene FGFR3 nos casos com fenótipos duvidosos ou atípicos / Abstract: Among osteochondrodysplasias (OCD) stand out the skeletal dysplasias group 1 (FGFR3) due to its high frequency. In this group, besides the conditions with considerable characteristic phenotype and genotype-phenotype correlation, such as achondroplasia (Ach) and thanatophoric dysplasia (TD), there is hypochondroplasia (HCH), whose phenotype is generally milder, with a large clinical and radiological variability and etiological heterogeneity. The aim of this study was to sequence the FGFR3 gene in a cohort of patients with typical or suggestive phenotype. Molecular analysis was performed by direct sequencing, starting with the hot spots, and following with the complete sequencing of the gene when the first were negative. In this sample, 63 patients were included: 30 Ach, 7 Hch, 10 Hch?, 13 DT-I and 3 DT-II. Among the Ach cases, all exhibit the most common mutation associated with Ach (p.G380R), including one patient with an atypical phenotype, with suspicious of somatic mosaicism, not confirmed, due to body asymmetry. Among the Hch cases, all the seven patients showed the most common mutation for this phenotype (p.N540K) including two patients with severe Hch with clinical and radiological manifestations in the neonatal period and ten patients, diagnosed as a doubtful Hch (Hch?), because of their low stature with some radiological signs, no mutation was found, and in five cases, sequencing was not completed. Three different mutations, which occur more frequently, were identified among the DT-I cases, p.R248C in seven patients, including an atypical patient with a long-term survival, p.S249C in three and p.Y373C in two. In all DT-II cases, as expected, the only mutation described so far for this phenotype (p.K650E) was found. The results of this study allowed the identification of interesting cases, emphasized the great genotype-phenotype correlation of FGFR3 group and reinforced the importance of molecular investigation of the FGFR3 gene in cases with doubtful or atypical phenotypes / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

INTRODUÇÃO: Os níveis séricos de fósforo (P) têm sido associados a doenças cardiovasculares e mortalidade em pacientes com doença renal crônica e na população geral. Estudos in vitro demonstram que altas concentrações de fósforo extracellular são capazes de induzir calcificação vascular e disfunção endotelial. O Fibroblast Growth Factor 23 (FGF-23) é um hormônio fosfatúrico e foi relacionado à presença de aterosclerose em pacientes idosos. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi investigar as relações entre P, FGF-23 e outros atores do metabolismo mineral e a ocorrência de doença arterial coronariana em pacientes com função renal preservada. MÉTODOS: Duzentos e noventa pacientes clinicamente estáveis com indicação de cineangiocoronariografia eletiva e clearance de creatinina superior a 60 ml/min/1.73 m2 foram submetidos à Tomografia Computadorizada Multislice para avaliação da calcificação coronariana e coleta de sangue para dosagens bioquímicas. A calcificação coronariana foi quantificada através do Escore de Agatston (EA) e os Escores de Friesinger e Gensini foram calculados para quantificar a obstrução coronariana. RESULTADOS: A média de idade dos pacientes foi 58,1± 9,3 anos, 81% eram hipertensos e 35,5% diabéticos. Os pacientes foram divididos em grupos de acordo com o EA utilizando-se como ponto de corte o valor de 10 Unidades Hounsfield (HU). O P sérico foi maior no grupo de pacientes com EA > 10 HU (3,63 0,55 vs 3,49 0,52mg/dL; p=0,019). Cada 1 mg/dL de elevação no P sérico associou-se a um aumento de 92% no risco de apresentar o EA > 10HU [Odds Ratio (OR) =1,92, CI 1,56-3,19; p=0,01]. Quando os pacientes foram divididos de acordo com a mediana do Escore de Friesinger (4 pontos), o grupo com valores superiores à mediana apresentou P sérico maior (3,6 0,5 vs. 3,5 0,6 mg/dl; p=0,04) e FGF-23 menor (mediana 40,3 pg/mL intervalo interquartil 24,1-62,2 vs. 45,7 pg/mL intervalo interquartil 31,7-76,1; p=0,01) quando comparado àquele com valores menores ou iguais a 4. Pacientes no tercil mais alto do escore de Gensini também apresentaram P sérico mais elevado que os demais (p<0,05). Nas análises de regressão logística uni e multivariadas, cada 1 mg/dL de elevação no P sérico implicou em um aumento de 74% no risco de apresentar o Escore de Friesinger superior à mediana (OR 1,74, CI 1,06- 2,88; p=0,03) e o FGF-23 sérico foi preditor negativo do Escore de Friesinger (OR 0,26, CI 0,11-0,63; p=0,002) Os níveis séricos de cálcio e paratormônio não mostraram associação com a presença de doença coronariana. CONCLUSÃO: Em pacientes com suspeita de doença arterial coronariana e função renal preservada, o fósforo sérico foi preditor da presença de calcificação e obstrução coronariana e houve uma associação negativa entre o FGF-23 sérico e a presença de obstrução coronariana. / INTRODUCTION: Serum phosphorus (P) has been associated with cardiovascular diseases and mortality in chronic kidney disease patients and in the general population. In vitro studies suggest that excessive phosphorus induces vascular calcification and endothelial dysfunction. Fibroblast growth factor 23 (FGF-23) is a phosphaturic hormone and has been correlated to atherosclerosis in the community. AIM: This study intended to investigate the associations between P, FGF-23 and other mineral metabolism players and coronary artery disease in patients with preserved renal function. METHODS: Two-hundred ninety patients with a creatinine clearance higher than 60ml/min/1,73m2 undergoing elective coronary angiography were submitted to Multislice Computed Tomography in order to evaluate coronary calcification and blood was collected for biochemical analyses. Coronary artery calcification was quantified using the Agatston Score (AS). Friesinger (FS) and Gensini Scores (GS) were calcutalet to quantify coronary obstruction. RESULTS: Considering the whole population, mean age was 58.1±9.3 anos, 81% were hypertensive and 35.5% were diabetics. Patients were divided according to AS using the value of 10 Hounsfield Units (HU) as the cutoff.point. Serum phosphorus was higher in patients with an AS > 10HU when compared to the group with an AS 10 HU (3.63 0.55 vs 3.49 0.52mg/dL, p=0.019). Each 1 mg/dL of elevation in the serum phosphorus implied a 92% additional risk of presenting an AS > 10 HU [Odds Ratio (OR) =1.92, CI 1.56-3.19; p=0.01]. Patients were also divided using the median Friesinger score (4 points) as the cutoff value. Serum phosphorus was higher (3.6 0.5 vs. 3.5 0.6 mg/dl, p=0.04) and intact FGF-23 was lower (median 40.3 interquartile range 24.1-62.2 pg/mL vs. 45.7 interquartile range 31.7- 76.1 pg/mL, p=0.01) in the FS > 4 group. Patientis in the higher Gensini Score tertile presented elevated serum phosphorus when compared to the other groups (p<0,05). In the uni and multivariate logistic regression analyses, a rise of 1 mg/dL of serum phosphorus carried a 74% increase in the risk of having a FS higher than 4 (OR 1.74, CI 1.06-2.88; p=0.03) and FGF-23 was a negative predictor of FS (OR 0.26, CI 0.11-0.63; p=0.002). Serum calcium and parathormone were not associated with the presence of coronary artery disease. CONCLUSIONS: In patients with suspected coronary artery disease and preserved renal function, phosphorus was predictive of both coronary artery calcification and obstruction. There was a negative association between FGF-23 and coronary obstruction

Na busca por agonistas, antagonistas e inibidores de natureza peptídica do fator de crescimento de fibroblastos ácido humano (hFGF-1), iniciamos o presente trabalho fazendo uma análise conformacional teórica do peptídeo Ac- WFVGLKKNGSSKRGPRT-NH2 (107-123 [hFGF-1]). Em trabalho anterior, este composto havia se mostrado um agonista da atividade mitogênica da proteína capaz de inibir a ligação de 125I-hFGF-1 aos seus receptores celulares e de se ligar à resina heparina-Sepharose (Oyama et al. 1996). Os cálculos das propriedades dinâmicas deste peptídeo (I; Tabela 1) demonstraram que ele não adotava nenhuma conformação preferencial, o que poderia justificar a baixa atividade apresentada pelo mesmo (104 vêzes menor do que a da proteína nativa). Este peptídeo foi ressintetizado, purificado, caracterizado química e biologicamente, confirmando os resultados anteriores. Seu comportamento randômico foi comprovado experimentalmente através de uma análise estrutural parcial por 1H-RMN. O resultado desta análise demonstrou que este peptídeo exibe uma configuração random coil, em solução aquosa (Kiyota et al., 1996, 1999). Diante desta constatação e com base em dados descritos na literatura (Harper & Lobb 1988; Burgess et al., 1991; Pantoliano et al., 1994, Springer et al., 1994; Thompson et al., 1994; Imamura et al., 1995; Blaber et al., 1996; Ornitz et al., 1996; Zhu et al.,1991, 1995, 1997; Schwizer, 1995; Sieber & Moe, 1996; Rizo et al., 1996); desenhamos dezessete peptídeos relacionados ao Sítio 2 (97-132) do hFGF-1 mostrados na Tabela 1 (ver arquivo PDF). Todos os peptídeos foram sintetizados manualmente por síntese em fase sólida, sempre que possível purificados à homogeneidade por RP-HPLC e caracterizados quimicamente por RP-HPLC, análise de aminoácidos e espectrometria de massas. Os peptídeos cíclicos foram obtidos por: a) oxidação das sulfidrilas das cisteínas e formação de ponte dissulfeto intramolecular; b) reação entre os grupos amina e carboxila de cadeias laterais de dois diferentes resíduos de aminoácidos com formação de uma ligação lactama. Os testes de atividade mitogênica foram realizados sempre que os peptídeos eram obtidos com pureza &#8805;90% determinada por RP-HPLC analítica em dois sistemas diferentes de solventes. Os resultados obtidos em culturas de fibroblastos de camundongos Balb/c 3T3 mostraram que: 1) II, III, VI-IX e XIII eram inativos; 2) o cíclico IV era mitogênico (ED50 ~50 &#181;M) ao contrário do seu análogo linear correspondente (III); 3) V, um análogo de IV que apresenta deleção de um resíduo (Asn), exibia uma atividade mitogênica menor do que a de IV; 4) X exibia uma atividade mitogênica menor do que a do I; 5) os cíclicos XII e XV exibiam atividades comparáveis a do I, enquanto que os seus análogos lineares correspondentes (XI e XIV) eram inativos; 6) XVI e XVII exibiam atividades mitogênicas também comparáveis à de I. Paralelamente a estes estudos, foi desenvolvido um modelo teórico dos domínios extracelulares DII e DIII do FGFR-1&#946;. A partir do posicionamento gráfico das moléculas de hFGF-1 e de um hexassacarídeo de heparina junto a este modelo do receptor, foram desenhados os peptídeos Ac-170NTTDKENEVLH180-NH2 (XVIII) e Ac-194SLAGNSIGLSH204-NH2 (XIX) (Oyama et al., 1997). Estes dois peptídeos cujas seqüências primárias são, respectivamente, relacionadas àquelas dos loops DE e FG do domínio DIII, foram também sintetizados e testados neste trabalho como possíveis ligantes do sítio 2 do hFGF-1.Os testes biológicos demonstraram que o peptídeo XIX, na faixa de concentração testada, não exibia nenhuma atividade inibitória sobre as atividades mitogênicas dos FGFs -1 e -2. Por outro lado, notou-se um claro efeito inibitório de XVIII sobre a atividade mitogênica de ambas as proteínas, sendo este efeito mais significativo para o FGF-2 (Kiyota et al., 1998). Alguns dos peptídeos estudados foram submetidos a análises espectroscópicas com o objetivo de determinar suas conformações em solução. Este conhecimento forneceria subsídios para o desenho de novos peptídeos mitogênicos e, mais ainda, para determinação dos requisitos estruturais destes peptídeos e, como reflexo, do hFGF1 para expressão de suas atividades mitogênicas. Assim, foi feita uma análise parcial do peptídeo mitogênico IV e de seu análogo linear III inativo em solução aquosa empregando fluorescência e 1HRMN ( (Kiyota et al., 1998). Estes peptídeos foram analisados também por técnicas de CD e 1H-NMR (Kiyota et al., 1999). Os resultados obtidos mostraram que III e IV parece se organizarem de forma semelhante em suas porções N-terminais, em estruturas correspondentes a &#946;-turns. Por outro lado, as conformações das porções C-terminais destes peptídeos diferiram; somente em IV, observouse a presença de uma família de confôrmeros com estruturas helicoidais nessa porção do esqueleto e que eram superponíveis. O mesmo não foi observado na porção C-terminal de III. A análise conformacional do peptídeo XVIII em solução foi também realizada empregando-se CD e 1H-RMN. Os resultados obtidos indicaram que este peptídeo tem forte tendência em assumir uma estrutura helicoidal em solução aquosa contendo 50% CD3OH. O conjunto dos resultados obtidos neste trabalho nos permitem concluir que: 1) a presença de W107 e F108 é, de fato, essencial para a expressão da atividade mitogênica de peptídeos derivados do sítio 2 do hFGF-1; 2) a presença de N106 adjacente ao core hidrofóbico constituído pelos resíduos W107F108 é importante; 3) a ciclização do peptídeo IV foi decisiva para a expressão de sua atividade, indicando que, não apenas a presença, mas o posicionamento adequado das cadeias laterais de N106, W107 e F108 são determinantes; 4) apenas uma das lisinas (K112 ou K113) é essencial para a atividade mitogênica (X, XVI e XVII); 5) o importante parece ser a manutenção do posicionamento das cadeias laterais em relação aos dos outros resíduos contidos na seqüência, uma vez que, a substituição do segmento 112KKNGS116 por uma prolina e/ou deleção de 120GPRT123 (XI e XIV) abolem a atividade mitogênica do peptídeo; 6) a ciclização que mantem a distância e as orientações relativas entre WF e KR (considerados essenciais para a atividade) em seqüência (XII e XV), leva à recuperação da atividade; 7) a atividade inibitória específica para o FGF-2 exibida pelo peptídeo XVIII parece ser um indicativo de que a alça DE do domínio DIII do receptor pode estar envolvido na ligação a esta proteína. Estas conclusões são relevantes e essenciais para: 1) o entendimento dos requisitos estruturais para a atividade mitogênica dos peptídeos estudados e, como reflexo, do hFGF-1, 2) o desenho de novos agonistas, antagonistas ou inibidores do sistema FGF. / In our search for small potent agonists or inhibitors related to hFGF-1(97-132), we first investigated the preferred conformation in solution of Ac -WFVGLKKNGSSKRGPRT-NH2 (I), by 1H-NMR. This compound has been described as a weak agonist of the mitogenic activity of this growth factor able to inhibit the binding of 125I-hFGF-1 to their cellular receptors, and to heparin-Sepharose columns (Oyama et al., 1996). We found that this peptide is in a random coil configuration, which could explain its low activity (104 times less potent than the native protein). On the basis on these results and on several data available in the literature (Harper & Lobb 1988; Burgess et al., 1991; Pantoliano et al., 1994, Springer et al., 1994; Thompson et al., 1994; Imamura et al., 1995; Ornitz et al., 1996; Blaber et al., 1996; Zhu et al., 1991, 1995; 1997; Schwizer, 1995; Sieber & Moe, 1996; Rizo et al., 1996), we designed seventeen peptides related to the Site 2 (97-132)[hFGF-1] listed on the Table 1: some were linear and some were cyclic. They were synthesized manually using the solid phase method, purified by RP-HPLC, and chemically characterized by RP-HPLC, amino acid analysis and mass spectrometry. Conformational constraints of certain peptides were achieved by cyclization. Intramolecular dissulfide bonds were formed by the oxidation of the thiol groups of two cysteins residues with air oxigen and/or K2Fe(CN)6. Lactama bonds were formed between the functional side chain group of acidic and basic residue. The synthetic peptides were tested in of their ability to inducing mitogenic response on Balb/c 3T3, A-31 clone fibroblasts cultures. The results obtained were the following: 1) peptides II, III, VI-IX were essentially inactive on Balb/c 3T3 fibroblasts in the range of concentrations used (up to 200 &#181;M), 2) in the same range of concentration, peptide IV showed an ED50 60&#181;M (similar to that found for peptide I) while its correspondent linear analog (III) was inactive; 3) V, analog of IV, that has Asn deleted, exibihited mitogenic activity lower than IV; 4) X showed a mitogenic activity on Balb/c fibroblasts lower than I, 5) cyclic peptides XII and XV showed mitogenic activities similar to that of I, while their correspondent linear (XI and XIV) and cyclic (XIII) analogs were inactive; 6) XVI and XVII showed mitogenic activities similar to that found for I. In parallel, two peptides [Ac-170NTTDKENEVLH180-NH2 (XVIII) and Ac-194SLAGNSIGLSH204-NH2 (XIX)], derived from DIII FGFR-1&#946; and designed as putative ligands of Site2 hFGF-1, were synthesized and tested. In the range of concentration used (up to 200 &#181;M), XIX was inactive and exhibited no inhibitory effect on FGF-1 and FGF-2 mitogenic activities. Nevertheless, XVIII inhibited the mitogenic activity of both proteins, being this effect clearly more significant for the FGF-2 (Kiyota et al., 1998). Some of synthetic peptides have been spectroscopically analyzed in order to disclose the structural features that characterize the active (Kiyota et al., 1999). A detailed analysis was undertaken with peptides III and IV using circular dichroism (CD) and 1H-NMR. Although the similarities in their primary sequences, III has shown inactive when tested on Balb/c 3T3 fibroblasts culture while IV was mitogenic with ED50 values around 50 &#181;M. I was also not capable of inhibiting the binding of hFGF-1 to its cellular receptors, I was inactive while II inhibits it with ID50 values of about 30 &#181;M. Circular dichroism study showed that while at increasing SDS concentrations the spectra of III suggested the presence of an equilibrium among partially structured states, those of IV indicated that this peptide exists in unordered extended conformation, folds into a &#946;-conformation and, finally, assumes a helix rich structure. 1H-NMR analysis revealed the existence of a well defined &#947;-turn encompassing residues 4-6 that nicely fits with that present in the same portion of the crystallized hFGF-1. Superposition of the final structures of III and IV over the entire sequence revealed that only the C-terminal portion of III has the tendency to fold into a regular structure. Together these data indicate that the turn existence in IV allowed it to acquire the structural determinants for the expression of mitogenicity probably through a more appropriate arrangement of residues 8-10. More importantly, they demonstrate that we have found a short agonist of hFGF-1 able to structurally mimic its corresponding stretch. Conformational analysis of XVIII in solution was undertaken also by using CD e 1HRMN. The results obtained indicated that it has a strong tendency to assume helicoidal configuration in aqueous solution containing 50% CD3OH. Altogether these data led us to conclude that: 1) the presence of Asn106 adjacent to hydrophobic core constituted by W107F108 is essential for the mitogenic activity of IV; 2) conformation constraint by cyclization was efficient for the correct N106, W107 and F108 side chains orientation in peptide IV for an effective cellular receptors binding; 3) peptides related to hFGF-1 (114-123) seem to be promising mitogenic agonists; 4) the only one lysine between L126 and N129 is enough for the mitogenic activity expression (X, XVI and XVII); 5) deletions of residues, replacement of deleted fragment by Pro followed by restriction of peptide conformation might keep the frame of the residues considered essential for the mitogenic activity along the peptides backbones; 6)The inhibitory effect on the FGF-2 mitogenic activity observed in peptide XVIII was indicative that the loop DE of DIII FGFRs seems to be involved in the binding of this protein.These conclusions are very relevant in terms of the knowledge of the structural requirements for the mitogenic activity of studied peptides and, as a reflex, of the hFGF-1. Furthermore, they constitute additional guidelines for designing new constrained peptides derived from this segment of FGF-1, which may result in more potent agonists, antagonists or inhibitors of such important target.

Na busca por agonistas, antagonistas e inibidores de natureza peptídica do fator de crescimento de fibroblastos ácido humano (hFGF-1), iniciamos o presente trabalho fazendo uma análise conformacional teórica do peptídeo Ac- WFVGLKKNGSSKRGPRT-NH2 (107-123 [hFGF-1]). Em trabalho anterior, este composto havia se mostrado um agonista da atividade mitogênica da proteína capaz de inibir a ligação de 125I-hFGF-1 aos seus receptores celulares e de se ligar à resina heparina-Sepharose (Oyama et al. 1996). Os cálculos das propriedades dinâmicas deste peptídeo (I; Tabela 1) demonstraram que ele não adotava nenhuma conformação preferencial, o que poderia justificar a baixa atividade apresentada pelo mesmo (104 vêzes menor do que a da proteína nativa). Este peptídeo foi ressintetizado, purificado, caracterizado química e biologicamente, confirmando os resultados anteriores. Seu comportamento randômico foi comprovado experimentalmente através de uma análise estrutural parcial por 1H-RMN. O resultado desta análise demonstrou que este peptídeo exibe uma configuração random coil, em solução aquosa (Kiyota et al., 1996, 1999). Diante desta constatação e com base em dados descritos na literatura (Harper & Lobb 1988; Burgess et al., 1991; Pantoliano et al., 1994, Springer et al., 1994; Thompson et al., 1994; Imamura et al., 1995; Blaber et al., 1996; Ornitz et al., 1996; Zhu et al.,1991, 1995, 1997; Schwizer, 1995; Sieber & Moe, 1996; Rizo et al., 1996); desenhamos dezessete peptídeos relacionados ao Sítio 2 (97-132) do hFGF-1 mostrados na Tabela 1 (ver arquivo PDF). Todos os peptídeos foram sintetizados manualmente por síntese em fase sólida, sempre que possível purificados à homogeneidade por RP-HPLC e caracterizados quimicamente por RP-HPLC, análise de aminoácidos e espectrometria de massas. Os peptídeos cíclicos foram obtidos por: a) oxidação das sulfidrilas das cisteínas e formação de ponte dissulfeto intramolecular; b) reação entre os grupos amina e carboxila de cadeias laterais de dois diferentes resíduos de aminoácidos com formação de uma ligação lactama. Os testes de atividade mitogênica foram realizados sempre que os peptídeos eram obtidos com pureza &#8805;90% determinada por RP-HPLC analítica em dois sistemas diferentes de solventes. Os resultados obtidos em culturas de fibroblastos de camundongos Balb/c 3T3 mostraram que: 1) II, III, VI-IX e XIII eram inativos; 2) o cíclico IV era mitogênico (ED50 ~50 &#181;M) ao contrário do seu análogo linear correspondente (III); 3) V, um análogo de IV que apresenta deleção de um resíduo (Asn), exibia uma atividade mitogênica menor do que a de IV; 4) X exibia uma atividade mitogênica menor do que a do I; 5) os cíclicos XII e XV exibiam atividades comparáveis a do I, enquanto que os seus análogos lineares correspondentes (XI e XIV) eram inativos; 6) XVI e XVII exibiam atividades mitogênicas também comparáveis à de I. Paralelamente a estes estudos, foi desenvolvido um modelo teórico dos domínios extracelulares DII e DIII do FGFR-1&#946;. A partir do posicionamento gráfico das moléculas de hFGF-1 e de um hexassacarídeo de heparina junto a este modelo do receptor, foram desenhados os peptídeos Ac-170NTTDKENEVLH180-NH2 (XVIII) e Ac-194SLAGNSIGLSH204-NH2 (XIX) (Oyama et al., 1997). Estes dois peptídeos cujas seqüências primárias são, respectivamente, relacionadas àquelas dos loops DE e FG do domínio DIII, foram também sintetizados e testados neste trabalho como possíveis ligantes do sítio 2 do hFGF-1.Os testes biológicos demonstraram que o peptídeo XIX, na faixa de concentração testada, não exibia nenhuma atividade inibitória sobre as atividades mitogênicas dos FGFs -1 e -2. Por outro lado, notou-se um claro efeito inibitório de XVIII sobre a atividade mitogênica de ambas as proteínas, sendo este efeito mais significativo para o FGF-2 (Kiyota et al., 1998). Alguns dos peptídeos estudados foram submetidos a análises espectroscópicas com o objetivo de determinar suas conformações em solução. Este conhecimento forneceria subsídios para o desenho de novos peptídeos mitogênicos e, mais ainda, para determinação dos requisitos estruturais destes peptídeos e, como reflexo, do hFGF1 para expressão de suas atividades mitogênicas. Assim, foi feita uma análise parcial do peptídeo mitogênico IV e de seu análogo linear III inativo em solução aquosa empregando fluorescência e 1HRMN ( (Kiyota et al., 1998). Estes peptídeos foram analisados também por técnicas de CD e 1H-NMR (Kiyota et al., 1999). Os resultados obtidos mostraram que III e IV parece se organizarem de forma semelhante em suas porções N-terminais, em estruturas correspondentes a &#946;-turns. Por outro lado, as conformações das porções C-terminais destes peptídeos diferiram; somente em IV, observouse a presença de uma família de confôrmeros com estruturas helicoidais nessa porção do esqueleto e que eram superponíveis. O mesmo não foi observado na porção C-terminal de III. A análise conformacional do peptídeo XVIII em solução foi também realizada empregando-se CD e 1H-RMN. Os resultados obtidos indicaram que este peptídeo tem forte tendência em assumir uma estrutura helicoidal em solução aquosa contendo 50% CD3OH. O conjunto dos resultados obtidos neste trabalho nos permitem concluir que: 1) a presença de W107 e F108 é, de fato, essencial para a expressão da atividade mitogênica de peptídeos derivados do sítio 2 do hFGF-1; 2) a presença de N106 adjacente ao core hidrofóbico constituído pelos resíduos W107F108 é importante; 3) a ciclização do peptídeo IV foi decisiva para a expressão de sua atividade, indicando que, não apenas a presença, mas o posicionamento adequado das cadeias laterais de N106, W107 e F108 são determinantes; 4) apenas uma das lisinas (K112 ou K113) é essencial para a atividade mitogênica (X, XVI e XVII); 5) o importante parece ser a manutenção do posicionamento das cadeias laterais em relação aos dos outros resíduos contidos na seqüência, uma vez que, a substituição do segmento 112KKNGS116 por uma prolina e/ou deleção de 120GPRT123 (XI e XIV) abolem a atividade mitogênica do peptídeo; 6) a ciclização que mantem a distância e as orientações relativas entre WF e KR (considerados essenciais para a atividade) em seqüência (XII e XV), leva à recuperação da atividade; 7) a atividade inibitória específica para o FGF-2 exibida pelo peptídeo XVIII parece ser um indicativo de que a alça DE do domínio DIII do receptor pode estar envolvido na ligação a esta proteína. Estas conclusões são relevantes e essenciais para: 1) o entendimento dos requisitos estruturais para a atividade mitogênica dos peptídeos estudados e, como reflexo, do hFGF-1, 2) o desenho de novos agonistas, antagonistas ou inibidores do sistema FGF. / In our search for small potent agonists or inhibitors related to hFGF-1(97-132), we first investigated the preferred conformation in solution of Ac -WFVGLKKNGSSKRGPRT-NH2 (I), by 1H-NMR. This compound has been described as a weak agonist of the mitogenic activity of this growth factor able to inhibit the binding of 125I-hFGF-1 to their cellular receptors, and to heparin-Sepharose columns (Oyama et al., 1996). We found that this peptide is in a random coil configuration, which could explain its low activity (104 times less potent than the native protein). On the basis on these results and on several data available in the literature (Harper & Lobb 1988; Burgess et al., 1991; Pantoliano et al., 1994, Springer et al., 1994; Thompson et al., 1994; Imamura et al., 1995; Ornitz et al., 1996; Blaber et al., 1996; Zhu et al., 1991, 1995; 1997; Schwizer, 1995; Sieber & Moe, 1996; Rizo et al., 1996), we designed seventeen peptides related to the Site 2 (97-132)[hFGF-1] listed on the Table 1: some were linear and some were cyclic. They were synthesized manually using the solid phase method, purified by RP-HPLC, and chemically characterized by RP-HPLC, amino acid analysis and mass spectrometry. Conformational constraints of certain peptides were achieved by cyclization. Intramolecular dissulfide bonds were formed by the oxidation of the thiol groups of two cysteins residues with air oxigen and/or K2Fe(CN)6. Lactama bonds were formed between the functional side chain group of acidic and basic residue. The synthetic peptides were tested in of their ability to inducing mitogenic response on Balb/c 3T3, A-31 clone fibroblasts cultures. The results obtained were the following: 1) peptides II, III, VI-IX were essentially inactive on Balb/c 3T3 fibroblasts in the range of concentrations used (up to 200 &#181;M), 2) in the same range of concentration, peptide IV showed an ED50 60&#181;M (similar to that found for peptide I) while its correspondent linear analog (III) was inactive; 3) V, analog of IV, that has Asn deleted, exibihited mitogenic activity lower than IV; 4) X showed a mitogenic activity on Balb/c fibroblasts lower than I, 5) cyclic peptides XII and XV showed mitogenic activities similar to that of I, while their correspondent linear (XI and XIV) and cyclic (XIII) analogs were inactive; 6) XVI and XVII showed mitogenic activities similar to that found for I. In parallel, two peptides [Ac-170NTTDKENEVLH180-NH2 (XVIII) and Ac-194SLAGNSIGLSH204-NH2 (XIX)], derived from DIII FGFR-1&#946; and designed as putative ligands of Site2 hFGF-1, were synthesized and tested. In the range of concentration used (up to 200 &#181;M), XIX was inactive and exhibited no inhibitory effect on FGF-1 and FGF-2 mitogenic activities. Nevertheless, XVIII inhibited the mitogenic activity of both proteins, being this effect clearly more significant for the FGF-2 (Kiyota et al., 1998). Some of synthetic peptides have been spectroscopically analyzed in order to disclose the structural features that characterize the active (Kiyota et al., 1999). A detailed analysis was undertaken with peptides III and IV using circular dichroism (CD) and 1H-NMR. Although the similarities in their primary sequences, III has shown inactive when tested on Balb/c 3T3 fibroblasts culture while IV was mitogenic with ED50 values around 50 &#181;M. I was also not capable of inhibiting the binding of hFGF-1 to its cellular receptors, I was inactive while II inhibits it with ID50 values of about 30 &#181;M. Circular dichroism study showed that while at increasing SDS concentrations the spectra of III suggested the presence of an equilibrium among partially structured states, those of IV indicated that this peptide exists in unordered extended conformation, folds into a &#946;-conformation and, finally, assumes a helix rich structure. 1H-NMR analysis revealed the existence of a well defined &#947;-turn encompassing residues 4-6 that nicely fits with that present in the same portion of the crystallized hFGF-1. Superposition of the final structures of III and IV over the entire sequence revealed that only the C-terminal portion of III has the tendency to fold into a regular structure. Together these data indicate that the turn existence in IV allowed it to acquire the structural determinants for the expression of mitogenicity probably through a more appropriate arrangement of residues 8-10. More importantly, they demonstrate that we have found a short agonist of hFGF-1 able to structurally mimic its corresponding stretch. Conformational analysis of XVIII in solution was undertaken also by using CD e 1HRMN. The results obtained indicated that it has a strong tendency to assume helicoidal configuration in aqueous solution containing 50% CD3OH. Altogether these data led us to conclude that: 1) the presence of Asn106 adjacent to hydrophobic core constituted by W107F108 is essential for the mitogenic activity of IV; 2) conformation constraint by cyclization was efficient for the correct N106, W107 and F108 side chains orientation in peptide IV for an effective cellular receptors binding; 3) peptides related to hFGF-1 (114-123) seem to be promising mitogenic agonists; 4) the only one lysine between L126 and N129 is enough for the mitogenic activity expression (X, XVI and XVII); 5) deletions of residues, replacement of deleted fragment by Pro followed by restriction of peptide conformation might keep the frame of the residues considered essential for the mitogenic activity along the peptides backbones; 6)The inhibitory effect on the FGF-2 mitogenic activity observed in peptide XVIII was indicative that the loop DE of DIII FGFRs seems to be involved in the binding of this protein.These conclusions are very relevant in terms of the knowledge of the structural requirements for the mitogenic activity of studied peptides and, as a reflex, of the hFGF-1. Furthermore, they constitute additional guidelines for designing new constrained peptides derived from this segment of FGF-1, which may result in more potent agonists, antagonists or inhibitors of such important target.

INTRODUÇÃO: Os níveis séricos de fósforo (P) têm sido associados a doenças cardiovasculares e mortalidade em pacientes com doença renal crônica e na população geral. Estudos in vitro demonstram que altas concentrações de fósforo extracellular são capazes de induzir calcificação vascular e disfunção endotelial. O Fibroblast Growth Factor 23 (FGF-23) é um hormônio fosfatúrico e foi relacionado à presença de aterosclerose em pacientes idosos. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi investigar as relações entre P, FGF-23 e outros atores do metabolismo mineral e a ocorrência de doença arterial coronariana em pacientes com função renal preservada. MÉTODOS: Duzentos e noventa pacientes clinicamente estáveis com indicação de cineangiocoronariografia eletiva e clearance de creatinina superior a 60 ml/min/1.73 m2 foram submetidos à Tomografia Computadorizada Multislice para avaliação da calcificação coronariana e coleta de sangue para dosagens bioquímicas. A calcificação coronariana foi quantificada através do Escore de Agatston (EA) e os Escores de Friesinger e Gensini foram calculados para quantificar a obstrução coronariana. RESULTADOS: A média de idade dos pacientes foi 58,1± 9,3 anos, 81% eram hipertensos e 35,5% diabéticos. Os pacientes foram divididos em grupos de acordo com o EA utilizando-se como ponto de corte o valor de 10 Unidades Hounsfield (HU). O P sérico foi maior no grupo de pacientes com EA > 10 HU (3,63 0,55 vs 3,49 0,52mg/dL; p=0,019). Cada 1 mg/dL de elevação no P sérico associou-se a um aumento de 92% no risco de apresentar o EA > 10HU [Odds Ratio (OR) =1,92, CI 1,56-3,19; p=0,01]. Quando os pacientes foram divididos de acordo com a mediana do Escore de Friesinger (4 pontos), o grupo com valores superiores à mediana apresentou P sérico maior (3,6 0,5 vs. 3,5 0,6 mg/dl; p=0,04) e FGF-23 menor (mediana 40,3 pg/mL intervalo interquartil 24,1-62,2 vs. 45,7 pg/mL intervalo interquartil 31,7-76,1; p=0,01) quando comparado àquele com valores menores ou iguais a 4. Pacientes no tercil mais alto do escore de Gensini também apresentaram P sérico mais elevado que os demais (p<0,05). Nas análises de regressão logística uni e multivariadas, cada 1 mg/dL de elevação no P sérico implicou em um aumento de 74% no risco de apresentar o Escore de Friesinger superior à mediana (OR 1,74, CI 1,06- 2,88; p=0,03) e o FGF-23 sérico foi preditor negativo do Escore de Friesinger (OR 0,26, CI 0,11-0,63; p=0,002) Os níveis séricos de cálcio e paratormônio não mostraram associação com a presença de doença coronariana. CONCLUSÃO: Em pacientes com suspeita de doença arterial coronariana e função renal preservada, o fósforo sérico foi preditor da presença de calcificação e obstrução coronariana e houve uma associação negativa entre o FGF-23 sérico e a presença de obstrução coronariana. / INTRODUCTION: Serum phosphorus (P) has been associated with cardiovascular diseases and mortality in chronic kidney disease patients and in the general population. In vitro studies suggest that excessive phosphorus induces vascular calcification and endothelial dysfunction. Fibroblast growth factor 23 (FGF-23) is a phosphaturic hormone and has been correlated to atherosclerosis in the community. AIM: This study intended to investigate the associations between P, FGF-23 and other mineral metabolism players and coronary artery disease in patients with preserved renal function. METHODS: Two-hundred ninety patients with a creatinine clearance higher than 60ml/min/1,73m2 undergoing elective coronary angiography were submitted to Multislice Computed Tomography in order to evaluate coronary calcification and blood was collected for biochemical analyses. Coronary artery calcification was quantified using the Agatston Score (AS). Friesinger (FS) and Gensini Scores (GS) were calcutalet to quantify coronary obstruction. RESULTS: Considering the whole population, mean age was 58.1±9.3 anos, 81% were hypertensive and 35.5% were diabetics. Patients were divided according to AS using the value of 10 Hounsfield Units (HU) as the cutoff.point. Serum phosphorus was higher in patients with an AS > 10HU when compared to the group with an AS 10 HU (3.63 0.55 vs 3.49 0.52mg/dL, p=0.019). Each 1 mg/dL of elevation in the serum phosphorus implied a 92% additional risk of presenting an AS > 10 HU [Odds Ratio (OR) =1.92, CI 1.56-3.19; p=0.01]. Patients were also divided using the median Friesinger score (4 points) as the cutoff value. Serum phosphorus was higher (3.6 0.5 vs. 3.5 0.6 mg/dl, p=0.04) and intact FGF-23 was lower (median 40.3 interquartile range 24.1-62.2 pg/mL vs. 45.7 interquartile range 31.7- 76.1 pg/mL, p=0.01) in the FS > 4 group. Patientis in the higher Gensini Score tertile presented elevated serum phosphorus when compared to the other groups (p<0,05). In the uni and multivariate logistic regression analyses, a rise of 1 mg/dL of serum phosphorus carried a 74% increase in the risk of having a FS higher than 4 (OR 1.74, CI 1.06-2.88; p=0.03) and FGF-23 was a negative predictor of FS (OR 0.26, CI 0.11-0.63; p=0.002). Serum calcium and parathormone were not associated with the presence of coronary artery disease. CONCLUSIONS: In patients with suspected coronary artery disease and preserved renal function, phosphorus was predictive of both coronary artery calcification and obstruction. There was a negative association between FGF-23 and coronary obstruction

Introdução: Uma elevada incidência de tumores adrenocorticais pediátricos e de adultos é observada nas regiões sul e sudeste do Brasil. Hiperexpressão dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4 tem sido descrita em tumores adrenocorticais. Apesar de hiperexpressão ser um evento comum em diversas neoplasias, ainda não são claros os mecanismos moleculares que seriam responsáveis por essa falha na regulação da expressão. Objetivos: Determinar o número de cópias dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4 em tumores adrenocorticais diagnosticados em crianças e adultos. Adicionalmente correlacionaremos os dados de expressão gênica e/ou protéica de IGF1R, SF1 e FGFR4 com o diagnóstico histológico e evolutivo dos tumores adrenocorticais. Pacientes e métodos: Sessenta e quatro pacientes com tumores adrenocorticais foram selecionados para o estudo. Todos os pacientes foram submetidos à avaliação clínica e tratamento cirúrgico. Oito glândulas adrenais normais obtidas em cirurgias renais ou autópsias foram utilizadas como controles. DNA genômico extraído dos tecidos normais e tumorais da glândula suprarrenal foram utilizados como substrato nas reações de multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) com o intuito de se determinar o número de cópias dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4. PCR em tempo real (SYBR Green) foi realizado para confirmar os dados de MLPA para os genes IGF1R e SF1. Resultados: Amplificação do gene IGF1R foi detectada por MLPA e confirmada por PCR em tempo real SYBR Green em apenas um carcinoma adrenocortical. Adicionalmente, amplificação gênica de outros loci (IGFBP3, FGFR4 e NSD1) bem como de sondas controles foi observada, sugerindo uma condição aneuplóide neste tumor maligno. Amplificação de SF1 foi detectada em 10 tumores adrenocorticais (8 pediátricos e 2 de adultos). Os valores de expressão gênica foram significantemente maiores em tumores associados com amplificação gênica quando comparados com tumores sem amplificação. Além disso, imunorreatividade para SF-1 foi detectada nos tumores com aumento no número de cópias. Doze amplificações do locus FGFR4 (3 pediátricos e 9 de adultos) foram demonstradas por MLPA. A amplificação do locus FGFR4 e hiperexpressão deste gene foram significantemente mais relacionados a carcinomas. Conclusões: Amplificação do gene IGF1R é um evento raro nos tumores adrenocorticais pediátricos e de adultos. A hiperexpressão de IGF1R em tumores adrenocorticais pediátricos não foi secundária à amplificação gênica. Amplificação do gene SF1 foi evidenciada predominantemente em tumores adrenocorticais pediátricos e se correlacionou com hiperexpressão gênica e protéica. Amplificação do locus FGFR4 foi demonstrada predominantemente em tumores adrenocorticais malignos de adultos. Amplificação de oncogenes representa um mecanismo molecular relevante na tumorigênese adrenocortical / Introduction: A high incidence of adrenocortical tumors in children and adults has been observed in Southern and Southeastern regions of Brazil. Overexpression of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes have been described in adrenocortical tumors. Despite of overexpression be a common event in several neoplasias, the molecular mechanism implicated in this upregulation remains unknown. Objectives: To determine the copy number of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes in pediatric and adult adrenocortical tumors. Additionally, correlate with IGF1R, SF1 and FGFR4 gene and/or protein expression data as well as with the histological diagnosis and evolution of the adrenocortical tumors. Patients and methods: Sixty and four patients with adrenocortical tumors were selected for this study. All patients were submitted to clinical evaluation and surgical treatment. Eight normal adrenal glands obtained in renal surgery or autopsies were used as controls. The MLPA reactions were performed with the DNA extracted from adrenal gland tissues in order to determine the copy number of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes. SYBR Green real-time PCR was carried out to confirm MLPA data for IGF1R and SF1 genes. Results: IGF1R amplification was detected by MLPA and confirmed by SYBR green real-time PCR in only one adrenocortical carcinoma. Additionally, other loci amplification was detected (IGFBP3, FGFR4 and NSD1) as well as for control probes, suggesting aneuploidy in this malignant tumor. SF1 amplifications were shown in 10 adrenocortical tumors (8 from children and 2 from adults). The SF1 mRNA levels were significantly higher in adrenocortical tumors associated with increased SF1 gene copies when compared with adrenocortical tumors without gene amplification. Moreover, all adrenocortical tumors with SF1 gene amplification showed a strong SF1 staining. Twelve FGFR4 locus amplifications (3 from children and 9 from adults) were demonstrated by MLPA. FGFR4 locus amplification and overexpression of this gene were significantly more related to carcinomas. Conclusions: IGF1R amplification is a rare event in adrenocortical tumors and it was not responsible for the IGF1R overexpression of pediatric and adult adrenocortical tumors. SF1 gene amplification was detected predominantly in pediatric adrenocortical tumors and was associated with gene and protein overexpression. FGFR4 locus amplification was demonstrated mainly in adult maligant adrenocortical tumors. FGFR4 amplification and upregulation were more associated to adrenocortical carcinomas. Oncogenes amplification represents an important molecular mechanism in adrenocortical tumorigenesis

Introdução: Uma elevada incidência de tumores adrenocorticais pediátricos e de adultos é observada nas regiões sul e sudeste do Brasil. Hiperexpressão dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4 tem sido descrita em tumores adrenocorticais. Apesar de hiperexpressão ser um evento comum em diversas neoplasias, ainda não são claros os mecanismos moleculares que seriam responsáveis por essa falha na regulação da expressão. Objetivos: Determinar o número de cópias dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4 em tumores adrenocorticais diagnosticados em crianças e adultos. Adicionalmente correlacionaremos os dados de expressão gênica e/ou protéica de IGF1R, SF1 e FGFR4 com o diagnóstico histológico e evolutivo dos tumores adrenocorticais. Pacientes e métodos: Sessenta e quatro pacientes com tumores adrenocorticais foram selecionados para o estudo. Todos os pacientes foram submetidos à avaliação clínica e tratamento cirúrgico. Oito glândulas adrenais normais obtidas em cirurgias renais ou autópsias foram utilizadas como controles. DNA genômico extraído dos tecidos normais e tumorais da glândula suprarrenal foram utilizados como substrato nas reações de multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) com o intuito de se determinar o número de cópias dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4. PCR em tempo real (SYBR Green) foi realizado para confirmar os dados de MLPA para os genes IGF1R e SF1. Resultados: Amplificação do gene IGF1R foi detectada por MLPA e confirmada por PCR em tempo real SYBR Green em apenas um carcinoma adrenocortical. Adicionalmente, amplificação gênica de outros loci (IGFBP3, FGFR4 e NSD1) bem como de sondas controles foi observada, sugerindo uma condição aneuplóide neste tumor maligno. Amplificação de SF1 foi detectada em 10 tumores adrenocorticais (8 pediátricos e 2 de adultos). Os valores de expressão gênica foram significantemente maiores em tumores associados com amplificação gênica quando comparados com tumores sem amplificação. Além disso, imunorreatividade para SF-1 foi detectada nos tumores com aumento no número de cópias. Doze amplificações do locus FGFR4 (3 pediátricos e 9 de adultos) foram demonstradas por MLPA. A amplificação do locus FGFR4 e hiperexpressão deste gene foram significantemente mais relacionados a carcinomas. Conclusões: Amplificação do gene IGF1R é um evento raro nos tumores adrenocorticais pediátricos e de adultos. A hiperexpressão de IGF1R em tumores adrenocorticais pediátricos não foi secundária à amplificação gênica. Amplificação do gene SF1 foi evidenciada predominantemente em tumores adrenocorticais pediátricos e se correlacionou com hiperexpressão gênica e protéica. Amplificação do locus FGFR4 foi demonstrada predominantemente em tumores adrenocorticais malignos de adultos. Amplificação de oncogenes representa um mecanismo molecular relevante na tumorigênese adrenocortical / Introduction: A high incidence of adrenocortical tumors in children and adults has been observed in Southern and Southeastern regions of Brazil. Overexpression of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes have been described in adrenocortical tumors. Despite of overexpression be a common event in several neoplasias, the molecular mechanism implicated in this upregulation remains unknown. Objectives: To determine the copy number of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes in pediatric and adult adrenocortical tumors. Additionally, correlate with IGF1R, SF1 and FGFR4 gene and/or protein expression data as well as with the histological diagnosis and evolution of the adrenocortical tumors. Patients and methods: Sixty and four patients with adrenocortical tumors were selected for this study. All patients were submitted to clinical evaluation and surgical treatment. Eight normal adrenal glands obtained in renal surgery or autopsies were used as controls. The MLPA reactions were performed with the DNA extracted from adrenal gland tissues in order to determine the copy number of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes. SYBR Green real-time PCR was carried out to confirm MLPA data for IGF1R and SF1 genes. Results: IGF1R amplification was detected by MLPA and confirmed by SYBR green real-time PCR in only one adrenocortical carcinoma. Additionally, other loci amplification was detected (IGFBP3, FGFR4 and NSD1) as well as for control probes, suggesting aneuploidy in this malignant tumor. SF1 amplifications were shown in 10 adrenocortical tumors (8 from children and 2 from adults). The SF1 mRNA levels were significantly higher in adrenocortical tumors associated with increased SF1 gene copies when compared with adrenocortical tumors without gene amplification. Moreover, all adrenocortical tumors with SF1 gene amplification showed a strong SF1 staining. Twelve FGFR4 locus amplifications (3 from children and 9 from adults) were demonstrated by MLPA. FGFR4 locus amplification and overexpression of this gene were significantly more related to carcinomas. Conclusions: IGF1R amplification is a rare event in adrenocortical tumors and it was not responsible for the IGF1R overexpression of pediatric and adult adrenocortical tumors. SF1 gene amplification was detected predominantly in pediatric adrenocortical tumors and was associated with gene and protein overexpression. FGFR4 locus amplification was demonstrated mainly in adult maligant adrenocortical tumors. FGFR4 amplification and upregulation were more associated to adrenocortical carcinomas. Oncogenes amplification represents an important molecular mechanism in adrenocortical tumorigenesis

Introdução: Os mecanismos envolvidos na patogênese molecular dos tumores hipofisários corticotróficos são complexos, heterogêneos e permanecem na maioria dos casos desconhecidos. Alterações da expressão de componentes da via Ikaros (Ik), tais como do receptor 4 dos fatores de crescimento de fibroblastos (FGFR4) têm sido detectadas em tumores hipofisários, inclusive nos corticotropinomas. O desbalanço entre as isoformas longas e curtas do Ikaros resulta em um início de transcrição alternativa do FGFR4, codificando uma isoforma truncada do gene (pdt- FGFR4) que foi associada a tumores hipofisários maiores e mais invasivos. A isoforma curta Ik6 promove a expressão do fator anti-apoptótico Bcl-XL in vitro, um efeito independente da interação com as isoformas longas. Além disso, um polimorfismo do FGFR4, com substituição da glicina por arginina no códon 388 (G388R), tem sido associado à evolução desfavorável em vários tipos tumorais humanos. Objetivos: Analisar a expressão do Bcl-XL, das isoformas do Ikaros (Ik1+Ik2/Ik total) e do FGFR4 em corticotropinomas humanos. Avaliar a freqüência dos genótipos do códon 388 do FGFR4 nos pacientes com doença de Cushing e sua associação com a evolução pósoperatória após a primeira cirurgia transesfenoidal. Métodos: Noventa e sete pacientes com diagnóstico de doença de Cushing foram estudados. Os dados clínicos, hormonais e histopatológicos foram avaliados retrospectivamente. O estudo da expressão do Bcl-XL, do Ikaros, e do FGFR4 foi realizado por PCR em tempo real em 20 amostras de corticotropinomas, sendo dois tumores correspondentes à síndrome de Nelson. A determinação dos genótipos no códon 388 do FGFR4 foi realizada nos 97 pacientes e em 103 indivíduos controles, por PCR de fragmento do exon 9 do gene FGFR4 seguida de digestão com a enzima de restrição BstNI. A evolução pós-operatória (remissão/recidiva) da doença de Cushing foi avaliada em 76 pacientes. Foram considerados em remissão aqueles pacientes com níveis normais de cortisol urinário durante todo o primeiro ano após a cirurgia, na ausência de reposição hormonal, bem como os que necessitaram de reposição com glicocorticóide no mesmo período. Resultados: Dos 76 pacientes submetidos à primeira cirurgia transesfenoidal, a remissão pós-operatória ocorreu em 68,4% dos pacientes. Treze pacientes (25%) evoluíram com recidiva da doença de Cushing após remissão inicial. A expressão do Bcl-XL foi semelhante à hipófise normal na maioria das amostras tumorais [mediana (mín-máx): 1,36 (0,6 - 2,70)]. Aumento da expressão das isoformas longas do Ikaros foi detectado em 40% dos tumores, enquanto as isoformas curtas corresponderam a mais de 50% da expressão do Ikaros em apenas 3 casos, não havendo associação da expressão do Ikaros com qualquer das variáveis analisadas. O aumento da expressão do FGFR4 foi detectado em 8/18 (44,4%) dos corticotropinomas com doença de Cushing, havendo associação entre a hiperexpressão do FGFR4 e a menor freqüência de remissão pós-operatória da doença de Cushing (p = 0,009). A distribuição genotípica do polimorfismo G388R foi semelhante entre pacientes e controles. O genótipo glicina em homozigose (Gly/Gly) não foi associado à menor frequência de remissão pós-operatória da doença, no entanto, uma freqüência maior de recidiva pós-operatória foi encontrada no grupo de pacientes Gly/Gly (p = 0,019). O genótipo Gly/Gly foi ainda associado à redução da sobrevida livre de doença (hazard ratio [HR], 6,91; Intervalo de Confiança (IC) de 95%, 1,14 a 11,26; p = 0,028). Outras variáveis que se associaram significativamente com maior freqüência de recidiva foram: tamanho e grau de invasão tumoral de acordo com a classificação de Hardy modificada (p = 0,017), o sexo masculino (p = 0,033), a não confirmação Imuno-histológica do tumor produtor de ACTH (p = 0,026) e os valores de cortisol > 2 ?g/dL no pós-operatório precoce (p = 0,01). Conclusões: A expressão normal detectada do Bcl-XL e das isoformas curtas do Ikaros, na maioria das amostras tumorais, sugere a não participação destes fatores na patogênese dos tumores corticotróficos. O aumento da expressão do FGFR4 e o genótipo glicina em homozigose foram associados, respectivamente, à menor freqüência de remissão e maior recidiva pós-operatória da doença de Cushing. Estes resultados sugerem que o FGFR4 pode ter um papel na progressão dos tumores corticotróficos favorecendo a persistência e/ou recidiva da doença de Cushing. / Introduction: The mechanisms involved in the molecular pathogenesis of corticotroph pituitary tumors are complex, heterogeneous and in most cases remain unknown. Changes in the expression of components of Ikaros (Ik) pathway, such as receptor 4 of fibroblast growth factor (FGFR4), have been detected in pituitary tumors including corticotropinomas. Imbalance between long and short Ik isoforms results in alternative transcription initiation of FGFR4 and encodes a truncated isoform of the gene (pdt-FGFR4) which was associated with larger and more invasive pituitary tumors. The Ik6 short isoform promotes Bcl-XL expression in vitro, an effect independent of the interaction with the long isoforms. In addition, a polymorphism of FGFR4 gene, the substitution of glycine by arginine at codon 388 (G388R), has been associated with adverse outcome in several human tumor types. Objectives: To analyze the expression of Bcl-XL, Ikaros isoforms (Ik1 + Ik2/Ikaros total), and FGFR4 in human corticotropinomas. To determine the frequency of each genotype at codon 388 of FGFR4 in patients with Cushing\'s disease and its association with the postoperative outcome after the first transsphenoidal surgery. Methods: Ninety-seven patients with Cushing\'s disease were evaluated. Clinical, hormonal and histopathological findings were assessed retrospectively. The expression of Bcl-XL, Ikaros and FGFR4 were evaluated by real-time PCR in 20 samples of corticotropinomas, including two samples of Nelson\'s syndrome. The FGFR4 genotype was determined in the 97 patients and 103 control subjects by PCR fragment of exon 9 of the FGFR4 gene, followed by digestion with the BstNI restriction enzyme. The postoperative outcome (remission/relapse) of Cushing\'s disease was assessed in 76 patients. The patients with normal urinary cortisol levels during the first year after surgery, in the absence of hormone replacement therapy, and those who required glucocorticoid replacement within the same period were considered in remission. Results: Of the 76 patients who underwent the first transsphenoidal surgery, remission was achieved in 68.4% of patients. Thirteen patients (25%) developed recurrence of Cushing\'s disease after initial remission. The expression of Bcl-XL in the majority of tumor samples was similar to normal pituitary [median (min-max): 1.36 (0.6 - 2.70)]. Overexpression of long isoforms of Ik was detected in 40% of tumors, while the short isoforms represented more than 50% of the expression in only 3 samples. Ik expression was not associated with any of the variables analysed. FGFR4 transcripts were overexpressed in 8/18 (44.4%) of corticotropinomas with Cushing\'s disease. There was an association between the overexpression of FGFR4 and lower postoperative remission rate (p = 0.009). The FGFR4 genotype distribution at codon 388 was similar between control individuals and patients. The glycine homozygous genotype (Gly/Gly) was not associated with lower remission rate. However, a higher frequency of postoperative recurrence was found in the Gly/Gly group (p = 0.019). The Gly/Gly genotype was also associated with reduced disease-free survival (hazard ratio [HR] 6.91, confidence interval (CI) 95%, 1.14 to 11.26; p = 0.028). Other variables that were significantly associated with higher frequency of recurrence were: size and tumor invasion according to modified Hardy classification (p = 0.017), male gender (p = 0.033), non-immuno-histological confirmation of ACTH secreting tumor (p = 0.026) and cortisol levels > 2 ?g/dL in the early postoperative period (p = 0.01). Conclusions: The normal expression of Bcl-XL and short isoforms of Ik in most samples suggest that these factors are not involved in the pathogenesis of corticotroph tumors. Overexpression of FGFR4 and the glycine homozygous genotype were associated with lower frequency of remission and higher postoperative recurrence of Cushing\'s disease, respectively. These results suggest that FGFR4 may play a role in progression of corticotroph tumors favoring the persistence and/or recurrence of Cushing\'s disease.

Introdução: Os mecanismos envolvidos na patogênese molecular dos tumores hipofisários corticotróficos são complexos, heterogêneos e permanecem na maioria dos casos desconhecidos. Alterações da expressão de componentes da via Ikaros (Ik), tais como do receptor 4 dos fatores de crescimento de fibroblastos (FGFR4) têm sido detectadas em tumores hipofisários, inclusive nos corticotropinomas. O desbalanço entre as isoformas longas e curtas do Ikaros resulta em um início de transcrição alternativa do FGFR4, codificando uma isoforma truncada do gene (pdt- FGFR4) que foi associada a tumores hipofisários maiores e mais invasivos. A isoforma curta Ik6 promove a expressão do fator anti-apoptótico Bcl-XL in vitro, um efeito independente da interação com as isoformas longas. Além disso, um polimorfismo do FGFR4, com substituição da glicina por arginina no códon 388 (G388R), tem sido associado à evolução desfavorável em vários tipos tumorais humanos. Objetivos: Analisar a expressão do Bcl-XL, das isoformas do Ikaros (Ik1+Ik2/Ik total) e do FGFR4 em corticotropinomas humanos. Avaliar a freqüência dos genótipos do códon 388 do FGFR4 nos pacientes com doença de Cushing e sua associação com a evolução pósoperatória após a primeira cirurgia transesfenoidal. Métodos: Noventa e sete pacientes com diagnóstico de doença de Cushing foram estudados. Os dados clínicos, hormonais e histopatológicos foram avaliados retrospectivamente. O estudo da expressão do Bcl-XL, do Ikaros, e do FGFR4 foi realizado por PCR em tempo real em 20 amostras de corticotropinomas, sendo dois tumores correspondentes à síndrome de Nelson. A determinação dos genótipos no códon 388 do FGFR4 foi realizada nos 97 pacientes e em 103 indivíduos controles, por PCR de fragmento do exon 9 do gene FGFR4 seguida de digestão com a enzima de restrição BstNI. A evolução pós-operatória (remissão/recidiva) da doença de Cushing foi avaliada em 76 pacientes. Foram considerados em remissão aqueles pacientes com níveis normais de cortisol urinário durante todo o primeiro ano após a cirurgia, na ausência de reposição hormonal, bem como os que necessitaram de reposição com glicocorticóide no mesmo período. Resultados: Dos 76 pacientes submetidos à primeira cirurgia transesfenoidal, a remissão pós-operatória ocorreu em 68,4% dos pacientes. Treze pacientes (25%) evoluíram com recidiva da doença de Cushing após remissão inicial. A expressão do Bcl-XL foi semelhante à hipófise normal na maioria das amostras tumorais [mediana (mín-máx): 1,36 (0,6 - 2,70)]. Aumento da expressão das isoformas longas do Ikaros foi detectado em 40% dos tumores, enquanto as isoformas curtas corresponderam a mais de 50% da expressão do Ikaros em apenas 3 casos, não havendo associação da expressão do Ikaros com qualquer das variáveis analisadas. O aumento da expressão do FGFR4 foi detectado em 8/18 (44,4%) dos corticotropinomas com doença de Cushing, havendo associação entre a hiperexpressão do FGFR4 e a menor freqüência de remissão pós-operatória da doença de Cushing (p = 0,009). A distribuição genotípica do polimorfismo G388R foi semelhante entre pacientes e controles. O genótipo glicina em homozigose (Gly/Gly) não foi associado à menor frequência de remissão pós-operatória da doença, no entanto, uma freqüência maior de recidiva pós-operatória foi encontrada no grupo de pacientes Gly/Gly (p = 0,019). O genótipo Gly/Gly foi ainda associado à redução da sobrevida livre de doença (hazard ratio [HR], 6,91; Intervalo de Confiança (IC) de 95%, 1,14 a 11,26; p = 0,028). Outras variáveis que se associaram significativamente com maior freqüência de recidiva foram: tamanho e grau de invasão tumoral de acordo com a classificação de Hardy modificada (p = 0,017), o sexo masculino (p = 0,033), a não confirmação Imuno-histológica do tumor produtor de ACTH (p = 0,026) e os valores de cortisol > 2 ?g/dL no pós-operatório precoce (p = 0,01). Conclusões: A expressão normal detectada do Bcl-XL e das isoformas curtas do Ikaros, na maioria das amostras tumorais, sugere a não participação destes fatores na patogênese dos tumores corticotróficos. O aumento da expressão do FGFR4 e o genótipo glicina em homozigose foram associados, respectivamente, à menor freqüência de remissão e maior recidiva pós-operatória da doença de Cushing. Estes resultados sugerem que o FGFR4 pode ter um papel na progressão dos tumores corticotróficos favorecendo a persistência e/ou recidiva da doença de Cushing. / Introduction: The mechanisms involved in the molecular pathogenesis of corticotroph pituitary tumors are complex, heterogeneous and in most cases remain unknown. Changes in the expression of components of Ikaros (Ik) pathway, such as receptor 4 of fibroblast growth factor (FGFR4), have been detected in pituitary tumors including corticotropinomas. Imbalance between long and short Ik isoforms results in alternative transcription initiation of FGFR4 and encodes a truncated isoform of the gene (pdt-FGFR4) which was associated with larger and more invasive pituitary tumors. The Ik6 short isoform promotes Bcl-XL expression in vitro, an effect independent of the interaction with the long isoforms. In addition, a polymorphism of FGFR4 gene, the substitution of glycine by arginine at codon 388 (G388R), has been associated with adverse outcome in several human tumor types. Objectives: To analyze the expression of Bcl-XL, Ikaros isoforms (Ik1 + Ik2/Ikaros total), and FGFR4 in human corticotropinomas. To determine the frequency of each genotype at codon 388 of FGFR4 in patients with Cushing\'s disease and its association with the postoperative outcome after the first transsphenoidal surgery. Methods: Ninety-seven patients with Cushing\'s disease were evaluated. Clinical, hormonal and histopathological findings were assessed retrospectively. The expression of Bcl-XL, Ikaros and FGFR4 were evaluated by real-time PCR in 20 samples of corticotropinomas, including two samples of Nelson\'s syndrome. The FGFR4 genotype was determined in the 97 patients and 103 control subjects by PCR fragment of exon 9 of the FGFR4 gene, followed by digestion with the BstNI restriction enzyme. The postoperative outcome (remission/relapse) of Cushing\'s disease was assessed in 76 patients. The patients with normal urinary cortisol levels during the first year after surgery, in the absence of hormone replacement therapy, and those who required glucocorticoid replacement within the same period were considered in remission. Results: Of the 76 patients who underwent the first transsphenoidal surgery, remission was achieved in 68.4% of patients. Thirteen patients (25%) developed recurrence of Cushing\'s disease after initial remission. The expression of Bcl-XL in the majority of tumor samples was similar to normal pituitary [median (min-max): 1.36 (0.6 - 2.70)]. Overexpression of long isoforms of Ik was detected in 40% of tumors, while the short isoforms represented more than 50% of the expression in only 3 samples. Ik expression was not associated with any of the variables analysed. FGFR4 transcripts were overexpressed in 8/18 (44.4%) of corticotropinomas with Cushing\'s disease. There was an association between the overexpression of FGFR4 and lower postoperative remission rate (p = 0.009). The FGFR4 genotype distribution at codon 388 was similar between control individuals and patients. The glycine homozygous genotype (Gly/Gly) was not associated with lower remission rate. However, a higher frequency of postoperative recurrence was found in the Gly/Gly group (p = 0.019). The Gly/Gly genotype was also associated with reduced disease-free survival (hazard ratio [HR] 6.91, confidence interval (CI) 95%, 1.14 to 11.26; p = 0.028). Other variables that were significantly associated with higher frequency of recurrence were: size and tumor invasion according to modified Hardy classification (p = 0.017), male gender (p = 0.033), non-immuno-histological confirmation of ACTH secreting tumor (p = 0.026) and cortisol levels > 2 ?g/dL in the early postoperative period (p = 0.01). Conclusions: The normal expression of Bcl-XL and short isoforms of Ik in most samples suggest that these factors are not involved in the pathogenesis of corticotroph tumors. Overexpression of FGFR4 and the glycine homozygous genotype were associated with lower frequency of remission and higher postoperative recurrence of Cushing\'s disease, respectively. These results suggest that FGFR4 may play a role in progression of corticotroph tumors favoring the persistence and/or recurrence of Cushing\'s disease.