O fator de crescimento neural (NGF) está relacionado à dor e ao aumento de Substância P (SP). Ressonância magnética funcional de forma não invasiva investiga áreas cerebrais. O Anti-NGF é um tratamento para dor, porém não investigado em dor neuropática. Nós avaliamos no modelo CCI a resposta comportamental e o envolvimento do NGF e da SP após tratamento com o Anti-NGF. Nós observamos NGF aumentado a longo prazo no gânglio da coluna posterior (DRG) e na medula espinal, já a SP aumentada no DRG em ambos os tempos e apenas tardiamente na medula espinal. O tratamento com Anti-NGF diminuiu a nocicepção dos animais. O Anti-NGF reverteu os altos níveis de NGF e SP no DRG e na medula espinal. Houve aumento de Fos no grupo CCI e diminuição após tratamento com Anti-NGF no córtex cingulado anterior. Observamos modificações da conectividade do tálamo, córtex somatossensorial primário e córtex cingulado com todo o encéfalo. Esperamos que estes resultados possam ser usados para o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica que auxilie pacientes com dor neuropática crônica. / Nerve growth factor (NGF) is related to pain and increase of Substance P (SP). Non-invasively functional magnetic resonance imaging investigates brain areas. Anti-NGF is a treatment for pain, but not investigated in neuropathic pain. We evaluated the behavioral response and the involvement of NGF and SP in the CCI model after Anti-NGF treatment. We observed increased long-term NGF in the dorsal root ganglion (DRG) and spinal cord, as well as increased SP in DRG at both time and only late in the spinal cord. Treatment with Anti-NGF decreased the nociception of the animals. Anti-NGF reversed high levels of NGF and SP in DRG and spinal cord. There was an increase in Fos in CCI group and a decrease after Anti-NGF treatment in the anterior cingulate cortex. We observed changes in the connectivity of the thalamus, primary somatosensory cortex and cingulate cortex with the entire brain. We hope that these results can be used to develop a therapeutic strategy that will help patients with chronic neuropathic pain.

O uso de células-tronco mesenquimais (CTMs) na medicina regenerativa, principalmente quando associado ao sistema nervoso, requer alternativas em relação à via de aplicação. A associação da terapia celular com a nanotecnologia para uso em neurociências, desenvolvida nesse trabalho, é uma abordagem inovadora no Brasil. Dessa forma, as matrizes de nanofibras, produzidas pela técnica de electrospinning (ES), funcionam como suportes para a proliferação e diferenciação celular proporcionando uma alternativa para a reconstituição do tecido lesado. O processo de regeneração do tecido neural pode ser aperfeiçoado com a liberação controlada de fatores neurotróficos, através do uso dessas matrizes. Entre esses fatores, encontra-se o NGF (Nerve Growth Factor – fator de crescimento neural), o qual exerce um papel central no desenvolvimento, manutenção e sobrevivência dos neurônios. Além disso, características de superfície das matrizes, como o alinhamento de nanofibras, podem estimular a diferencição neural. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver matrizes de nanofibras alinhadas e não alinhadas com e sem o NGF incorporado, através da técnica ES de emulsão. Além disso, objetivou-se avaliar o comportamento celular, bem como a capacidade de diferenciação neural das CTMs, sobre as estruturas tridimensionais desenvolvidas. As CTMs foram extraídas da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Quatro grupos de scaffolds foram desenvolvidos, caracterizados e avaliados: scaffolds com fibras randomizadas e com fibras alinhadas, sendo cada tipo com e sem o NGF incorporado. As análises físico-químicas realizadas foram morfologia, diâmetro das fibras e degradabilidade do biomaterial. Os parâmetros biológicos avaliados foram morfologia, adesão, viabilidade e proliferação celular, bem como a citotoxicidade frente ao biomaterial. A diferenciação neural foi quantificada através da expressão dos genes neurais nestina, β- III tubulina e NSE (enolase específica para neurônios). As matrizes de nanofibras produzidas mostraram-se satisfatórias para o cultivo de CTMs, mimetizando a estrutura física da matriz extracelular (MEC). Além disso, a técnica utilizada permitiu a obtenção de estruturas com nanofibras alinhadas e randomizadas. As CTMs cultivadas nas matrizes foram capazes de aderir e proliferar com vantagens para adesão nas matrizes alinhadas contendo o NGF, em relação às matrizes alinhadas controle. As estruturas produzidas não apresentaram características tóxicas permitindo que as CTMs mantivessem a viabilidade ao longo do tempo. A avaliação da diferenciação neural das CTMs indicou que todos os grupos de matrizes foram capazes de promover o aumento da expressão de genes neurais. Tal capacidade foi observada tanto para CTMs cultivadas sobre as matrizes com o meio controle quanto com o meio de indução neural. Esses achados mostram a possível influência das características químicas e topográficas providas pelos substratos produzidos. As características da matriz artificial permitem que as CTMs respondam adequadamente ao microambiente e expressem genes neurais, podendo auxiliar na regeneração tecidual quando aplicada em lesões do sistema nervoso. / The use of mesenchymal stem cells (MSCs) in regenerative medicine, particularly when associated with the nervous system, requires alternatives with respect to cell application methods. The association of cellular therapy with nanotechnology for use in neuroscience, developed with this work, is an innovative approach in Brazil. Scaffolds produced by electrospinning (ES) technique act as supports for cell proliferation and differentiation, providing an alternative to reconstitute the damaged tissue. The process of neural tissue regeneration can be improved through the controlled release of neurotrophic factors from the scaffolds. Among these factors, NGF (Nerve Growth Factor) plays a central role in the development, maintenance and survival of neurons. Furthermore, surface characteristics of nanofibers, such as alignment, can stimulate neural differentiation. The main objective of this study was to develop aligned nanofiber scaffolds and random nanofiber scaffolds with and without NGF incorporated through emulsion ES. In addition it was aimed to characterize the physico-chemical properties of the scaffolds, related to the extracellular matrix (ECM) and evaluate the cell behavior, as well as the neural differentiation on these three-dimensional devices. The MSCs were extracted from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth. Four groups of scaffolds were developed, characterized and evaluated: scaffolds with randomized fibers and with aligned fibers, each type with and without NGF incorporated. The physico-chemical analyzes performed were morphology, fiber diameter and degradability of the biomaterial. The biological parameters evaluated were cell morphology, adhesion, proliferation and viability, as well as cytotoxicity by the biomaterial. The neural differentiation was quantified by measuring gene expression for the neural genes nestin, β-III tubulin and NSE (neuron-specific enolase). The scaffolds produced demonstrated a satisfactory environment for MSC growth, mimicking the ECM physical structure. Furthermore, the technique allowed for the production of scaffolds with aligned and with randomized nanofibers. MSCs cultured on scaffolds were able to adhere and proliferate, with better adhesion performance on aligned nanofiber scaffolds with NGF incorporated, when compared to aligned nanofiber scaffolds control. The devices produced showed nontoxic characteristics permitting MSCs to maintain their viability over time. The evaluation of MSC neural differentiation indicated that all groups of scaffolds were able to upregulate neural genes expression. Such ability was observed for both MSCs cultured on scaffolds with control medium as on scaffolds under neural induction medium. These features provided by this artificial ECM permit proper MSC response to microenvironment, leading to neuronal genes expression, which could improve tissue regeneration when applied to nerve lesions.

O uso de células-tronco mesenquimais (CTMs) na medicina regenerativa, principalmente quando associado ao sistema nervoso, requer alternativas em relação à via de aplicação. A associação da terapia celular com a nanotecnologia para uso em neurociências, desenvolvida nesse trabalho, é uma abordagem inovadora no Brasil. Dessa forma, as matrizes de nanofibras, produzidas pela técnica de electrospinning (ES), funcionam como suportes para a proliferação e diferenciação celular proporcionando uma alternativa para a reconstituição do tecido lesado. O processo de regeneração do tecido neural pode ser aperfeiçoado com a liberação controlada de fatores neurotróficos, através do uso dessas matrizes. Entre esses fatores, encontra-se o NGF (Nerve Growth Factor – fator de crescimento neural), o qual exerce um papel central no desenvolvimento, manutenção e sobrevivência dos neurônios. Além disso, características de superfície das matrizes, como o alinhamento de nanofibras, podem estimular a diferencição neural. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver matrizes de nanofibras alinhadas e não alinhadas com e sem o NGF incorporado, através da técnica ES de emulsão. Além disso, objetivou-se avaliar o comportamento celular, bem como a capacidade de diferenciação neural das CTMs, sobre as estruturas tridimensionais desenvolvidas. As CTMs foram extraídas da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Quatro grupos de scaffolds foram desenvolvidos, caracterizados e avaliados: scaffolds com fibras randomizadas e com fibras alinhadas, sendo cada tipo com e sem o NGF incorporado. As análises físico-químicas realizadas foram morfologia, diâmetro das fibras e degradabilidade do biomaterial. Os parâmetros biológicos avaliados foram morfologia, adesão, viabilidade e proliferação celular, bem como a citotoxicidade frente ao biomaterial. A diferenciação neural foi quantificada através da expressão dos genes neurais nestina, β- III tubulina e NSE (enolase específica para neurônios). As matrizes de nanofibras produzidas mostraram-se satisfatórias para o cultivo de CTMs, mimetizando a estrutura física da matriz extracelular (MEC). Além disso, a técnica utilizada permitiu a obtenção de estruturas com nanofibras alinhadas e randomizadas. As CTMs cultivadas nas matrizes foram capazes de aderir e proliferar com vantagens para adesão nas matrizes alinhadas contendo o NGF, em relação às matrizes alinhadas controle. As estruturas produzidas não apresentaram características tóxicas permitindo que as CTMs mantivessem a viabilidade ao longo do tempo. A avaliação da diferenciação neural das CTMs indicou que todos os grupos de matrizes foram capazes de promover o aumento da expressão de genes neurais. Tal capacidade foi observada tanto para CTMs cultivadas sobre as matrizes com o meio controle quanto com o meio de indução neural. Esses achados mostram a possível influência das características químicas e topográficas providas pelos substratos produzidos. As características da matriz artificial permitem que as CTMs respondam adequadamente ao microambiente e expressem genes neurais, podendo auxiliar na regeneração tecidual quando aplicada em lesões do sistema nervoso. / The use of mesenchymal stem cells (MSCs) in regenerative medicine, particularly when associated with the nervous system, requires alternatives with respect to cell application methods. The association of cellular therapy with nanotechnology for use in neuroscience, developed with this work, is an innovative approach in Brazil. Scaffolds produced by electrospinning (ES) technique act as supports for cell proliferation and differentiation, providing an alternative to reconstitute the damaged tissue. The process of neural tissue regeneration can be improved through the controlled release of neurotrophic factors from the scaffolds. Among these factors, NGF (Nerve Growth Factor) plays a central role in the development, maintenance and survival of neurons. Furthermore, surface characteristics of nanofibers, such as alignment, can stimulate neural differentiation. The main objective of this study was to develop aligned nanofiber scaffolds and random nanofiber scaffolds with and without NGF incorporated through emulsion ES. In addition it was aimed to characterize the physico-chemical properties of the scaffolds, related to the extracellular matrix (ECM) and evaluate the cell behavior, as well as the neural differentiation on these three-dimensional devices. The MSCs were extracted from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth. Four groups of scaffolds were developed, characterized and evaluated: scaffolds with randomized fibers and with aligned fibers, each type with and without NGF incorporated. The physico-chemical analyzes performed were morphology, fiber diameter and degradability of the biomaterial. The biological parameters evaluated were cell morphology, adhesion, proliferation and viability, as well as cytotoxicity by the biomaterial. The neural differentiation was quantified by measuring gene expression for the neural genes nestin, β-III tubulin and NSE (neuron-specific enolase). The scaffolds produced demonstrated a satisfactory environment for MSC growth, mimicking the ECM physical structure. Furthermore, the technique allowed for the production of scaffolds with aligned and with randomized nanofibers. MSCs cultured on scaffolds were able to adhere and proliferate, with better adhesion performance on aligned nanofiber scaffolds with NGF incorporated, when compared to aligned nanofiber scaffolds control. The devices produced showed nontoxic characteristics permitting MSCs to maintain their viability over time. The evaluation of MSC neural differentiation indicated that all groups of scaffolds were able to upregulate neural genes expression. Such ability was observed for both MSCs cultured on scaffolds with control medium as on scaffolds under neural induction medium. These features provided by this artificial ECM permit proper MSC response to microenvironment, leading to neuronal genes expression, which could improve tissue regeneration when applied to nerve lesions.

A dor neuropática (DN) é causada por uma lesão primária ou por uma disfunção no sistema nervoso periférico (SNP) ou central (SNC), sendo que os principais sintomas são a alodinia mecânica e a hiperalgesia a estímulos térmicos e mecânicos. A DN apresenta resposta analgésica insuficiente com terapeuticas farmacológicas clássicas, sendo um desafio para o tratamento clínico. Técnicas de neuromodulação central, como a estimulação transcraniana por corrente contínua (ETCC), representam um recurso promissor no manejo da dor, uma vez que promovem neuroplasticidade em vias envolvidas com o processo doloroso, sendo um método não-invasivo que pode ser combinado com outras terapias. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do tratamento repetido com ETCC na resposta hiperalgésica térmica e mecânica em modelo experimental de DN. Adicionalmente, foram avaliados os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF em estruturas do SNC destes animais. Todos os procedimentos foram aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/HCPA:120512). Oitenta e quatro ratos machos Wistar foram divididos em 7 grupos: controle, dor neuropática, dor neuropática+ETCC, dor neuropática+sham ETCC, sham dor neuropática, sham dor neuropática+ETCC e sham dor neuropática+sham ETCC. O modelo de DN foi induzido por meio de ligura parcial do nervo isquiático na pata esquerda. O sham do modelo de DN seguiu o mesmo protocolo, com simulação da ligadura parcial do nervo isquiático e o grupo controle não sofreu nenhuma manipulação. O tratamento com ETCC consistiu em 20minutos/dia/8 dias, com intensidade de 0,5mA. Para o sham do tratamento, os eletrodos foram apenas fixados à cabeça do animal durante 20 minutos/dia/8 dias, sem nenhuma estimulação. A hiperalgesia térmica e mecânica foi avaliada por meio dos testes da Placa Quente e de Von Frey, respectivamente, no tempo basal, 7 e 14 dias após a cirurgia e imediatamente, 24 horas e 7 dias após o final do tratamento. Os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF no cortex cerebral, medula espinhal e tronco cerebral foram determinados por ELISA 48 horas e 7 dias após o final do tratamento. A análise estatística para os testes nociceptivos foi realizada através da Generalized Estimation Equation (GEE)/Bonferroni e para as análises bioquímicas por ANOVA de uma via (IL-1β, IL-10, TNF-α ) e ANOVA de três vias (NGF). Os dados estão expressos como media+erro padrão da média, sendo considerado significativo p<0.05. Nossos resultados demonstraram que a DN altera os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF no SNC em curto e longo prazo. Além disso, a ETCC reduz a resposta nociceptiva a curto e longo prazo e na modulação dos níveis de citocinas no sistema nervoso central neste modelo. Evidencia-se a importância do papel do sistema imune central nos processos de continuidade da dor neuropática, que pode estar envolvido com as alterações neuroplásticas maladaptativas características dessa patologia. / Neuropathic pain (NP) is caused by a primary insult or dysfunction in the central or peripheral nervous system and its prevalence depends on the type of trauma and related dysfunction. The main symptoms are mechanical allodynia and hyperalgesia to both mechanical and thermal stimuli. NP often shows insufficient response to classic analgesics and remains a challenge to medical treatment and scientific research; and the search for new therapies for this pathology is of fundamental important. Central neuromodulation techniques, such as transcranial direct current stimulation (tDCS), represent a promising resource to pain management since they promote neuroplasticity in the central system of pain. Moreover, tDCS has the advantages of being a noninvasive technique and can be combined with other interventions. The aim of this study was investigated the effects of tDCS in the thermal and mechanical hyperalgesia induced by chronic constriction injury (CCI) of sciatic nerve and measured its effect on the neurochemical markers (IL-1β, IL-10, TNF-α, and NGF levels) on central nervous system structures. All experiments and procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (GPPG-HCPA No.120512) and performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals 8th ed. The CCI of sciatic nerve was used for the induction of NP. For sham surgery, the sciatic nerve was exposed similarly, but it was not ligated. The control group did not undergo surgical procedure. After the establishment of NP, the rats of treated groups were subjected to a 20 minutes session of anodal tDCS, every afternoon for eight days, under a direct constant current of 0.5 mA intensity. The thermal and mechanical hyperalgesia was assessed by Hot plate and Von Frey test, respectively, and evaluated on baseline, 7 and 14 days after surgery; immediately, 24 hours and 7 days after treatment. The IL-1β, IL-10, TNF-α and NGF levels on cortex, spinal cord and brainstem were determined by sandwich-ELISA at 48 hours and 7 days after the end of treatment. Data were expressed as the mean±standard error of the mean (S.E.M). Generalized Estimating Equation (GEE) followed by Bonferroni was performed to compare all groups in different times of nociceptive tests and to biochemical data the one-way ANOVA was used to compare the IL-1β, IL-10, TNF-α and three-way ANOVA was used to compare the NGF levels. P-values less than 0.05 were considered significant. SPSS 19.0 for Windows was used for statistical analysis. In summary, we showed that anodal tDCS is effective to relieve NP and modulate cytokine in CCI rat model, and its effect is observed at long-term. In addition, the CCI model induced increased NGF levels in cerebral cortex and spinal cord at long-lasting time, evidencing the important feature of this neurotrophin in neuropathic pain condition. Additionally, we observed an important role of the central immune system in the neuropathic process, which can be involved with the maladaptative neuroplastic changes.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do título de mestre em Ciências da Saúde. / A meningite pneumocócica é uma infecção grave do sistema nervoso central (SNC), com altas taxas de letalidade, que provoca redução do desempenho psicomotor, ligeira lentidão mental, comprometimento das funções executivas de atenção e deficiência de aprendizagem e memória. O estabilizador de humor de lítio é conhecido como um agente neuroprotetor com muitos efeitos no cérebro. O tamoxifeno é a terapia endócrina usual para o câncer de mama. Pesquisas experimentais demonstraram que o tamoxifeno desempenha papéis neuroprotetores na lesão medular, hemorragia intracerebral, isquemia cerebral e lesão cerebral hipóxico-isquêmica. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do lítio e do tamoxifeno sobre o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neurotrófico derivado de célula da glia (GDNF) e fator de crescimento neuronal (NGF) no hipocampo de animais submetidos ao modelo experimental de meningite pneumocócica. Neste estudo, os animais receberam líquido cefalorraquidiano (LCR) artificial como um placebo ou uma suspensão de Streptococcus pneumoniae na concentração de 5 x 109 unidades formadoras de colônias (UFC/mL). Dezoito horas após a indução, todos os animais receberam ceftriaxona (100 mg/kg via intraperitoneal (i.p.) durante 7 dias). A partir do terceiro ao décimo dia os animais receberam solução salina, lítio (47,5 mg/kg) ou tamoxifeno (1 mg/kg) como tratamento adjuvante e foram separados em seis grupos: controle/salina, controle/lítio, controle/tamoxifeno, meningite/salina, meningite/lítio e meningite/tamoxifeno e foram submetidos aos testes comportamentais. No teste de habituação ao campo aberto, os animais submetidos à meningite não apresentaram diferença entre as sessões de treino e teste, demonstrando comprometimento da memória. Nos grupos controle/salina, controle/lítio, controle/tamoxifeno e meningite/lítio, houve diferença demonstrando memória de habituação nestes animais. Na tarefa de esquiva inibitória, houve diferença entre as sessões de treino e teste nos grupos controle/salina, controle/lítio, controle/tamoxifeno e meningite/lítio, demonstrando memória aversiva de curto e longo prazo nestes grupos. Nos grupos meningite/salina e meningite/tamoxifeno, não houve diferença entre as sessões de treino e teste, demonstrando comprometimento da memória aversiva a curto e longo prazo nestes animais. Após os testes os animais foram mortos e os hipocampos foram removidos para avaliação dos níveis de BDNF, NGF e GDNF. Os níveis de BDNF e GDNF foram restabelecidos no hipocampo dos animais tratados com lítio, no entanto, os níveis de BDNF, NGF e GDNF diminuíram no hipocampo de animais tratados com tamoxifeno. O lítio foi capaz de prevenir o comprometimento da memória e restabelecer a expressão de neurotrofinas no hipocampo em modelo experimental de meningite pneumocócica.

O uso de células-tronco mesenquimais (CTMs) na medicina regenerativa, principalmente quando associado ao sistema nervoso, requer alternativas em relação à via de aplicação. A associação da terapia celular com a nanotecnologia para uso em neurociências, desenvolvida nesse trabalho, é uma abordagem inovadora no Brasil. Dessa forma, as matrizes de nanofibras, produzidas pela técnica de electrospinning (ES), funcionam como suportes para a proliferação e diferenciação celular proporcionando uma alternativa para a reconstituição do tecido lesado. O processo de regeneração do tecido neural pode ser aperfeiçoado com a liberação controlada de fatores neurotróficos, através do uso dessas matrizes. Entre esses fatores, encontra-se o NGF (Nerve Growth Factor – fator de crescimento neural), o qual exerce um papel central no desenvolvimento, manutenção e sobrevivência dos neurônios. Além disso, características de superfície das matrizes, como o alinhamento de nanofibras, podem estimular a diferencição neural. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver matrizes de nanofibras alinhadas e não alinhadas com e sem o NGF incorporado, através da técnica ES de emulsão. Além disso, objetivou-se avaliar o comportamento celular, bem como a capacidade de diferenciação neural das CTMs, sobre as estruturas tridimensionais desenvolvidas. As CTMs foram extraídas da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Quatro grupos de scaffolds foram desenvolvidos, caracterizados e avaliados: scaffolds com fibras randomizadas e com fibras alinhadas, sendo cada tipo com e sem o NGF incorporado. As análises físico-químicas realizadas foram morfologia, diâmetro das fibras e degradabilidade do biomaterial. Os parâmetros biológicos avaliados foram morfologia, adesão, viabilidade e proliferação celular, bem como a citotoxicidade frente ao biomaterial. A diferenciação neural foi quantificada através da expressão dos genes neurais nestina, β- III tubulina e NSE (enolase específica para neurônios). As matrizes de nanofibras produzidas mostraram-se satisfatórias para o cultivo de CTMs, mimetizando a estrutura física da matriz extracelular (MEC). Além disso, a técnica utilizada permitiu a obtenção de estruturas com nanofibras alinhadas e randomizadas. As CTMs cultivadas nas matrizes foram capazes de aderir e proliferar com vantagens para adesão nas matrizes alinhadas contendo o NGF, em relação às matrizes alinhadas controle. As estruturas produzidas não apresentaram características tóxicas permitindo que as CTMs mantivessem a viabilidade ao longo do tempo. A avaliação da diferenciação neural das CTMs indicou que todos os grupos de matrizes foram capazes de promover o aumento da expressão de genes neurais. Tal capacidade foi observada tanto para CTMs cultivadas sobre as matrizes com o meio controle quanto com o meio de indução neural. Esses achados mostram a possível influência das características químicas e topográficas providas pelos substratos produzidos. As características da matriz artificial permitem que as CTMs respondam adequadamente ao microambiente e expressem genes neurais, podendo auxiliar na regeneração tecidual quando aplicada em lesões do sistema nervoso. / The use of mesenchymal stem cells (MSCs) in regenerative medicine, particularly when associated with the nervous system, requires alternatives with respect to cell application methods. The association of cellular therapy with nanotechnology for use in neuroscience, developed with this work, is an innovative approach in Brazil. Scaffolds produced by electrospinning (ES) technique act as supports for cell proliferation and differentiation, providing an alternative to reconstitute the damaged tissue. The process of neural tissue regeneration can be improved through the controlled release of neurotrophic factors from the scaffolds. Among these factors, NGF (Nerve Growth Factor) plays a central role in the development, maintenance and survival of neurons. Furthermore, surface characteristics of nanofibers, such as alignment, can stimulate neural differentiation. The main objective of this study was to develop aligned nanofiber scaffolds and random nanofiber scaffolds with and without NGF incorporated through emulsion ES. In addition it was aimed to characterize the physico-chemical properties of the scaffolds, related to the extracellular matrix (ECM) and evaluate the cell behavior, as well as the neural differentiation on these three-dimensional devices. The MSCs were extracted from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth. Four groups of scaffolds were developed, characterized and evaluated: scaffolds with randomized fibers and with aligned fibers, each type with and without NGF incorporated. The physico-chemical analyzes performed were morphology, fiber diameter and degradability of the biomaterial. The biological parameters evaluated were cell morphology, adhesion, proliferation and viability, as well as cytotoxicity by the biomaterial. The neural differentiation was quantified by measuring gene expression for the neural genes nestin, β-III tubulin and NSE (neuron-specific enolase). The scaffolds produced demonstrated a satisfactory environment for MSC growth, mimicking the ECM physical structure. Furthermore, the technique allowed for the production of scaffolds with aligned and with randomized nanofibers. MSCs cultured on scaffolds were able to adhere and proliferate, with better adhesion performance on aligned nanofiber scaffolds with NGF incorporated, when compared to aligned nanofiber scaffolds control. The devices produced showed nontoxic characteristics permitting MSCs to maintain their viability over time. The evaluation of MSC neural differentiation indicated that all groups of scaffolds were able to upregulate neural genes expression. Such ability was observed for both MSCs cultured on scaffolds with control medium as on scaffolds under neural induction medium. These features provided by this artificial ECM permit proper MSC response to microenvironment, leading to neuronal genes expression, which could improve tissue regeneration when applied to nerve lesions.

A dor neuropática (DN) é causada por uma lesão primária ou por uma disfunção no sistema nervoso periférico (SNP) ou central (SNC), sendo que os principais sintomas são a alodinia mecânica e a hiperalgesia a estímulos térmicos e mecânicos. A DN apresenta resposta analgésica insuficiente com terapeuticas farmacológicas clássicas, sendo um desafio para o tratamento clínico. Técnicas de neuromodulação central, como a estimulação transcraniana por corrente contínua (ETCC), representam um recurso promissor no manejo da dor, uma vez que promovem neuroplasticidade em vias envolvidas com o processo doloroso, sendo um método não-invasivo que pode ser combinado com outras terapias. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do tratamento repetido com ETCC na resposta hiperalgésica térmica e mecânica em modelo experimental de DN. Adicionalmente, foram avaliados os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF em estruturas do SNC destes animais. Todos os procedimentos foram aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/HCPA:120512). Oitenta e quatro ratos machos Wistar foram divididos em 7 grupos: controle, dor neuropática, dor neuropática+ETCC, dor neuropática+sham ETCC, sham dor neuropática, sham dor neuropática+ETCC e sham dor neuropática+sham ETCC. O modelo de DN foi induzido por meio de ligura parcial do nervo isquiático na pata esquerda. O sham do modelo de DN seguiu o mesmo protocolo, com simulação da ligadura parcial do nervo isquiático e o grupo controle não sofreu nenhuma manipulação. O tratamento com ETCC consistiu em 20minutos/dia/8 dias, com intensidade de 0,5mA. Para o sham do tratamento, os eletrodos foram apenas fixados à cabeça do animal durante 20 minutos/dia/8 dias, sem nenhuma estimulação. A hiperalgesia térmica e mecânica foi avaliada por meio dos testes da Placa Quente e de Von Frey, respectivamente, no tempo basal, 7 e 14 dias após a cirurgia e imediatamente, 24 horas e 7 dias após o final do tratamento. Os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF no cortex cerebral, medula espinhal e tronco cerebral foram determinados por ELISA 48 horas e 7 dias após o final do tratamento. A análise estatística para os testes nociceptivos foi realizada através da Generalized Estimation Equation (GEE)/Bonferroni e para as análises bioquímicas por ANOVA de uma via (IL-1β, IL-10, TNF-α ) e ANOVA de três vias (NGF). Os dados estão expressos como media+erro padrão da média, sendo considerado significativo p<0.05. Nossos resultados demonstraram que a DN altera os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF no SNC em curto e longo prazo. Além disso, a ETCC reduz a resposta nociceptiva a curto e longo prazo e na modulação dos níveis de citocinas no sistema nervoso central neste modelo. Evidencia-se a importância do papel do sistema imune central nos processos de continuidade da dor neuropática, que pode estar envolvido com as alterações neuroplásticas maladaptativas características dessa patologia. / Neuropathic pain (NP) is caused by a primary insult or dysfunction in the central or peripheral nervous system and its prevalence depends on the type of trauma and related dysfunction. The main symptoms are mechanical allodynia and hyperalgesia to both mechanical and thermal stimuli. NP often shows insufficient response to classic analgesics and remains a challenge to medical treatment and scientific research; and the search for new therapies for this pathology is of fundamental important. Central neuromodulation techniques, such as transcranial direct current stimulation (tDCS), represent a promising resource to pain management since they promote neuroplasticity in the central system of pain. Moreover, tDCS has the advantages of being a noninvasive technique and can be combined with other interventions. The aim of this study was investigated the effects of tDCS in the thermal and mechanical hyperalgesia induced by chronic constriction injury (CCI) of sciatic nerve and measured its effect on the neurochemical markers (IL-1β, IL-10, TNF-α, and NGF levels) on central nervous system structures. All experiments and procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (GPPG-HCPA No.120512) and performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals 8th ed. The CCI of sciatic nerve was used for the induction of NP. For sham surgery, the sciatic nerve was exposed similarly, but it was not ligated. The control group did not undergo surgical procedure. After the establishment of NP, the rats of treated groups were subjected to a 20 minutes session of anodal tDCS, every afternoon for eight days, under a direct constant current of 0.5 mA intensity. The thermal and mechanical hyperalgesia was assessed by Hot plate and Von Frey test, respectively, and evaluated on baseline, 7 and 14 days after surgery; immediately, 24 hours and 7 days after treatment. The IL-1β, IL-10, TNF-α and NGF levels on cortex, spinal cord and brainstem were determined by sandwich-ELISA at 48 hours and 7 days after the end of treatment. Data were expressed as the mean±standard error of the mean (S.E.M). Generalized Estimating Equation (GEE) followed by Bonferroni was performed to compare all groups in different times of nociceptive tests and to biochemical data the one-way ANOVA was used to compare the IL-1β, IL-10, TNF-α and three-way ANOVA was used to compare the NGF levels. P-values less than 0.05 were considered significant. SPSS 19.0 for Windows was used for statistical analysis. In summary, we showed that anodal tDCS is effective to relieve NP and modulate cytokine in CCI rat model, and its effect is observed at long-term. In addition, the CCI model induced increased NGF levels in cerebral cortex and spinal cord at long-lasting time, evidencing the important feature of this neurotrophin in neuropathic pain condition. Additionally, we observed an important role of the central immune system in the neuropathic process, which can be involved with the maladaptative neuroplastic changes.

A dor neuropática (DN) é causada por uma lesão primária ou por uma disfunção no sistema nervoso periférico (SNP) ou central (SNC), sendo que os principais sintomas são a alodinia mecânica e a hiperalgesia a estímulos térmicos e mecânicos. A DN apresenta resposta analgésica insuficiente com terapeuticas farmacológicas clássicas, sendo um desafio para o tratamento clínico. Técnicas de neuromodulação central, como a estimulação transcraniana por corrente contínua (ETCC), representam um recurso promissor no manejo da dor, uma vez que promovem neuroplasticidade em vias envolvidas com o processo doloroso, sendo um método não-invasivo que pode ser combinado com outras terapias. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do tratamento repetido com ETCC na resposta hiperalgésica térmica e mecânica em modelo experimental de DN. Adicionalmente, foram avaliados os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF em estruturas do SNC destes animais. Todos os procedimentos foram aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/HCPA:120512). Oitenta e quatro ratos machos Wistar foram divididos em 7 grupos: controle, dor neuropática, dor neuropática+ETCC, dor neuropática+sham ETCC, sham dor neuropática, sham dor neuropática+ETCC e sham dor neuropática+sham ETCC. O modelo de DN foi induzido por meio de ligura parcial do nervo isquiático na pata esquerda. O sham do modelo de DN seguiu o mesmo protocolo, com simulação da ligadura parcial do nervo isquiático e o grupo controle não sofreu nenhuma manipulação. O tratamento com ETCC consistiu em 20minutos/dia/8 dias, com intensidade de 0,5mA. Para o sham do tratamento, os eletrodos foram apenas fixados à cabeça do animal durante 20 minutos/dia/8 dias, sem nenhuma estimulação. A hiperalgesia térmica e mecânica foi avaliada por meio dos testes da Placa Quente e de Von Frey, respectivamente, no tempo basal, 7 e 14 dias após a cirurgia e imediatamente, 24 horas e 7 dias após o final do tratamento. Os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF no cortex cerebral, medula espinhal e tronco cerebral foram determinados por ELISA 48 horas e 7 dias após o final do tratamento. A análise estatística para os testes nociceptivos foi realizada através da Generalized Estimation Equation (GEE)/Bonferroni e para as análises bioquímicas por ANOVA de uma via (IL-1β, IL-10, TNF-α ) e ANOVA de três vias (NGF). Os dados estão expressos como media+erro padrão da média, sendo considerado significativo p<0.05. Nossos resultados demonstraram que a DN altera os níveis de IL-1β, IL-10, TNF-α e NGF no SNC em curto e longo prazo. Além disso, a ETCC reduz a resposta nociceptiva a curto e longo prazo e na modulação dos níveis de citocinas no sistema nervoso central neste modelo. Evidencia-se a importância do papel do sistema imune central nos processos de continuidade da dor neuropática, que pode estar envolvido com as alterações neuroplásticas maladaptativas características dessa patologia. / Neuropathic pain (NP) is caused by a primary insult or dysfunction in the central or peripheral nervous system and its prevalence depends on the type of trauma and related dysfunction. The main symptoms are mechanical allodynia and hyperalgesia to both mechanical and thermal stimuli. NP often shows insufficient response to classic analgesics and remains a challenge to medical treatment and scientific research; and the search for new therapies for this pathology is of fundamental important. Central neuromodulation techniques, such as transcranial direct current stimulation (tDCS), represent a promising resource to pain management since they promote neuroplasticity in the central system of pain. Moreover, tDCS has the advantages of being a noninvasive technique and can be combined with other interventions. The aim of this study was investigated the effects of tDCS in the thermal and mechanical hyperalgesia induced by chronic constriction injury (CCI) of sciatic nerve and measured its effect on the neurochemical markers (IL-1β, IL-10, TNF-α, and NGF levels) on central nervous system structures. All experiments and procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (GPPG-HCPA No.120512) and performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals 8th ed. The CCI of sciatic nerve was used for the induction of NP. For sham surgery, the sciatic nerve was exposed similarly, but it was not ligated. The control group did not undergo surgical procedure. After the establishment of NP, the rats of treated groups were subjected to a 20 minutes session of anodal tDCS, every afternoon for eight days, under a direct constant current of 0.5 mA intensity. The thermal and mechanical hyperalgesia was assessed by Hot plate and Von Frey test, respectively, and evaluated on baseline, 7 and 14 days after surgery; immediately, 24 hours and 7 days after treatment. The IL-1β, IL-10, TNF-α and NGF levels on cortex, spinal cord and brainstem were determined by sandwich-ELISA at 48 hours and 7 days after the end of treatment. Data were expressed as the mean±standard error of the mean (S.E.M). Generalized Estimating Equation (GEE) followed by Bonferroni was performed to compare all groups in different times of nociceptive tests and to biochemical data the one-way ANOVA was used to compare the IL-1β, IL-10, TNF-α and three-way ANOVA was used to compare the NGF levels. P-values less than 0.05 were considered significant. SPSS 19.0 for Windows was used for statistical analysis. In summary, we showed that anodal tDCS is effective to relieve NP and modulate cytokine in CCI rat model, and its effect is observed at long-term. In addition, the CCI model induced increased NGF levels in cerebral cortex and spinal cord at long-lasting time, evidencing the important feature of this neurotrophin in neuropathic pain condition. Additionally, we observed an important role of the central immune system in the neuropathic process, which can be involved with the maladaptative neuroplastic changes.

A técnica de Mobilização Neural (MOB) é um método não-invasivo que demonstrou clinicamente ser eficaz na redução da sensibilidade à dor e, conseqüentemente, na melhoria da qualidade de vida após a dor neuropática. O presente estudo examinou os efeitos da MOB sobre a sensibilidade dolorosa induzida pela constrição crônica (CCI) do nervo isquiático de ratos. A CCI foi realizada em ratos machos adultos, submetidos posteriormente a dez sessões de MOB, iniciadas 14 dias após a lesão. Durante o tratamento, os animais foram avaliados em testes comportamentais para a nocicepção por meio de comportamentos tais como testes para a alodinia e hiperalgesia térmica e mecânica. Ao término das dez sessões, o nervo isquiático e a medula espinal foram retirados e processados para detecção de NGF e proteína zero por análise de Western Blot. Os DRG´s foram processados para detecção de NGF e GFAP para análise de Werstern Blot e imuno-histoquímica de fluorescência. A MOB reverteu parcialmente a resposta hiperalgesica mecânica e a alodínica desde a segunda sessão, enquanto que a hiperalgesia térmica foi bloqueada desde a quarta sessão de MOB. Com relação aos ensáios de Western Blot, observamos um aumento da densidade óptica para NGF e proteína zero (PO) no nervo isquiático dos animais com CCI após tratamento com MOB. Entretanto, não foi possível observar mudanças estatísticas para o NGF quando analisamos a medula espinal em todos os grupos analisados. Nos ensaios de Western Blot e imuno-histoquímica dos DRG´s observamos uma diminuição da imunorreatividade (IR) para NGF e GFAP nos animais tratados com MOB. Assim, acreditamos que a MOB diminui os sintomas da dor neuropática induzida pela CCI do nervo isquiático, além de favorecer a regeneração do nervo isquiático devido ao aumento local de NGF e Proteína zero. / The Neural Mobilization technique is a noninvasive method that has proved clinically effective in reducing pain sensitivity and consequently in improving quality of life after neuropathic pain. The present study examined the effects of Neural Mobilization (MOB) on pain sensitivity induced by chronic constriction injury (CCI) in rats. The CCI was performed on adult male rats, submitted thereafter to 10 sessions of MOB, each other day, starting 14 days after the CCI injury. Over the treatment period, animals were evaluated for nociception using behavior tests, such as tests for allodynia and thermal and mechanical hyperalgesia. At the end of the sessions, the nerve isquiatic and spinal cord were analyzed using Western Blot assays for neural growth factor (NGF) and protein zero (PO) and the dorsal root ganglia (DRG) were analyzed using Western Blot and immunohistochemistry assays for neural growth factor (NGF) and glial fibrillary acidic protein (GFAP). The results showed that MOB treatment induced an early reduction (in the second session) of the hyperalgesia and allodynia in CCI-injured rats, which persisted until the end of the treatment. On the other hand, only after the 4th session we observed a blockede of thermal sensitivity. Regarding cellular changes, we observed a increase of NGF and PO expression after MOB in the nerve isquiatic when compared to CCI animals. We also observed a decrease of NGF and GFAP expression after MOB in the DRG when compared to CCI animals. In spinal cord no observed statistically difference. Was observed these data provide evidence that MOB treatment reverses pain symptoms in CCI-injured rats and decreases the level of GFAP and NGF in DRG. In addition to promoting the regeneration of the isquiatic nerve due to increased local NGF and protein zero.

Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T22:15:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingos_PriscilaPerez_D.pdf: 2379926 bytes, checksum: df7f068098f3454b58caf0a13e61f196 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O camundongo não obeso diabético (NOD) é caracterizado por desenvolver naturalmente diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) com similaridade ao diabetes mellitus tipo 1 em humanos. A manifestação espontânea do diabetes neste modelo animal é caracterizado por infiltração progressiva das ilhotas de Langerhans por células mononucleares linfócitos T (CD4+ e CD8+) e destruição das células ß pancreáticas produtoras de insulina. O fator de crescimento neural (NGF) e algumas citocinas estão associados a regeneração neural, além de atuarem sobre células do sistema imune. Em adição a estes efeitos, NGF age na liberação de insulina pelas células betas das ilhotas pancreáticas, tornando-se foco de interesse com relação as suas propriedades moduladoras no processo inflamatório na ilhota pancreática. O gangliosídeo GM1 liga-se ao receptor de alta afinidade (TrkA) do NGF-ß, mimetizando seus efeitos. No presente trabalho, avaliamos a ação modulatória de GM1 e NGF em cultura de ilhotas pancreáticas, provenientes de camundongos NOD. Foram avaliados por meio de RT-PCR a expressão gênica de NGF-ß, TrkA e insulina e, por ensaio imunoenzimático, a concentração de citocinas IL-1ß, IL-12, TNF-a, INF-y e insulina. Nossos resultados sugerem ação moduladora similar entre GM1 e NGF sobre as ilhotas de NOD não diabéticos e pré-diabéticos. NGF e GM1 aumentam a expressão gênica de NGF e TrkA e diminuem a expressão gênica de insulina em NOD não diabéticos e pré-diabéticos. Além disso, aumentam a liberação de insulina e diminui a de citocinas inflamatórias IL-1ß, IL-12, TNF-a, IFN-y que caracterizam a resposta Th1. / Abstract: The non-obese diabetic mice (NOD) lineage is characterized by developing type 1 diabetes mellitus (DM-1) naturally, bearing a similarity to DM-1 in human beings. The spontaneous manifestation of diabetes is characterized by gradual infiltration in pancreatic islets by mononuclear cells lymphocytes T (CD4+ and CD8+) and destruction of the ß-cells producers of insulin. One consequence of this effect, is the release of neurotrophins trying modulate the insulin release by the ß cells of pancreatic islets. Thus, the neurotrophins have been the focus of interest in the modulation of the inflammatory process in the pancreatic islets. The ganglioside GM1 binds to the high affinity receptor (TrkA) of the NGF-ß, enhancing its effect. In the present work, we evaluate the immune modulation properties of GM1 and NGF in culture of pancreatic islets from NOD mice. The gene expression of NGF-ß, TrkA and insulin for immune enzymatic assay, the concentration of cytokines IL 1ß, IL-12, TNF-a, IFN-y and insulin were evaluated by RT-PCR and ELISA. Our results suggest similar modulation action between GM1 and NGF on islets of NOD non-diabetic and pre-diabetic. GM1 and NGF action increases the gene expression of NGF and TrkA and the decrease of insulin in mice NOD non-diabetic and pre-diabetic. Moreover, GM1 and NGF increase the insulin release and decrease inflammatory cytokines that characterize the Th1 reply. / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica