A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum e caracteriza-se por elevadas concentrações de L-fenilalanina no sangue devido a deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase (PAH). A PAH é composta por monômeros divididos em três domínios: de regulação, catalítico e de tetramerização. Os objetivos do presente trabalho foram identificar as mutações no gene PAH responsáveis por PKU em pacientes do sul do Brasil e analisar o comportamento da PAH nas formas de monômero, dímero e tetrâmero. A amostra foi composta por 44 pacientes não aparentados. As mutações comuns foram analisadas por PCR em tempo real (sistema TaqMan®) e através de análise por RFLP. Os pacientes que, após a triagem para as mutações comuns, não tiveram seu alelos mutantes definidos, foram submetidos ao sequenciamento direto do gene PAH. Um modelo do monômero da PAH foi construído através do programa Modeller 9v7 para as análises in silico. A montagem do dímero e do tetrâmero da enzima foi realizada no programa PyMOL 1.1 e a simulação de DM coarse-grained pelo pacote de programas GROMACS 4.0. A aplicação conjunta das técnicas para identificação de mutações no gene PAH permitiu a definição de 83 alelos mutantes (94,3%) do total de 88 alelos estudados e a identificação do genótipo de 40 (90,9%) dos 44 pacientes incluídos neste trabalho. Os resultados obtidos contribuem com o perfil de mutações na população do sul do Brasil e indicam que o mesmo é representado por poucas mutações frequentes e um número maior de mutações raras. O perfil da trajetória dos monômeros durante a simulação nas estruturas propostas é diferente, principalmente pelo comportamento das α-hélices envolvidas na oligomerização da proteína. A α-hélice no monômero sofre compactação ao núcleo da proteína. A α-hélice no dímero apresenta alta flexibilidade mostrando que apenas duas α- hélices coordenadas não parecem suficientes para imobilizar este sistema e torná-lo rígido e estável, o que é observado na simulação da estrutura tetramérica quando quatro α-hélices estão coordenadas. Assim, mutações que impeçam a oligomerização da proteína podem formar estruturas mais instáveis que, como observado no monômero livre, podem iniciar um processo de agregação e serem enviadas a degradação rápida ou, somente por não atingirem conformação adequada, sejam encaminhadas a esta rota. Ambos aspectos abordados nesse trabalho contribuem para o melhor conhecimento do metabolismo normal e das alterações hereditárias relacionadas a fenilalanina hidroxilase. / Phenylketonuria (PKU), the most common inborn error of amino acids metabolism, is characterized by high levels of L-phenylalanine in blood due to deficiency of the enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH). The PAH consists of monomers divided into three domains: regulatory, catalytic, and tetramerization. The aims of this study were to identify mutations in the PAH gene responsible for PKU in patients from South Brazil and to analyze the behavior of PAH as monomer, dimer, and tetramer. The sample for in vitro analyzes was composed by 44 unrelated patients. Common mutations were analyzed by qualitative Real time PCR (TaqMan® system) and by RFLP analysis. Patients with undefined mutant alleles after the screening for common mutations were submitted to direct DNA sequencing of the PAH gene. For in silico analyses a model of the PAH monomer was built through Modeller 9v7 program. The assembly of PAH dimer and tetramer was performed by PyMOL 1.1 program and the simulation of MD coarse-grained by package GROMACS 4.0. The combined approach for identifying mutations in the PAH gene identified of 83 mutant alleles (94.3%) of a total of 88 alleles and genotypes were defined in 40 (90.9%) of the 44 patients included in this work. Results show mutation profile where few mutations were present in the majority of mutant alleles while the remaining ones were rare sequence alterations. Considering in silico analyses, monomers trajectory profile of the monomers during the simulation in the proposed structures was different mainly by the behavior of α-helices involved in protein oligomerization. The α- helix in the monomer undergoes compression toward the protein core. The dimer α-helix presents high flexibility showing that only two α-helices coordinated do not seem to be sufficient to immobilize this system and make it rigid and stable, which is observed in simulation of the tetrameric structure when four α-helices are coordinated. Thus, mutations that prevent protein oligomerization can form these unstable structures in a higher level and they may initiate an aggregation process and be rapidly degraded or be conducted to this route by failing to achieve proper conformation. Both aspects addressed in this work contribute for a wider knowledge of normal metabolism and inherited alterations related to phenylalanine hydroxylase.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum e caracteriza-se por elevadas concentrações de L-fenilalanina no sangue devido a deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase (PAH). A PAH é composta por monômeros divididos em três domínios: de regulação, catalítico e de tetramerização. Os objetivos do presente trabalho foram identificar as mutações no gene PAH responsáveis por PKU em pacientes do sul do Brasil e analisar o comportamento da PAH nas formas de monômero, dímero e tetrâmero. A amostra foi composta por 44 pacientes não aparentados. As mutações comuns foram analisadas por PCR em tempo real (sistema TaqMan®) e através de análise por RFLP. Os pacientes que, após a triagem para as mutações comuns, não tiveram seu alelos mutantes definidos, foram submetidos ao sequenciamento direto do gene PAH. Um modelo do monômero da PAH foi construído através do programa Modeller 9v7 para as análises in silico. A montagem do dímero e do tetrâmero da enzima foi realizada no programa PyMOL 1.1 e a simulação de DM coarse-grained pelo pacote de programas GROMACS 4.0. A aplicação conjunta das técnicas para identificação de mutações no gene PAH permitiu a definição de 83 alelos mutantes (94,3%) do total de 88 alelos estudados e a identificação do genótipo de 40 (90,9%) dos 44 pacientes incluídos neste trabalho. Os resultados obtidos contribuem com o perfil de mutações na população do sul do Brasil e indicam que o mesmo é representado por poucas mutações frequentes e um número maior de mutações raras. O perfil da trajetória dos monômeros durante a simulação nas estruturas propostas é diferente, principalmente pelo comportamento das α-hélices envolvidas na oligomerização da proteína. A α-hélice no monômero sofre compactação ao núcleo da proteína. A α-hélice no dímero apresenta alta flexibilidade mostrando que apenas duas α- hélices coordenadas não parecem suficientes para imobilizar este sistema e torná-lo rígido e estável, o que é observado na simulação da estrutura tetramérica quando quatro α-hélices estão coordenadas. Assim, mutações que impeçam a oligomerização da proteína podem formar estruturas mais instáveis que, como observado no monômero livre, podem iniciar um processo de agregação e serem enviadas a degradação rápida ou, somente por não atingirem conformação adequada, sejam encaminhadas a esta rota. Ambos aspectos abordados nesse trabalho contribuem para o melhor conhecimento do metabolismo normal e das alterações hereditárias relacionadas a fenilalanina hidroxilase. / Phenylketonuria (PKU), the most common inborn error of amino acids metabolism, is characterized by high levels of L-phenylalanine in blood due to deficiency of the enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH). The PAH consists of monomers divided into three domains: regulatory, catalytic, and tetramerization. The aims of this study were to identify mutations in the PAH gene responsible for PKU in patients from South Brazil and to analyze the behavior of PAH as monomer, dimer, and tetramer. The sample for in vitro analyzes was composed by 44 unrelated patients. Common mutations were analyzed by qualitative Real time PCR (TaqMan® system) and by RFLP analysis. Patients with undefined mutant alleles after the screening for common mutations were submitted to direct DNA sequencing of the PAH gene. For in silico analyses a model of the PAH monomer was built through Modeller 9v7 program. The assembly of PAH dimer and tetramer was performed by PyMOL 1.1 program and the simulation of MD coarse-grained by package GROMACS 4.0. The combined approach for identifying mutations in the PAH gene identified of 83 mutant alleles (94.3%) of a total of 88 alleles and genotypes were defined in 40 (90.9%) of the 44 patients included in this work. Results show mutation profile where few mutations were present in the majority of mutant alleles while the remaining ones were rare sequence alterations. Considering in silico analyses, monomers trajectory profile of the monomers during the simulation in the proposed structures was different mainly by the behavior of α-helices involved in protein oligomerization. The α- helix in the monomer undergoes compression toward the protein core. The dimer α-helix presents high flexibility showing that only two α-helices coordinated do not seem to be sufficient to immobilize this system and make it rigid and stable, which is observed in simulation of the tetrameric structure when four α-helices are coordinated. Thus, mutations that prevent protein oligomerization can form these unstable structures in a higher level and they may initiate an aggregation process and be rapidly degraded or be conducted to this route by failing to achieve proper conformation. Both aspects addressed in this work contribute for a wider knowledge of normal metabolism and inherited alterations related to phenylalanine hydroxylase.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum e caracteriza-se por elevadas concentrações de L-fenilalanina no sangue devido a deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase (PAH). A PAH é composta por monômeros divididos em três domínios: de regulação, catalítico e de tetramerização. Os objetivos do presente trabalho foram identificar as mutações no gene PAH responsáveis por PKU em pacientes do sul do Brasil e analisar o comportamento da PAH nas formas de monômero, dímero e tetrâmero. A amostra foi composta por 44 pacientes não aparentados. As mutações comuns foram analisadas por PCR em tempo real (sistema TaqMan®) e através de análise por RFLP. Os pacientes que, após a triagem para as mutações comuns, não tiveram seu alelos mutantes definidos, foram submetidos ao sequenciamento direto do gene PAH. Um modelo do monômero da PAH foi construído através do programa Modeller 9v7 para as análises in silico. A montagem do dímero e do tetrâmero da enzima foi realizada no programa PyMOL 1.1 e a simulação de DM coarse-grained pelo pacote de programas GROMACS 4.0. A aplicação conjunta das técnicas para identificação de mutações no gene PAH permitiu a definição de 83 alelos mutantes (94,3%) do total de 88 alelos estudados e a identificação do genótipo de 40 (90,9%) dos 44 pacientes incluídos neste trabalho. Os resultados obtidos contribuem com o perfil de mutações na população do sul do Brasil e indicam que o mesmo é representado por poucas mutações frequentes e um número maior de mutações raras. O perfil da trajetória dos monômeros durante a simulação nas estruturas propostas é diferente, principalmente pelo comportamento das α-hélices envolvidas na oligomerização da proteína. A α-hélice no monômero sofre compactação ao núcleo da proteína. A α-hélice no dímero apresenta alta flexibilidade mostrando que apenas duas α- hélices coordenadas não parecem suficientes para imobilizar este sistema e torná-lo rígido e estável, o que é observado na simulação da estrutura tetramérica quando quatro α-hélices estão coordenadas. Assim, mutações que impeçam a oligomerização da proteína podem formar estruturas mais instáveis que, como observado no monômero livre, podem iniciar um processo de agregação e serem enviadas a degradação rápida ou, somente por não atingirem conformação adequada, sejam encaminhadas a esta rota. Ambos aspectos abordados nesse trabalho contribuem para o melhor conhecimento do metabolismo normal e das alterações hereditárias relacionadas a fenilalanina hidroxilase. / Phenylketonuria (PKU), the most common inborn error of amino acids metabolism, is characterized by high levels of L-phenylalanine in blood due to deficiency of the enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH). The PAH consists of monomers divided into three domains: regulatory, catalytic, and tetramerization. The aims of this study were to identify mutations in the PAH gene responsible for PKU in patients from South Brazil and to analyze the behavior of PAH as monomer, dimer, and tetramer. The sample for in vitro analyzes was composed by 44 unrelated patients. Common mutations were analyzed by qualitative Real time PCR (TaqMan® system) and by RFLP analysis. Patients with undefined mutant alleles after the screening for common mutations were submitted to direct DNA sequencing of the PAH gene. For in silico analyses a model of the PAH monomer was built through Modeller 9v7 program. The assembly of PAH dimer and tetramer was performed by PyMOL 1.1 program and the simulation of MD coarse-grained by package GROMACS 4.0. The combined approach for identifying mutations in the PAH gene identified of 83 mutant alleles (94.3%) of a total of 88 alleles and genotypes were defined in 40 (90.9%) of the 44 patients included in this work. Results show mutation profile where few mutations were present in the majority of mutant alleles while the remaining ones were rare sequence alterations. Considering in silico analyses, monomers trajectory profile of the monomers during the simulation in the proposed structures was different mainly by the behavior of α-helices involved in protein oligomerization. The α- helix in the monomer undergoes compression toward the protein core. The dimer α-helix presents high flexibility showing that only two α-helices coordinated do not seem to be sufficient to immobilize this system and make it rigid and stable, which is observed in simulation of the tetrameric structure when four α-helices are coordinated. Thus, mutations that prevent protein oligomerization can form these unstable structures in a higher level and they may initiate an aggregation process and be rapidly degraded or be conducted to this route by failing to achieve proper conformation. Both aspects addressed in this work contribute for a wider knowledge of normal metabolism and inherited alterations related to phenylalanine hydroxylase.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum. Ela é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) que é responsável por converter a fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), que acaba elevando os níveis de Phe e seus metabólitos no sangue e tecidos. Se não tratada, a PKU pode desenvolver problemas neurológicos como convulsões, distúrbios motores e retardo mental. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos da Phe em alguns parâmetros do metabolismo, estresse oxidativo e viabilidade celular em cultura de astrócitos de ratos Wistar. Os astrócitos foram cultivados sob quatro condições: controle (com 0,4 mM de Phe no meio de cultura) e outros três grupos com concentrações finais de Phe de 0,5, 1,0 e 1,5 mM. Após 72 horas, os astrócitos foram coletados para análises bioquímicas. Nós observamos que os teste de brometo de tetrazolium (MTT) e lactato desidrogenase mostraram alterações na viabilidade celular em todas as doses testadas. Também foram notadas alterações em parâmetros de estresse oxidativo, indicando que a Phe pode induzir a produção de radicais livres, mas não encontramos diferenças significaticas nos parâmetros do metabolismo como a creatina-cinase, piruvato-cinase e adenilato-cinase. Estes resultados sugerem que a fenilalanina nas concentrações encontradas na PKU pode induzir estresse oxidativo e consequente morte celular em cultura de astrócitos. Considerando a importâncias dessas células para a manutenção da homeostase cerebral, é possível que estas alterações estejam relacionadas com os problemas neurológicos encontrados em pacientes com PKU. / Phenylketonuria (PKU) is the most common inborn error of amino acid metabolism. It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene that expresses phenylalanine hydroxylase enzyme (Pah) that converts phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr), that leads to high levels of Pheand its metabolites in blood and tissues. If left untreated, PKU can develop neurological problems as seizures, motor disturbances and severe mental retardation. The aim of this study is to investigate the effects of Phe on oxidative stress, some metabolic parameters and cell viability in astrocytes culture of Wistar rats.Astrocytes were cultures under four conditions: control (0.4 mMPhe in the medium), and other three groups with final Phe concentration of 0.5, 1.0 and 1.5 mM. After 72 hours, astrocytes were collected for biochemical measurements. We observed that tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays indicated that Phedecreased cell viability at all tested doses. Alterations on oxidative stress parameters indicated that Phecould induce free radicals production, but we didn’t find significative differences on metabolic parameters as creatine, pyruvate and adenylate kinases. Those results suggest that phenylalanine at concentrations found in PKU can induce oxidative stress and consequently cell death in astrocytes cultures. Considering the importance of astrocytes in brain homeostasis, it is possible that these changes may be related to neurological problems seen in PKU patients.

Introdução: Estudos recentes, utilizando vários protocolos, têm demonstrado que pacientes com Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPA-PAH) podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de fenilalanina (Phe) mediante a administração de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Determinar, em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH, a responsividade à administração de dose única de BH4 por meio de um protocolo incluindo o teste de sobrecarga simples de Phe e o teste combinado de sobrecarga de Phe+BH4. Métodos: Foram incluídos no estudo pacientes com idade ≥ 4 anos, em tratamento dietético e que possuíam mediana de Phe plasmática inferior a 10mg/dL no ano anterior à inclusão. Foram realizados teste de sobrecarga simples de Phe, utilizando 100mg/kg de L-Phe (Teste 1) e teste combinado de Phe+BH4, utilizando 100mg/kg de L-Phe e 20mg/kg de BH4 (Teste 2), com intervalo de uma semana entre ambos. A ingestão do BH4 ocorreu após três horas da ingestão da Phe. Foram realizadas coletas de sangue no ponto basal e após três, 11 e 27h da ingestão de Phe (T0, T1, T2 e T3 dos testes 1 e 2, respectivamente). Para ser considerado responsivo, o paciente deveria apresentar evidência de redução dos níveis de Phe associada à administração do BH4 de acordo com pelo menos um dos seguintes critérios: critério A – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 dos Testes 1 e 2; critério B – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 dos Testes 1 e 2 e critério C – análise da diferença, em percentual, das áreas abaixo da curva de Phe entre os Testes 1 e 2. A classificação de responsividade foi também comparada com quatro critérios adicionais: critério D – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 do Teste 2; critério E – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 do Teste 2; cinco pacientes participaram de estudo anterior do grupo e foram também classificados através do critério F – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 8h da sobrecarga simples com BH4 e do critério G – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 24h da sobrecarga simples com BH4. Para todos os critérios foi utilizado como ponte de corte redução ≥ 30%. Resultados: Dezoito pacientes, com mediana de idade de 12 anos, participaram do estudo. Dez pacientes apresentavam a forma Leve de HPA-PAH e oito a forma Clássica. Seis pacientes foram considerados responsivos de acordo com os critérios adotados (Clássica: 2; Leve: 4). Houve concordância de responsividade entre os critérios A e B em relação ao C (Índice Kappa=0,557; p=0,017). Dos pacientes com genótipo disponível (n=16), seis possuíam dados de responsividade ao BH4 descritos na literatura, que foram concordantes com os encontrados no presente estudo. Conclusão: Dados relativos à responsividade, tipo de HPA-PAH e genotipagem estão de acordo com descrito na literatura. Haja vista a diferença de responsividade dos pacientes ao BH4 conforme o critério de classificação utilizado, salienta-se a importância de uma definição cautelosa de responsividade e que não seja baseada em um único critério. A comparação entre a sobrecarga simples de Phe e combinada de Phe+BH4 parece ser um critério adequado para avaliar responsividade ao BH4 em pacientes com HPA-PAH que apresentam bom controle metabólico quando em tratamento dietético. / Introduction: Recent studies using different protocols showed that patients with hyperphenylalaninemia due to phenylalanine hydroxylase deficiency (HPA-PAH) may have a reduction in phenilalanine (Phe) plasma concentrations after tetrahydrobiopterin (BH4) administration. Objective: To determine responsiveness to the administration of a single dose of BH4, in a sample of Brazilian patients with HPA-PAH using a protocol that includes the simple Phe loading test and the combined Phe+BH4 loading test. Methods: Patients included in the study were ≥ 4 years of age; their median Phe plasma concentration was ≤ 10mg/dL, and all underwent dietary treatment in the 12 months before inclusion in the study. Participants received a simple Phe loading test using 100mg/kg L-Phe (Test 1) and a combined Phe+BH4 loading test using 100mg/kg L-Phe and 20mg/kg /BH4 (Test 2) at a one-week interval. BH4 was ingested three hours after Phe ingestion. Blood samples were collected at baseline and three, 11 and 27h after Phe ingestion (time points T0, T1, T2 and T3 in Tests 1 and 2). To be classified as responsive, there should be evidence that the patient had a reduction in Phe levels associated with BH4 administration according to at least one of the criteria used: criterion A – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Tests 1 and 2; criterion B – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Tests 1 and 2; and criterion C – analysis of percentage differences of the areas under the Phe curve for Tests 1 and 2. Responsiveness classifications were also compared according to four additional criteria: criterion D – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Test 2; criterion E – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Test 2; criterion F – analysis of percentage difference of Phe values 8h after simple BH4 loading used for five patients that participated in a previous study conducted by the same authors; and criterion G – analysis of percentage difference of Phe values 24 h after simple BH4 loading, also used for the patients in the same previous study. The cut-off point for all criteria was a reduction of ≥ 30%. Results: Eighteen patients (median age = 12 years) were included in the study. Ten patients had mild HPA-PAH and eight, classical HPA-PAH. Six patients were responsive according to the criteria used (Classical: 2; Mild: 4). Responsiveness was concordant for criteria A and B when compared with criterion C (kappa=0.557; p=0.017). Of the patients whose genotype was available (n=16), six had data about BH4 responsiveness described in the literature, and these data were in agreement with our findings. Conclusion: Data about responsiveness, HPA-PAH type and genotype were in agreement with those described in the literature. The difference in BH4 responsiveness of patients according to classification criterion emphasizes the importance of a careful definition of responsiveness not based on a single criterion. The comparison of simple Phe loading and combined Phe+BH4 loading seems to be an adequate criterion to evaluate responsiveness to BH4 in patients with HPA-PAH and good metabolic control when following a dietary treatment.

Introdução: A Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPAPAH) é um erro inato do metabolismo no qual ocorre aumento dos níveis séricos de fenilalanina (Phe). Estudos recentes, realizados em várias populações, demonstraram que pacientes com HPA-PAH podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de Phe mediante a administração oral de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Identificar em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH aqueles que são responsivos à administração de BH4 por via oral. Métodos: Para um paciente ser incluído no estudo, era necessário ter diagnóstico de HPA-PAH e idade igual ou superior a 7 anos, estar em tratamento dietético e apresentar nível de Phe igual ou superior a 6 mg/dL em todas as medidas realizadas no ano anterior à inclusão no estudo. No dia anterior à sobrecarga de BH4 (Dia 1), os pacientes foram submetidos a três coletas de sangue para mensuração dos níveis de Phe. No Dia 2, os pacientes receberam dose única de 20mg/Kg de BH4. As coletas de sangue foram, então, realizadas nos pontos de hora: 0, 4 e 8h (Dia 2) e 24h (Dias 3) após a ingestão do medicamento. Os níveis de Phe foram determinados através da espectrometria de massa in tandem. Foram utilizados dois critérios para definir a presença de responsividade ao BH4: Critério 1: redução 30% de Phe após 8h da administração do medicamento; Critério 2: redução 30% de Phe após 24h da administração do medicamento. Resultados: Dezoito pacientes foram incluídos no estudo, com mediana de idade de 14 anos, sendo 66,7% do sexo masculino. Onze apresentavam a forma clássica da doença e três a forma atípica. Três (forma clássica: 1, forma atípica: 2) e cinco (forma clássica: 2, forma atípica: 2 e forma não-definida: 1) pacientes foram considerados responsivos ao BH4 conforme critérios 1 e 2, respectivamente. Os níveis de Phe plasmáticos do dia anterior ao teste de sobrecarga não demonstraram variação nos pontos de hora (p=0,523). Entretanto, quando comparamos os níveis de Phe nos pontos de hora do dia pré e pós BH4, encontrou-se variação significativa entre eles (p=0,006). A análise da associação genótipo-fenótipo, para os pacientes com dados disponíveis (n=6) mostrou que a mesma é multifatorial. Conclusão: Nossos achados estão de acordo com a literatura, e indicaram que um número considerável de pacientes brasileiros com HPA-PAH poderá ser beneficiado com a administração oral de BH4. / Introduction: Hyperphenylalaninemia by phenylalanine hydroxylase deficiency (HPAPAH) is an inborn error of metabolism in which increased serum levels of phenylalanine (Phe) occur. Recent studies on several populations showed that patients with HPA-PAH can have their serum levels reduced when receiving oral tetrahydrobiopterin (BH4). Objective: to identify in a sample of Brazilian HPA-PAH the patients who are responsive to the oral administration of BH4. Methods: the following inclusion criteria were used: diagnosis of HPA-PAH, age 7 years, on dietary treatment and Phe levels 6 mg/dL in all tests performed one year prior to the inclusion in this study. On the day before the BH4 challenge (Day 1) 3 blood samples were obtained to measure Phe levels. Blood samples were also obtained at time points 0, 4, 8 hours (Day 2) and 24 h (Day 3) after the intake of the medication. Phe levels were determined by tandem mass spectrometry. Criteria used to define responsiveness to BH4 were: Criterion 1: Phe reduction 30% 8 hours after BH4 administration; Criterion 2: Phe reduction 30% 24 hours after BH4 administration. Results: a total of 18 patients with a mean age of 14 years were included in this study; of those, 66.7% were male. Eleven presented the classical form of the disease and 3, the atypical form. Three patients (classical form: 1, atypical form: 2) and 5 (classical form: 2; atypical form: 2; undefined form: 1) were considered responsive to BH4 according to criteria 1 and 2, respectively. Phe serum levels on the Day 1 did not show any change on the established time point schedule (p=0.523). However, when comparing levels of Phe between Days 1 and 2, significant variation was found (p=0.006). The phenotype – genotype association analysis of patients with available data (n=6) showed that the association is multifactorial. Conclusion: In accordance with the literature, our findings show that many Brazilian patients with HPA-PAH can benefit from the oral administration of BH4.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum. Ela é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) que é responsável por converter a fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), que acaba elevando os níveis de Phe e seus metabólitos no sangue e tecidos. Se não tratada, a PKU pode desenvolver problemas neurológicos como convulsões, distúrbios motores e retardo mental. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos da Phe em alguns parâmetros do metabolismo, estresse oxidativo e viabilidade celular em cultura de astrócitos de ratos Wistar. Os astrócitos foram cultivados sob quatro condições: controle (com 0,4 mM de Phe no meio de cultura) e outros três grupos com concentrações finais de Phe de 0,5, 1,0 e 1,5 mM. Após 72 horas, os astrócitos foram coletados para análises bioquímicas. Nós observamos que os teste de brometo de tetrazolium (MTT) e lactato desidrogenase mostraram alterações na viabilidade celular em todas as doses testadas. Também foram notadas alterações em parâmetros de estresse oxidativo, indicando que a Phe pode induzir a produção de radicais livres, mas não encontramos diferenças significaticas nos parâmetros do metabolismo como a creatina-cinase, piruvato-cinase e adenilato-cinase. Estes resultados sugerem que a fenilalanina nas concentrações encontradas na PKU pode induzir estresse oxidativo e consequente morte celular em cultura de astrócitos. Considerando a importâncias dessas células para a manutenção da homeostase cerebral, é possível que estas alterações estejam relacionadas com os problemas neurológicos encontrados em pacientes com PKU. / Phenylketonuria (PKU) is the most common inborn error of amino acid metabolism. It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene that expresses phenylalanine hydroxylase enzyme (Pah) that converts phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr), that leads to high levels of Pheand its metabolites in blood and tissues. If left untreated, PKU can develop neurological problems as seizures, motor disturbances and severe mental retardation. The aim of this study is to investigate the effects of Phe on oxidative stress, some metabolic parameters and cell viability in astrocytes culture of Wistar rats.Astrocytes were cultures under four conditions: control (0.4 mMPhe in the medium), and other three groups with final Phe concentration of 0.5, 1.0 and 1.5 mM. After 72 hours, astrocytes were collected for biochemical measurements. We observed that tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays indicated that Phedecreased cell viability at all tested doses. Alterations on oxidative stress parameters indicated that Phecould induce free radicals production, but we didn’t find significative differences on metabolic parameters as creatine, pyruvate and adenylate kinases. Those results suggest that phenylalanine at concentrations found in PKU can induce oxidative stress and consequently cell death in astrocytes cultures. Considering the importance of astrocytes in brain homeostasis, it is possible that these changes may be related to neurological problems seen in PKU patients.

Introdução: A Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPAPAH) é um erro inato do metabolismo no qual ocorre aumento dos níveis séricos de fenilalanina (Phe). Estudos recentes, realizados em várias populações, demonstraram que pacientes com HPA-PAH podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de Phe mediante a administração oral de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Identificar em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH aqueles que são responsivos à administração de BH4 por via oral. Métodos: Para um paciente ser incluído no estudo, era necessário ter diagnóstico de HPA-PAH e idade igual ou superior a 7 anos, estar em tratamento dietético e apresentar nível de Phe igual ou superior a 6 mg/dL em todas as medidas realizadas no ano anterior à inclusão no estudo. No dia anterior à sobrecarga de BH4 (Dia 1), os pacientes foram submetidos a três coletas de sangue para mensuração dos níveis de Phe. No Dia 2, os pacientes receberam dose única de 20mg/Kg de BH4. As coletas de sangue foram, então, realizadas nos pontos de hora: 0, 4 e 8h (Dia 2) e 24h (Dias 3) após a ingestão do medicamento. Os níveis de Phe foram determinados através da espectrometria de massa in tandem. Foram utilizados dois critérios para definir a presença de responsividade ao BH4: Critério 1: redução 30% de Phe após 8h da administração do medicamento; Critério 2: redução 30% de Phe após 24h da administração do medicamento. Resultados: Dezoito pacientes foram incluídos no estudo, com mediana de idade de 14 anos, sendo 66,7% do sexo masculino. Onze apresentavam a forma clássica da doença e três a forma atípica. Três (forma clássica: 1, forma atípica: 2) e cinco (forma clássica: 2, forma atípica: 2 e forma não-definida: 1) pacientes foram considerados responsivos ao BH4 conforme critérios 1 e 2, respectivamente. Os níveis de Phe plasmáticos do dia anterior ao teste de sobrecarga não demonstraram variação nos pontos de hora (p=0,523). Entretanto, quando comparamos os níveis de Phe nos pontos de hora do dia pré e pós BH4, encontrou-se variação significativa entre eles (p=0,006). A análise da associação genótipo-fenótipo, para os pacientes com dados disponíveis (n=6) mostrou que a mesma é multifatorial. Conclusão: Nossos achados estão de acordo com a literatura, e indicaram que um número considerável de pacientes brasileiros com HPA-PAH poderá ser beneficiado com a administração oral de BH4. / Introduction: Hyperphenylalaninemia by phenylalanine hydroxylase deficiency (HPAPAH) is an inborn error of metabolism in which increased serum levels of phenylalanine (Phe) occur. Recent studies on several populations showed that patients with HPA-PAH can have their serum levels reduced when receiving oral tetrahydrobiopterin (BH4). Objective: to identify in a sample of Brazilian HPA-PAH the patients who are responsive to the oral administration of BH4. Methods: the following inclusion criteria were used: diagnosis of HPA-PAH, age 7 years, on dietary treatment and Phe levels 6 mg/dL in all tests performed one year prior to the inclusion in this study. On the day before the BH4 challenge (Day 1) 3 blood samples were obtained to measure Phe levels. Blood samples were also obtained at time points 0, 4, 8 hours (Day 2) and 24 h (Day 3) after the intake of the medication. Phe levels were determined by tandem mass spectrometry. Criteria used to define responsiveness to BH4 were: Criterion 1: Phe reduction 30% 8 hours after BH4 administration; Criterion 2: Phe reduction 30% 24 hours after BH4 administration. Results: a total of 18 patients with a mean age of 14 years were included in this study; of those, 66.7% were male. Eleven presented the classical form of the disease and 3, the atypical form. Three patients (classical form: 1, atypical form: 2) and 5 (classical form: 2; atypical form: 2; undefined form: 1) were considered responsive to BH4 according to criteria 1 and 2, respectively. Phe serum levels on the Day 1 did not show any change on the established time point schedule (p=0.523). However, when comparing levels of Phe between Days 1 and 2, significant variation was found (p=0.006). The phenotype – genotype association analysis of patients with available data (n=6) showed that the association is multifactorial. Conclusion: In accordance with the literature, our findings show that many Brazilian patients with HPA-PAH can benefit from the oral administration of BH4.

Introdução: Estudos recentes, utilizando vários protocolos, têm demonstrado que pacientes com Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPA-PAH) podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de fenilalanina (Phe) mediante a administração de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Determinar, em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH, a responsividade à administração de dose única de BH4 por meio de um protocolo incluindo o teste de sobrecarga simples de Phe e o teste combinado de sobrecarga de Phe+BH4. Métodos: Foram incluídos no estudo pacientes com idade ≥ 4 anos, em tratamento dietético e que possuíam mediana de Phe plasmática inferior a 10mg/dL no ano anterior à inclusão. Foram realizados teste de sobrecarga simples de Phe, utilizando 100mg/kg de L-Phe (Teste 1) e teste combinado de Phe+BH4, utilizando 100mg/kg de L-Phe e 20mg/kg de BH4 (Teste 2), com intervalo de uma semana entre ambos. A ingestão do BH4 ocorreu após três horas da ingestão da Phe. Foram realizadas coletas de sangue no ponto basal e após três, 11 e 27h da ingestão de Phe (T0, T1, T2 e T3 dos testes 1 e 2, respectivamente). Para ser considerado responsivo, o paciente deveria apresentar evidência de redução dos níveis de Phe associada à administração do BH4 de acordo com pelo menos um dos seguintes critérios: critério A – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 dos Testes 1 e 2; critério B – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 dos Testes 1 e 2 e critério C – análise da diferença, em percentual, das áreas abaixo da curva de Phe entre os Testes 1 e 2. A classificação de responsividade foi também comparada com quatro critérios adicionais: critério D – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 do Teste 2; critério E – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 do Teste 2; cinco pacientes participaram de estudo anterior do grupo e foram também classificados através do critério F – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 8h da sobrecarga simples com BH4 e do critério G – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 24h da sobrecarga simples com BH4. Para todos os critérios foi utilizado como ponte de corte redução ≥ 30%. Resultados: Dezoito pacientes, com mediana de idade de 12 anos, participaram do estudo. Dez pacientes apresentavam a forma Leve de HPA-PAH e oito a forma Clássica. Seis pacientes foram considerados responsivos de acordo com os critérios adotados (Clássica: 2; Leve: 4). Houve concordância de responsividade entre os critérios A e B em relação ao C (Índice Kappa=0,557; p=0,017). Dos pacientes com genótipo disponível (n=16), seis possuíam dados de responsividade ao BH4 descritos na literatura, que foram concordantes com os encontrados no presente estudo. Conclusão: Dados relativos à responsividade, tipo de HPA-PAH e genotipagem estão de acordo com descrito na literatura. Haja vista a diferença de responsividade dos pacientes ao BH4 conforme o critério de classificação utilizado, salienta-se a importância de uma definição cautelosa de responsividade e que não seja baseada em um único critério. A comparação entre a sobrecarga simples de Phe e combinada de Phe+BH4 parece ser um critério adequado para avaliar responsividade ao BH4 em pacientes com HPA-PAH que apresentam bom controle metabólico quando em tratamento dietético. / Introduction: Recent studies using different protocols showed that patients with hyperphenylalaninemia due to phenylalanine hydroxylase deficiency (HPA-PAH) may have a reduction in phenilalanine (Phe) plasma concentrations after tetrahydrobiopterin (BH4) administration. Objective: To determine responsiveness to the administration of a single dose of BH4, in a sample of Brazilian patients with HPA-PAH using a protocol that includes the simple Phe loading test and the combined Phe+BH4 loading test. Methods: Patients included in the study were ≥ 4 years of age; their median Phe plasma concentration was ≤ 10mg/dL, and all underwent dietary treatment in the 12 months before inclusion in the study. Participants received a simple Phe loading test using 100mg/kg L-Phe (Test 1) and a combined Phe+BH4 loading test using 100mg/kg L-Phe and 20mg/kg /BH4 (Test 2) at a one-week interval. BH4 was ingested three hours after Phe ingestion. Blood samples were collected at baseline and three, 11 and 27h after Phe ingestion (time points T0, T1, T2 and T3 in Tests 1 and 2). To be classified as responsive, there should be evidence that the patient had a reduction in Phe levels associated with BH4 administration according to at least one of the criteria used: criterion A – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Tests 1 and 2; criterion B – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Tests 1 and 2; and criterion C – analysis of percentage differences of the areas under the Phe curve for Tests 1 and 2. Responsiveness classifications were also compared according to four additional criteria: criterion D – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Test 2; criterion E – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Test 2; criterion F – analysis of percentage difference of Phe values 8h after simple BH4 loading used for five patients that participated in a previous study conducted by the same authors; and criterion G – analysis of percentage difference of Phe values 24 h after simple BH4 loading, also used for the patients in the same previous study. The cut-off point for all criteria was a reduction of ≥ 30%. Results: Eighteen patients (median age = 12 years) were included in the study. Ten patients had mild HPA-PAH and eight, classical HPA-PAH. Six patients were responsive according to the criteria used (Classical: 2; Mild: 4). Responsiveness was concordant for criteria A and B when compared with criterion C (kappa=0.557; p=0.017). Of the patients whose genotype was available (n=16), six had data about BH4 responsiveness described in the literature, and these data were in agreement with our findings. Conclusion: Data about responsiveness, HPA-PAH type and genotype were in agreement with those described in the literature. The difference in BH4 responsiveness of patients according to classification criterion emphasizes the importance of a careful definition of responsiveness not based on a single criterion. The comparison of simple Phe loading and combined Phe+BH4 loading seems to be an adequate criterion to evaluate responsiveness to BH4 in patients with HPA-PAH and good metabolic control when following a dietary treatment.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum. Ela é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) que é responsável por converter a fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), que acaba elevando os níveis de Phe e seus metabólitos no sangue e tecidos. Se não tratada, a PKU pode desenvolver problemas neurológicos como convulsões, distúrbios motores e retardo mental. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos da Phe em alguns parâmetros do metabolismo, estresse oxidativo e viabilidade celular em cultura de astrócitos de ratos Wistar. Os astrócitos foram cultivados sob quatro condições: controle (com 0,4 mM de Phe no meio de cultura) e outros três grupos com concentrações finais de Phe de 0,5, 1,0 e 1,5 mM. Após 72 horas, os astrócitos foram coletados para análises bioquímicas. Nós observamos que os teste de brometo de tetrazolium (MTT) e lactato desidrogenase mostraram alterações na viabilidade celular em todas as doses testadas. Também foram notadas alterações em parâmetros de estresse oxidativo, indicando que a Phe pode induzir a produção de radicais livres, mas não encontramos diferenças significaticas nos parâmetros do metabolismo como a creatina-cinase, piruvato-cinase e adenilato-cinase. Estes resultados sugerem que a fenilalanina nas concentrações encontradas na PKU pode induzir estresse oxidativo e consequente morte celular em cultura de astrócitos. Considerando a importâncias dessas células para a manutenção da homeostase cerebral, é possível que estas alterações estejam relacionadas com os problemas neurológicos encontrados em pacientes com PKU. / Phenylketonuria (PKU) is the most common inborn error of amino acid metabolism. It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene that expresses phenylalanine hydroxylase enzyme (Pah) that converts phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr), that leads to high levels of Pheand its metabolites in blood and tissues. If left untreated, PKU can develop neurological problems as seizures, motor disturbances and severe mental retardation. The aim of this study is to investigate the effects of Phe on oxidative stress, some metabolic parameters and cell viability in astrocytes culture of Wistar rats.Astrocytes were cultures under four conditions: control (0.4 mMPhe in the medium), and other three groups with final Phe concentration of 0.5, 1.0 and 1.5 mM. After 72 hours, astrocytes were collected for biochemical measurements. We observed that tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays indicated that Phedecreased cell viability at all tested doses. Alterations on oxidative stress parameters indicated that Phecould induce free radicals production, but we didn’t find significative differences on metabolic parameters as creatine, pyruvate and adenylate kinases. Those results suggest that phenylalanine at concentrations found in PKU can induce oxidative stress and consequently cell death in astrocytes cultures. Considering the importance of astrocytes in brain homeostasis, it is possible that these changes may be related to neurological problems seen in PKU patients.