Considerando que diversas atividades biológicas dos ácidos clorogênicos já foram descritas na literatura, uma melhor compreensão da biossíntese e do acúmulo desses polifenois nas plantas está diretamente vinculada aos parâmetros de qualidade de fitoterápicos. Este trabalho teve o objetivo de monitorar a variação na concentração de metabólitos secundários do grupo dos ácidos clorogênicos no tecido foliar de diversas espécies diante de diferentes tratamentos pós-coleta. Este monitoramento foi realizado através da quantificação das substâncias por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas em sequência (CLUE-EM/EM). Na primeira fase do estudo, foram coletadas folhas de cada espécie selecionada para o estudo (Caju - Anacardium occidentale L.; Graviola - Annona muricata L.; Pata-de-Vaca - Bauhinia variegata L.; Limão - Citrus limon (L.) Burm. f.; Café - Coffea arabica L.; Pitanga - Eugenia uniflora L.; Alecrim - Rosmarinus officinalis L., e Jambolão - Syzygium cumini (L.) Skeels). As folhas foram submetidas a um processo de extração e os extratos obtidos foram analisados por CLAE-EM/EM. Foram encontradas nove substâncias monossubstituídas nas posições 3, 4 e 5 pertencentes aos subgrupos dos ácidos p-cumaroilquínicos, cafeoilquínicos e feruloilquínicos dos ácidos clorogênicos, além de ácidos dicafeoilquínicos. A identificação dos sinais cromatográficos foi realizada por meio dos padrões de fragmentação de cada composto. Na segunda fase do estudo, foram coletadas quatro folhas dos indivíduos em estudo. As folhas foram congeladas em nitrogênio líquido (para interrupção do metabolismo) em tempos diferentes: imediatamente após a coleta (T0), 30 min após a coleta (T0,5), 1 h após a coleta (T1) e 2 h após a coleta (T2). Este procedimento foi realizado uma vez por mês durante seis meses. Em outro momento foram retiradas seis folhas de três indivíduos de espécies selecionadas (Alecrim, Pitanga, Pata-de-Vaca, Limão e Café) e cada folha foi congelada nos tempos T0 (imediatamente após a coleta), T6 (6 h após a coleta), T12 (12 h após a coleta), T24 (24 h após a coleta), T48 (48 h após a coleta) e Ts (após secagem das folhas - aproximadamente 30 dias após a coleta). O material coletado foi extraído e analisado por CLUE-EM/EM, no modo MRM. O método analítico quantitativo foi validado, considerando os parâmetros de linearidade, exatidão e precisão. As concentrações dos ácidos clorogênicos em estudo não apresentaram um padrão de variação que se relacione com os tempos de tratamento ou um aumento linear nas respostas dentro do intervalo de 2 h após o início do catabolismo do tecido. As amostras com tempos de tratamento mais longo, por sua vez, apresentaram aumento significativo de diversos compostos nas folhas que não tiveram seu metabolismo interrompido 30 dias após a coleta. Este acúmulo de ácidos clorogênicos corrobora a hipótese de que o aumento da concentração destes compostos pode estar relacionado ao catabolismo de polímeros fenólicos de maior massa. / Considering that diverse chlorogenic acids\' biological activities have been described, a better understanding of their biosynthesis and accumulation is closely related to phytotherapics\' quality parameters. This research aimed to monitor the variation on the concentration of secondary metabolites from the chlorogenic acids\' group on the leaf\'s tissue of diverse species, towards different post-harvest treatments. The monitoring was performed through the quantification of the compounds by UPLCMS/ MS. On the first phase of the project, leaves from each selected species (Cashew - Anacardium occidentale L.; Soursop - Annona muricata L.; Pata-de-Vaca - Bauhinia variegata L.; Lemon - Citrus limon (L.) Burm. f.; Coffee - Coffea arabica L.; Cherry - Eugenia uniflora L.; Rosemary - Rosmarinus officinalis L., and Jambolan - Syzygium cumini (L.) Skeels) were harvested. This material was submitted to an extraction process, and the obtained extracts were analyzed by HPLC-MS/MS. Nine substances were found, monossubstituted on positions 3-, 4- and 5-, belonging to the subgroups of p-coummaroylquinic, caffeoylquinic and feruloylquinic acids, in addition to dicaffeoylquinic acids. The chromatographic signals\' identification was preceded observing the fragmentation pattern of each compound. On the second phase of the study, four leaves were collected from each individual. The leaves were frozen with liquid nitrogen (to interrupt the metabolism) on different moments - immediately after the collection (T0), 30 min after de collection (T0,5), 1 h after the collection (T1) and 2 h after the collection (T2). This procedure happened once a month during six months. On August, 2016, a different collection was performed for a broader observation: six leaves were harvested from three individuals from selected species (Rosemary, Cherry, Pata-de-Vaca, Limon and Coffee), and each leave was frozen on T0 (immediately after the collection), T6 (6 h after the collection), T12 (12 h after the collection), T24 (24 h after the collection), T48 (48 h after the collection) and Ts (after leaf\'s drying - approximately 30 days after collection). The harvested material was extracted and analyzed by UPLC-MS/MS, on MRM mode. The analytical method was validated for linearity, accuracy and precision. Chlorogenic acids\' concentrations did not show a pattern of variation that related to the different treatments or a linear increase on response until 2 hours after the beginning of the tissue catabolism. The samples submitted to a broader treatment interval, however, showed a significant rise on the concentration of different compounds, on leaves that did not have their metabolism interrupted until 30 days after the collection. This accumulation of chlorogenic acids agrees with the hypothesis that the raise on the concentration of these substances can be related to the catabolism of polymeric phenols of higher mass.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-02-24T14:21:28Z No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 7731405 bytes, checksum: 68a495488b791e03507898e6666f5361 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-24T14:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 7731405 bytes, checksum: 68a495488b791e03507898e6666f5361 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / The genus Piper is the largest the family Piperaceae, its species are distributed especially in neotropical region of the globe. The phytochemical research of Piper species originated numerous scientific papers in many parts of the world, which led to the isolation of many bioactive compounds such as kavalactones, lignoids, chromones, flavonoids and chalcones, terpenes, steroids, prenylated benzoic acids, aristolactams, phenylpropanoids and amides. Piper arboreum is an erect shrub with about 4.0 meters high. It is popularly known as “fruto de morcego”, “alecrim-de-Angola”, “pau-de-Angola” or “beto-preto” and used in Brazil, in the form of decoction for the treatment of rheumatism, bronchitis, flu and colds and used against venereal and urinary tract diseases. This work reports the phytochemical study of the leaves and stem of P. arboreum Aublet. Using usual chromatographic methods and spectroscopic techniques of IR, MS, 1H and 13C NMR and comparison with the literature data it was possible to isolate and identify from the leaves and stem of Piper arboreum, a mixture of steroids: β-sitosterol and stigmasterol, four aristolactams: Piperolactam A, Piperolactam B, Piperolactam C and Cefaronone B, three phenylpropanoids: 3,4,5-trimethoxyphenyl-propanoic acid, 3,4-dimethoxyphenyl-propanoic acid and 3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl-propanoic acid and three amides: Arboreumine, N-(12,14-dimethoxy-13-hydroxydihydrocinamoil)-3-pyridin-2-one and N-[12-(15,16-methylenedioxyphenyl)-8( E),10 (E) -heptadienoil-pyrrolidine. The last two compounds are being reported for the first time in the literature. / O gênero Piper é o maior da família Piperaceae, suas espécies estão distribuídas especialmente na região neotropical do globo terrestre. A investigação fitoquímica de espécies de Piper originou inúmeros trabalhos científicos em várias partes do mundo, o que levou ao isolamento de diversos compostos bioativos tais como cavalactonas, lignoides, cromonas, flavonoides e chalconas, terpenos, esteroides, ácidos benzoicos prenilados, aristolactamas, fenilpropanoides e amidas. Piper arboreum é um arbusto ereto de aproximadamente 4,0 metros de altura. Popularmente é conhecida como fruto de morcego, alecrim-de-Angola, pau-de-Angola ou beto-preto e utilizada no Brasil na forma de decocto para o tratamento de reumatismo, bronquite, gripe e resfriado e empregada contra doenças venéreas e do trato urinário. Este trabalho reporta o estudo fitoquímico das folhas e caule de P. arboreum Aublet. Utilizando-se métodos cromatográficos usuais e técnicas espectroscópicas de IV, EM e RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais e a comparação dos dados com a literatura foi possível isolar e identificar das folhas o e do caule de Piper arboreum, uma mistura de esteroides: β-sitosterol e estigmasterol, quatro aristolactamas: Piperolactama A, Piperolactama B, Piperolactama C e Cefaronona B, três fenilpropanoides: Ácido 3,4,5-trimetoxifenil-propanóico, Ácido 3,4,-dimetoxifenil-propanóico e Ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxifenil-propanóico e três amidas: Arboreumina, N-(12,14-dimetoxi-13-hidroxidihidrocinamoil)-3-piridin-2-ona e N-[12-(15,16-metilenedioxifenil)-8(E),10(E)-heptadienoil-pirrolidina. Os dois últimos compostos estão sendo relatados pela primeira vez na literatura.

A presente tese compõe-se de três capítulos. Capitulo I. Uma revisão geral é apresentada sobre os padrões de consumo de alimentos e a problemática da segurança alimentar diante do acelerado crescimento populacional, além dos desafios impostos pelas mudanças climáticas previstas para o futuro próximo. Busca-se neste capítulo uma compreensão abrangente sobre possíveis alterações na qualidade nutricional da planta oriunda de alterações climáticas que se esperam até o final do século em curso. Capitulo II. O capítulo refere-se à caracterização e determinação dos teores de substâncias fenólicas solúveis de órgãos de plantas de sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) var. \'BRS 330\', cultivadas sob déficit hídrico e distintas concentrações atmosféricas de CO2. As plantas foram cultivadas em Câmaras de Topo Aberto (OTC) por 120 dias após o plantio (DAP), sob condições de CO2 ambiente (400 ppm) e elevado (800 ppm) (tratamentos A e E, respectivamente). Após 60 dias, a irrigação foi reduzida a 23% em relação às plantas controle. As coletas foram estabelecidas em duas fases de desenvolvimento do grão: estádio imaturo (90 DAP) e maduro (120 DAP). Foram feitas determinações de flavonoides e fenilpropanoides de folhas, pedúnculo, colmo, raízes escoras, raízes e grãos por CLAE, utilizando orientina, vitexina, pinocembrina e ácido clorogênico como padrões externos para dosagem de flavonoides e fenilpropanoides, respectivamente. O teor de taninos totais dos mencionados órgãos foi determinado por precipitação com albumina de soro bovino e espectrofotometria. Técnicas de CLAE-DAD-MS-MS foram utilizadas para a caracterização das substâncias fenólicas de todos os órgãos da planta. Análises Multivariadas de Agrupamento e Componentes Principais (PCA) foram utilizadas para avaliar afinidades entre 132 substâncias detectadas e 72 substâncias caracterizadas, respectivamente. As variações de abundância relativa de fenilpropanoides (24 substâncias) e flavonoides (48 substâncias), devidas aos distintos estádios de maturação e formas de tratamento, são apresentadas por meio de heat maps para cada órgão. A maior diversidade de substâncias fenólicas foi observada em folhas, e a menor, nos grãos. Derivados de ácido ferúlico, ácidos clorogênicos, flavonas e flavanonas foram caracterizados na planta toda. Flavanonas foram detectadas apenas em raízes escoras, raízes e grãos. As O-glicoflavonas foram detectadas com frequência muito maior do que C-glicosídeos. Aos 90 DAP, alterações significativas devidas a E foram observadas no conteúdo de fenilpropanoides das folhas e raízes escoras e no conteúdo dos flavonoides das folhas e grãos. Aos 120 DAP, foi detectado incrementos no conteúdo de flavonoides das raízes escoras. O teor de taninos nos grãos da var. \'BRS 330\' é relativamente elevado, e foi reduzido significativamente com o tratamento E aos 120 DAP. Capitulo III. Esse capítulo tem por objetivo a comparação da composição de substâncias fenólicas da parede celular e ligninas das mesmas plantas e órgãos enfocados no Capítulo II. Material de folhas, pedúnculo, colmo, raízes escoras, raízes e grãos nos estádios imaturo (90 DAP) e maduro (120 DAP) foram submetidos à hidrólise alcalina para remoção dos ácidos p-cumárico e ferúlico, principais ácidos fenólicos ligados à parede celular de gramíneas. O teor de ligninas e a distribuição de seus monômeros constituintes p-hidroxifenila (H), guaiacila (G) e siringila (S) foram determinados por meio de tratamento da parede celular total dos órgãos com brometo de acetila e nitrobenzeno, respectivamente. A análise dos monômeros de lignina foi por CLAE-DAD. Aos 90 DAP, alterações significativas induzidas por E foram observadas relativamente ao teor de ácido p-cumárico de folhas, pedúnculo e grãos. Paralelamente, o teor de ácido ferúlico foi alterado nas folhas e raízes escoras. Aos 120 DAP, reduções significativas nos teores de ácidos p-cumárico e ferúlico foram observadas nas folhas. O conteúdo de lignina foi alto nas raízes escoras em ambos os estádios de maturação e reduzido significativamente por E nos grãos. O conteúdo dos monômeros H, G e S do colmo foi também reduzido significativamente por E / The present Dissertation comprises three chapters. Chapter I. Taking into account the fast population growth, a broad revision is made in this chapter about patterns of food consumption and problems related to food safety. In addition, comments are made about challenges imposed by climate changes expected to occur in the near future. It is aimed to reach a broad understanding about possible changes on food quality due to the world changes foreseen to happen by the end of the current century. Chapter II. This chapter refers to the characterization and measurement of the contents of phenolic substances of organs of sorghum plants (Sorghum bicolor (L.) Moench) var. \'BRS 330\', cultivated under the influence of hydric deficit and distinct atmospheric CO2 concentration. The plants were cultivated inside Open Top Chambers (OTC) over 120 days after planting (DAP) under the effects of environmental (400 ppm) and elevated CO2 (800 ppm) (treatments A and E, respectively). After 60 days, irrigation was dropped to 23% relative the control. Material collection was scheduled to occur on two developmental phases: immature stage (90 DAP) and mature stage (120 DAP). Measurements were made of the contents of flavonoids and phenylpropanoids from leaves, peduncle, culm, prop roots, roots and grains by HPLC, using orientin, vitexin, pinocembrin and chlorogenic acid, respectively, as calibration external standards. The contents of tannins of the mentioned sorghum organs were determined by precipitation with bovine serum albumin and spectrophotometry. Techniques of CLAE-DAD-MS-MS were used for characterization of phenolic substances of all plant organs. Multivariate Cluster and Principal Components Analysis (PCA) were used to evaluate affinities among 132 detected and 72 characterized substances, respectively. Variations of relative abundance of phenylpropanoids (24 substances) and flavonoids (48 substances), due to distinct maturation stage and CO2 concentration, are presented by means of heat maps for each organ. The highest diversity of phenolic substances was observed in leaves and the lowest in grains. Derivatives of ferulic acid, chlorogenic acids, flavones and flavanones were characterized in extracts of all organs. Flavanones were detected only in prop roots, roots and grains. O-Glycoflavones largely predominated over C-glycosides. At 90 DAP a significant increase of phenylpropanoids due to E was observed in leaves and prop roots and of flavonoids in leaves and grains. At 120 DAP an increase was observed in the flavonoid content of prop roots. The content of tannins in grains of var. \'BRS 330\' is relatively high and was significantly reduced by treatment E at 120 DAP. Chapter III. This chapter aimed to compare the composition of phenolic substances of the cell wall and lignins of the same plants and organs dealt with in Chapter II. Material of leaves, peduncle, culm, prop roots, roots and grains at the immature (90 DAP) and mature (120 DAP) stages were treated by alkaline hydrolysis for removal of p-coumaric and ferulic acids, the main phenolic acids attached to grasses cell walls. The contents and lignins and the distribution of their monomer constituents p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) and siringyl (S) were determined by treatment of whole cell walls of all organs with acetyl bromide and nitrobenzene, respectively. The analysis of lignin monomers was by CLAE-DAD. At 90 DAP, significant changes induced by E were detected in connection with the content of p-coumaric acid of leaves, peduncle and grains. At the same time, the content of ferulic acid was changed in leaves and prop roots. At 120 DAP, significant decreases of the contents of p-coumaric and ferulic acids were detected in leaves. The content of lignin was high in prop roots at both maturation stages and was significantly lowered by E in grains. The contents of the monomers H, G and S of the culm was also significantly lowered by E

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nectandra megapotamica (Lauraceae) is abundant in the Deciduos Forest in Santa Maria-RS. Its essential oil (EO) has been studied for biological activities due to its anti-inflammatory, antifungal, antimicrobial, and cytotoxic effects against tumor cells, among others. The presence of phenylpropanoids as well as sedative and anesthetic activities in R. quelen were observed in the prospect of EO of Nectandra megapotamica. As a hypothesis, we considered the seasonal variability and the occurrence of chemical phenotypes for the individuals in the same population of the species with different biological activities for the EO. The objectives of this study were to define the potential of N. megapotamica in a population in Santa Maria-RS for the production of EO; to determine the yield (Y), chemical composition and the seasonal variation of EO; to evaluate the possible occurrence of chemical phenotypes (differentiated chemical composition); to isolate compounds of interest; and to perform tests of biological activities for the EO and for the isolated compound. The EO samples were obtained from fresh leaves, which were initially separated in young (YL) and old leaves (OL) by hydrodistillation in triplicate for three hours. The collections occurred in function of the seasons in two locations in Santa Maria-RS (Morro do Elefante, and in the proximity of the 318 km of BR 158). The respective Y values were determined, and EO samples were analyzed by GC/MS. Some samples were also analyzed by GC-FID, in triplicate. The chemical composition of the EO was analyzed and grouped by multivariate techniques, main components and hierarchical grouping. The EO was also fractionated by CC, for the isolation of a compound, whose identification happened by NMR. The discrepant groups (CG2 and CG5) were tested for allelopathic, insecticide and anesthetic activities in fish. The compound obtained from CG5 was identified as isoelemicin (phenylpropanoid) and also tested for the anesthetic activity. The largest Y for the EO was observed in spring (YL 0.24% and OL 0.14%) during flowering, fruiting and foliation, and the lowest in autumn (YL 0.13% and OL 0.11%) in the rustification and at rest. The major constituents were α-pinene with greater Y in spring and summer (YL 30.81% and OL 35.86%), and bicyclogermacrene with greater Y in autumn and winter (YL 24.19% and OL 21.73%), which formed two large CG. In the CG of bicyclogermacrene, the presence of phenylpropanoids was observed and therefore it constituted a specific group (CG5). However, CG2 presented higher concentration of monoterpenoids. In the biological tests, the allelopathic activity (lower seed germination and seedling development) for L. sativa var. regina, B. subalternans, G. max, A. strigosa, L. multiflorum and O. sativa was observed when the seeds were submitted to the EO. Moreover, the insecticidal activity was observed in N. viridula, and also sedation in R. quelen. The CG5 was superior than CG2, concerning allelopathy in O. sativa; however, both groups were active at the concentration of 15% EO for the other species, which inhibits 100% germination of B. subalternans (QG5) and A. strigosa (both groups). Regarding the insecticidal action of EO at 5%, the CG5 promoted 46.67% mortality of N. viridula, and CG2 only 14.44%. Concering R. quelen, we observed toxicity associated with sedation, both by the EO similar to CG5 and by isoelimicin. The stage of anesthesia was observed at the concentracion of 500 mg L-1 EO; however, the effect was lower than that observed for eugenol (positive control). In conclusion, the species in the population assessed has the potential to produce EO as a source of new bioactive molecules and biological action mechanisms that should consider the toxicity component, which requires further studies. / Nectandra megapotamica (Lauraceae) é abundante na Floresta Estacional Decidual em Santa Maria-RS. O seu óleo essencial (OE) vêm sendo estudado quanto às atividades biológicas, devido a sua ação anti-inflamatória, antifúngica, antimicrobiana, citotóxica contra células tumorais, dentre outras. Na prospecção do OE foram encontrados fenilpropanoides, além de atividades sedativas e anestesicas em Rhamdia quelen. Como hipótese, considerou-se que haja variabilidade sazonal e ocorrência de fenótipos químicos para os indivíduos na mesma população da espécie, com atividade biológica diferenciada para o OE. Os objetivos deste trabalho foram pesquisar o potencial de N. megapotamica, em uma população em Santa Maria, para a produção de OE; determinar o rendimento (R), a composição química e sua variação sazonal; avaliar a possível ocorrência de fenótipos químicos (composição química diferenciada); isolar constituintes de interesse; e por fim, realizar testes de atividades biológicas, para o OE e para o isolado. Os OE foram obtidos de folhas frescas, inicialmente separadas em jovens (FJ) e velhas (FV), por hidrodestilação em triplicata por três horas. As coletas ocorreramem função das estações do ano, em dois locais em Santa Maria-RS (Morro do Elefante e, na proximidade do km 318 da BR 158). Foram determinados os respectivos R, e os OE foram analisados por CG-EM. Algumas amostras também foram analisadas por CG-DIC, em triplicata. A composição química do OE dos indivíduos coletados foi analisada e agrupada por técnicas multivariadas, componentes principais e agrupamento hierárquico. Foi também realizado fracionamento do OE por CC, para o isolamento de uma substância, cuja identificação se deu por RMN. Determinados os grupos químicos (GQ) e o constituinte isolado, os grupos mais discrepantes (GQ2 e GQ5) foram testados quanto a atividade alelopática, inseticida e anestésica em peixes. A isoelemicina foi avaliada para esta última. O maior R do OE foi observado na primavera (FJ 0,24% e FV 0,14%), durante a floração, frutificação e foliação, e o menor no outono (FJ 0,13% e FV 0,11%), na rustificação e repouso. Os constituintes majoritários foram α-pineno, com maior R na primavera e verão (FJ 30,81% e FV 35,86%), e biciclogermacreno, com maior R no outono e inverno (FJ 24,19 e FV 21,73%). Estes formaram dois grandes GQ. No GQ do biciclogermacreno foi observada a presença de fenilpropanoides, que constituíram um grupo específico (GQ5). Já o GQ2 apresentou maiores teores de monoterpenoides. Do OE do GQ5 foi isolada a isoelemicina (fenilpropanoide). Nos testes biológicos realizados foram observadas atividade alelopática (menor germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas) para Lactuca sativa cv. regina, Bidens subalternans, Glicine max, Avena strigosa, Lolium multiflorum e Oryza sativa; atividade inseticida em Nezara viridula e sedação em R. quelen. O GQ5 foi superior ao GQ2, nos testes de alelopatia em O. sativa, mas ambos os grupos foram ativos na concentração de 15% de OE para as demais espécies, inibindo100% da germinação de B. subalternans (GQ5) e de A. strigosa (ambos os grupos). Na ação inseticida com 5% do OE, o GQ5 promoveu 46,67% de mortalidade de N. viridula, e o GQ2 apenas 14,44%. Em R. quelen foi observada sedação associada à toxicidade, tanto pelo OE similar ao GQ5 (obtido do segundo local de coleta) como pela isoelemicina. O estágio de anestesia foi observado na concentração de 500 mg L-1 de OE, mas o efeito foi inferior ao observado para o eugenol com 50 mg L-1 (controle positivo). Conclui-se que a espécie, na população avaliada, possui potencial para produzir OE, como fonte de novas moléculas bioativas e mecanismos de ação biológica, que devem considerar a componente de toxicidade, o que exigirá novas pesquisas.