Les microparticules (MP) sont des vésicules qui résultent du bourgeonnement des membranesdes cellules activées ou apoptotiques. Leur capacité à vectoriser des systèmes fonctionnelsexprimés par leurs cellules d’origine nous a conduit à explorer, la génération de plasmine àleur surface. Dans un premier travail, nous montrons que les MP dérivées de cellulesendothéliales (MPE) sont des surfaces catalytiques capables d’activer le plasminogène par lesystème de l’urokinase et de son récepteur (uPA/uPAR). Les MPE agissent comme desvecteurs de plasmine constituant une nouvelle voie dans la régulation des activitésprotéolytiques de l’endothélium. Dans un second travail, nous avons montré que l’uPA portéepar les cellules ou par les MPE est spécifiquement impliquée dans un mécanismereconnaissance du plasminogène lié à une autre surface biologique générant de la plasmine insitu avec une grande efficacité. Dans un troisième travail, nous montrons que cette activitéfibrinolytique est détectable sur les MP extraites de la circulation sanguine, où elle est plusspécifiquement portée par les sous populations endothéliales et leucocytaires. Cette activitéqui est dépendante de l’uPA mais aussi de l’activateur tissulaire du plasminogène, estmodulée dans des pathologies cardiovasculaires et auto-immunes. Dans une seconde partie, lapertinence de la mesure des MP comme biomarqueur en pratique clinique nous a amené ànous focaliser sur leurs méthodes d’analyse. En effet, à l’heure actuelle, l’évaluation dubénéfice apporté par les MP est limitée par un manque de standardisation des méthodologies.Dans ce travail, nous présentons une nouvelle stratégie de standardisation de la cytométrie enflux (CMF) et son évaluation dans le cadre d’une étude multicentrique utilisant des microbillesfluorescentes calibrées en taille. Enfin, nous discutons dans une revue les limitesactuelles de la CMF et les stratégies ou améliorations technologiques permettant de lesdépasser. / Microparticles (MP) are small vesicles resulting from the blebbing of cell membranes in response to activation or apoptosis. Because they express functional molecules from their parent cells, plasmin generation at their surface has been explored. First we have shown that endothelial derived MP (EMP) promote plasminogen activation at their surface in an urokinase and its receptor (uPA/uPAR) dependant manner. Thus, plasmin generation by EMP constitutes a new pathway for the regulation of the endothelium proteolytic activities. Second, we have shown that cellular or MP uPA is specifically involved in the recognition and effective activation of plasminogen bound to another biological surface. Third, we have demonstrated that circulating endothelial and leukocytes MP bear this plasminogenolytic activity which it not only uPA but also tissue-type plasminogen activator dependant and modulate in pathological settings such as cardiovascular and auto-immune diseases. Supported by this work, a patent on a method to measure MP plasmin activity has been filed. In a second part, we focused on analytical methods available to measure MP. Indeed, there is an increasing interest to measure MP as biomarker in clinical practice. However, the evaluation of their input for patients is impeding by methodological concerns and a lack of standardization so far. In this work, we present a new strategy based a size-calibrated fluorescent beads for the standardization of flow cytometry (FCM). This approach was evaluated in a multicentre study. Finally, we reviewed the present limitation of the FCM for MP measurement and the strategies or technological improvements to overcome them.

Thèse d'exercice : Médecine. Médecine générale : Nantes : 2007. / Bibliogr.

L'activation du plasminogène est importante dans les phénomènes liés au cancer. Ma thèse démontre que la mélanotransferrine agit comme accélérateur dans l'activation du plasminogène avec ses deux activateurs : l'uPA, lié au cancer et le tPA, lié à la fibrinolyse. Son action ambivalente, à la fois protumorale et antitumorale, est caractérisée par son site d'action au niveau cellulaire. La mélanotransferrine membranaire agit comme un catalyseur pour amplifier l'activation du plasminogène à la membrane, tandis que la forme soluble de la mélanotransferrine entre en compétition avec la mélanotransferrine membranaire pour inhiber son effet. Dans la présente étude, nous avons découvert que deux composantes du système plasminolytique : le pro-uPA, précurseur de l'uPA et le plasminogène interagissent avec la mélanotransferrine. L'interaction de la mélanotransferrine avec le système plasminolytique stimule l'activation du plasminogène par ses deux activateurs. Nous démontrons également avec un anticorps dirigé contre la mélanotransferrine ou par l'inhibition de son expression par un siRNA que la mélanotransferrine intervient dans le processus menant aux métastases par l'inhibition de la migration cellulaire. De plus, nous démontrons que la mélanotransferrine module la dissolution de caillots de fibrine dépendante du tPA ou de l'uPA, une composante importante de la matrice provisoire extracellulaire impliquée dans la dispersion des métastases. Dans un modèle où le dépôt de fibrine provoqué par le facteur tissulaire (TF) stimule l'invasion des cellules de mélanome (SK-Mel-28), nous démontrons une inhibition de l'invasion induite par le TF dans le poumon lorsque l'expression de la mélanotransferrine est inhibée par un siRNA. Ces résultats suggèrent que la mélanotransferrine est directement impliquée dans la propagation des métastases des mélanomes qui l'expriment fortement. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Activation du plasminogène, Invasion tumorale, Migration, Fibrinolyse, uPA, tPA.

Tübingen, Univ., Diss., 2007.

Thesis (doctoral)--Universiteit van Amsterdam.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Les microparticules sont des vésicules extracellulaires qui résultent du remodelage des phospholipides membranaires en réponse à une activation ou une apoptose. La vision initiale leur attribuant une activité uniquement procoagulante s’avère plus complexe, par la mise en évidence d'une activité plasminogénolytique portée par les MPs endothéliales, tumorales et leucocytaires (MPLs). Au cours de ce travail, nous avons démontré un nouveau mécanisme impliquant les MPLs comme des vecteurs d’une activité fibrinolytique capable de lyser un thrombus fibrino-plaquettaire en fonction de leur activité de génération de plasmine. Cette activité s’intègre dans un rôle protecteur des MPs capable de contrebalancer le risque de microthromboses associé au choc septique. Cette activité fibrinolytique identifie les MPs comme des biomarqueurs déterminants pour le pronostic vital mais aussi comme des cibles thérapeutiques potentielles, pouvant être à l’origine de biothérapies vésiculaires basées sur la génération de MPs fibrinolytiques de grade clinique. L’évaluation du bénéfice apporté par les MPs est actuellement limitée par un manque de standardisation. Dans une seconde partie de ce travail, nous avons proposé une nouvelle stratégie de standardisation de la cytométrie en flux. Cette stratégie a été évaluée dans le cadre d'une étude multicentrique internationale qui a montré pour la première fois l’absence de différence significative des numérations des MPs entre des instruments de configuration optique différente. Maitriser des protocoles standardisés est une étape indispensable pour accélérer le transfert de ces innovations diagnostiques et thérapeutiques au lit du patient. / The microparticles are extracellular vesicles resulting from the remodeling of membrane phospholipids in response to activation or apoptosis. The initial vision only assigning a procoagulant activity is more complex, by highlighting a range plasminogenolytic activity by endothelial, tumor and leukocyte (MPLS) MPs. In this work, we demonstrated a novel mechanism involving MPLS as vectors fibrinolytic activity able to lyse a fibrin-platelet thrombus on the basis of generation of plasmin activity. This activity is part of a protective role of MPs which may counterbalance the risk of microthromboses associated with septic shock. This fibrinolytic activity identifies MPs as key biomarkers for prognosis but also as potential therapeutic targets that can be the source of vesicular biotherapies based on generation of fibrinolytic MPs of clinical grade. The evaluation of the benefit provided by MPs is currently limited by a lack of standardization. In the second part of this work, we proposed a new strategy for standardization of flow cytometry. This strategy was evaluated in a multicenter international study that showed for the first time no significant difference in MPs counts between different optical configuration tools. To master standardized protocols is a necessary step to improve the transfer of these diagnostic and therapeutic innovations to the patient.

L'invasion des matrices de fibrine par les cellules endothéliales est un événement clé dans l'angiogenèse. Dans ce travail, nous avons utilisé un modèle d'angiogenèse in vitro qui consiste en des cellules endothéliales humaines cultivées dans une matrice de fibrine en trois dimensions (3D). Ce modèle reproduit au mieux le microenvironnement cellulaire en 3D in vivo. En parallèle, nous avons testé plusieurs molécules nutraceutiques sur ce modèle cellulaire afin de démontrer leur effet sur la fibrinolyse lors de l'angiogenèse. Nous démontrons que l'habilité des cellules endothéliales à pénétrer dans une matrice de fibrine en 3 dimensions est induite par le VEGF. La fibrinolyse dépendante du VEGF a été complètement contrée par le PAl-1, BB-94, aprotinine et TIMP-2 suggérant l'implication du système activateur de plasminogène/plasmine ainsi que celui des métalloprotéinases. De plus, les anticorps neutralisants anti t-PA ont complètement inhibé la fibrinolyse. Dans l'étude nutraceutique, nous avons prouvé que certaines molécules dérivées de l'alimentation ont un pouvoir antiangiogénique en bloquant la fibrinolyse dans notre modèle cellulaire en agissant principalement sur la sécrétion du t-PA. Ces résultats suggèrent une relation étroite entre le système des MMP et celui des activateurs du plasminogène pour une protéolyse efficace de la matrice de fibrine, et précise l'effet antiangiogénique des polyphénols par leur action sur le t-PA et probablement sur les MMP. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Activateur de type tissulaire du plasminogène, Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire, Dégradation de fibrine, Métalloprotéinases, Polyphénols, Antiangiogénèse.

Les tiques sont des arthropodes ectoparasites obligatoires qui se nourrissent sur une grande variété de vertébrés sur une large partie du globe. Au cours de leur repas, les tiques sécrètent dans leur salive de nombreux facteurs leur permettant de contourner bon nombre des défenses de l’hôte. Bien que la littérature rapporte beaucoup d’informations au sujet des effets du repas de la tique sur l’hôte, la nature des facteurs actifs exprimés par les glandes salivaires de la tique est peu connue. Au cours d’anciens travaux au sein du laboratoire, le crible de deux banques d’ADN complémentaires - issues de la rétro-transcription des ARN messagers synthétisés par les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus – a permis l’identification de 27 protéines dont l'expression est spécifiquement induite ou régulée positivement pendant le repas sanguin de la tique I. ricinus. Parmi ces protéines, la protéine Seq24, induite au cours du repas sanguin, présente la capacité de moduler les immunités innée et acquise de l’hôte. En conséquence, la protéine Seq24 a été nommée Iris pour « Ixodes ricinus Immunosuppressor ». Au cours de la présente étude, notre but fût de caractériser le rôle d’Iris et de déterminer son importance dans le repas sanguin de la tique I. ricinus. La protéine Iris appartient à la famille des inhibiteurs de sérine protéases et présente une homologie significative avec l’inhibiteur d’élastase de leucocytes. Une analyse in silico a confirmé qu’Iris présentait la structure des serpines, et notamment le RCL (Reactive Center Loop), boucle responsable de l’activité anti-protéasique. Comme attendu (sur base de l’analyse in silico), Iris inhibe de manière spécifique l’activité de plusieurs sérine protéases, et en particulier l’élastase de leucocyte. Ces tests effectués, nous avons essayé de comprendre quel(s) pouvai(en)t être le(s) rôle(s) d’Iris dans l’accomplissement du repas sanguin de la tique, c’est à dire dans la lutte contre les différents systèmes de défenses de l’hôte. Tout d’abord, des tests ont démontré la capacité d’Iris à inhiber les mécanismes de l’hémostase. Des tests sur du plasma et du sang complet ont montré qu’Iris allonge le temps de fibrinolyse, la voie intrinsèque de la coagulation et l’adhésion plaquettaire. L’utilisation de mutants a également démontré que si les deux premières activités sont dépendantes du RCL, et donc d’un mode de fonctionnement anti-protéolytique, l’adhésion plaquettaire est indépendante de ce système. Ce résultat met en évidence l’existence d’autres sites actifs, isolés par analyse in silico, nommés Receptor Binding Domain (RBD). Un travail antérieur du laboratoire avait permis d’indiquer la capacité de la protéine recombinante Iris semi-purifiée à inhiber la production de TNF-a, d’IL-6, et d’IL-8 (cytokines pro-inflammatoires) ainsi que l’IFN-g par des PBMCs (Peripherical Blood Mononuclear Cells) humaines. Ces résultats ont été confirmés avec de la protéine purifiée. Des analyses complémentaires ont démontré qu’un mutant d’Iris - dépourvu d’activité anti-protéasique - conserve l’activité pro-inflammatoire. Là encore, ce mécanisme semble impliquer un ou plusieurs RBD. L’utilisation d’anticorps dirigés contre ces zones a permis de déterminer le domaine d’interaction (aa : 105-120) impliqué dans cette fonction. D’autre part, une analyse par FACS a permis de démontrer qu’Iris interagit uniquement avec les cellules d’origine monocytaire. Enfin, nous avons également analysé l’importance d’Iris au cours du repas sanguin de la tique par une approche vaccinale. Les résultats observés indiquent que 30 % des tiques nourries sur des lapins immunisés par la protéine rIris ne survivent pas au repas.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.