A infecção crônica pelo vírus da hepatite C (HCV) é importante fator de risco para o desenvolvimento de cirrose hepática e de carcinoma hepatocelular. A evolução para formas mais graves está relacionada a fatores ligados ao vírus, ao hospedeiro e à resposta imune. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre os polimorfismos do gene HLA-E, a expressão da molécula HLA-E e a gravidade da doença hepática pelo HCV. Foram incluídos 112 pacientes com hepatite C crônica e avaliados parâmetros clínicos, bioquímicos e histológicos (esteatose, atividade inflamatória e fibrose hepática). A variabilidade do gene HLA-E foi avaliada por sequenciamento de Sanger, e a expressão hepática da molécula, por imunoistoquímica. Para comparação da expressão hepática da molécula HLA-E e da variabilidade do gene HLA-E, foram usados dois grupos controles de indivíduos sem hepatopatia da mesma região geográfica. A imunoistoquímica para HLA-E identificou expressão da molécula nos hepatócitos e nas células de Kupffer. A expressão de HLAE em hepatócitos e células de Kupffer foi encontrada em 56,3% e 43,8% dos pacientes com HCV e em 20% e 10% nos controles (P = 0,008 e 0,02), respectivamente. Foi identificado que o percentual de pacientes do sexo masculino, com expressão moderada de HLA-E em células de Kupffer, foi maior em relação aos pacientes do sexo feminino (22,8% x 7,3%; P = 0,03). As amostras de fígado classificadas como esteatose, atividade necroinflamatória e fibrose graves apresentaram maior grau de expressão de HLA-E em células de Kupffer e hepatócitos, com associação linear significativa. Na análise multivariada, as variáveis que influenciaram significativamente a gravidade da doença foram a expressão da molécula HLA-E nos hepatócitos, a idade avançada e o índice de massa corporal maior que 25. Foram identificados 14 haplótipos diferentes do gene HLA-E, quatro deles ainda não descritos na literatura. A frequência do alelo HLA-E*01:01:01:03 foi menor no grupo de pacientes, quando comparada ao controle (P = 0,0001). O alelo HLA-E*01:03:05 associou-se a maior probabilidade (OR = 4,69) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer (P = 0,046). O genótipo TT do polimorfismo +424 T/C (rs1059510) associou-se a menor probabilidade (OR = 0,06) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer, em relação à ausência de expressão (P=0,009), a menor probabilidade (OR = 0,22) de atividade inflamatória moderada/grave em relação à leve (P = 0,047) e esteve associado a menor probabilidade (OR = 0,17) de fibrose hepática moderada/grave em relação à fibrose leve (P = 0,049). Os resultados do presente estudo sugerem que a pesquisa de fatores imunogenéticos, como a expressão hepática da molécula HLA-E e a identificação da variabilidade genética do HLA-E, pode ter aplicabilidade no manejo clínico dos pacientes, uma vez que auxilia na discriminação daqueles com maior risco de atingir formas avançadas da hepatite C crônica. / Chronic hepatitis C is an important risk factor for the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The severity of liver disease can be influenced by factors related to the virus, the host and the immune response. The aim of this study was to evaluate the association between HLA-E gene polymorphisms, HLA-E molecule expression and HCV liver disease severity. We included 112 patients with chronic hepatitis C and evaluated clinical, biochemical and histological parameters (steatosis, inflammatory activity and liver fibrosis). The variability of the HLA-E gene was assessed by Sanger sequencing and liver HLA-E expression by immunohistochemistry. Two control groups of individuals without hepatopathy from the same geographical region were used to compare the HLA-E expression and the gene variability. Immunohistochemistry for HLA-E showed positivity in hepatocyte and Kupffer cell. HLA-E positivity in hepatocytes and Kupffer cells were found in 56.3% and 43.8% of HCV patients and in 20% and 10% in the controls (P = 0.008 and 0.02), respectively. We found that the percentage of male patients with moderate HLA-E expression in Kupffer cells was higher than in females (22.8% vs. 7.3%, P = 0.03). The liver samples classified as severe fibrosis, necroinflammatory activity and steatosis presented greater expression of HLA-E on Kupffer cells and hepatocytes. There was a positive linear association between HLA-E expression and severity of liver damage (P<0.05). In the multivariate analysis, the variables that significantly influenced the severity of the disease were HLA-E molecule expression in hepatocytes, advanced age and body mass index greater than 25. Fourteen different HLA-E haplotypes were identified, four of them not yet described in the literature. The frequency of the HLA-E * 01: 01: 01: 03 allele was lower in the group of patients than in the control group (P = 0.0001). The HLA-E * 01: 03: 05 allele was associated with increased likelihood (OR = 4.69) of HLA-E expression in the Kupffer cell (P = 0.046). The TT genotype of the +424 T / C polymorphism (rs1059510) was associated with a lower probability (OR = 0.06) of HLA-E expression in the Kupffer cell in relation to the absence of its expression (P = 0.009), was associated with a lower probability (OR=0,22) of moderate/severe necroinflammatory activity in relation to the mild inflammatory activity (P=0,047) and was associated with a lower probability (OR = 0.17) of moderate / severe hepatic fibrosis in relation to mild fibrosis (P = 0.049). The results of the present study suggest that the study for immunogenic factors such as HLA-E liver expression and the identification of certain polymorphisms and alleles of the HLA-E gene may have applicability in the clinical management of patients since it aids in discrimination of those at greatest risk of reaching advanced forms of chronic hepatitis C.

A infecção crônica pelo vírus da hepatite C (HCV) é importante fator de risco para o desenvolvimento de cirrose hepática e de carcinoma hepatocelular. A evolução para formas mais graves está relacionada a fatores ligados ao vírus, ao hospedeiro e à resposta imune. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre os polimorfismos do gene HLA-E, a expressão da molécula HLA-E e a gravidade da doença hepática pelo HCV. Foram incluídos 112 pacientes com hepatite C crônica e avaliados parâmetros clínicos, bioquímicos e histológicos (esteatose, atividade inflamatória e fibrose hepática). A variabilidade do gene HLA-E foi avaliada por sequenciamento de Sanger, e a expressão hepática da molécula, por imunoistoquímica. Para comparação da expressão hepática da molécula HLA-E e da variabilidade do gene HLA-E, foram usados dois grupos controles de indivíduos sem hepatopatia da mesma região geográfica. A imunoistoquímica para HLA-E identificou expressão da molécula nos hepatócitos e nas células de Kupffer. A expressão de HLAE em hepatócitos e células de Kupffer foi encontrada em 56,3% e 43,8% dos pacientes com HCV e em 20% e 10% nos controles (P = 0,008 e 0,02), respectivamente. Foi identificado que o percentual de pacientes do sexo masculino, com expressão moderada de HLA-E em células de Kupffer, foi maior em relação aos pacientes do sexo feminino (22,8% x 7,3%; P = 0,03). As amostras de fígado classificadas como esteatose, atividade necroinflamatória e fibrose graves apresentaram maior grau de expressão de HLA-E em células de Kupffer e hepatócitos, com associação linear significativa. Na análise multivariada, as variáveis que influenciaram significativamente a gravidade da doença foram a expressão da molécula HLA-E nos hepatócitos, a idade avançada e o índice de massa corporal maior que 25. Foram identificados 14 haplótipos diferentes do gene HLA-E, quatro deles ainda não descritos na literatura. A frequência do alelo HLA-E*01:01:01:03 foi menor no grupo de pacientes, quando comparada ao controle (P = 0,0001). O alelo HLA-E*01:03:05 associou-se a maior probabilidade (OR = 4,69) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer (P = 0,046). O genótipo TT do polimorfismo +424 T/C (rs1059510) associou-se a menor probabilidade (OR = 0,06) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer, em relação à ausência de expressão (P=0,009), a menor probabilidade (OR = 0,22) de atividade inflamatória moderada/grave em relação à leve (P = 0,047) e esteve associado a menor probabilidade (OR = 0,17) de fibrose hepática moderada/grave em relação à fibrose leve (P = 0,049). Os resultados do presente estudo sugerem que a pesquisa de fatores imunogenéticos, como a expressão hepática da molécula HLA-E e a identificação da variabilidade genética do HLA-E, pode ter aplicabilidade no manejo clínico dos pacientes, uma vez que auxilia na discriminação daqueles com maior risco de atingir formas avançadas da hepatite C crônica. / Chronic hepatitis C is an important risk factor for the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The severity of liver disease can be influenced by factors related to the virus, the host and the immune response. The aim of this study was to evaluate the association between HLA-E gene polymorphisms, HLA-E molecule expression and HCV liver disease severity. We included 112 patients with chronic hepatitis C and evaluated clinical, biochemical and histological parameters (steatosis, inflammatory activity and liver fibrosis). The variability of the HLA-E gene was assessed by Sanger sequencing and liver HLA-E expression by immunohistochemistry. Two control groups of individuals without hepatopathy from the same geographical region were used to compare the HLA-E expression and the gene variability. Immunohistochemistry for HLA-E showed positivity in hepatocyte and Kupffer cell. HLA-E positivity in hepatocytes and Kupffer cells were found in 56.3% and 43.8% of HCV patients and in 20% and 10% in the controls (P = 0.008 and 0.02), respectively. We found that the percentage of male patients with moderate HLA-E expression in Kupffer cells was higher than in females (22.8% vs. 7.3%, P = 0.03). The liver samples classified as severe fibrosis, necroinflammatory activity and steatosis presented greater expression of HLA-E on Kupffer cells and hepatocytes. There was a positive linear association between HLA-E expression and severity of liver damage (P<0.05). In the multivariate analysis, the variables that significantly influenced the severity of the disease were HLA-E molecule expression in hepatocytes, advanced age and body mass index greater than 25. Fourteen different HLA-E haplotypes were identified, four of them not yet described in the literature. The frequency of the HLA-E * 01: 01: 01: 03 allele was lower in the group of patients than in the control group (P = 0.0001). The HLA-E * 01: 03: 05 allele was associated with increased likelihood (OR = 4.69) of HLA-E expression in the Kupffer cell (P = 0.046). The TT genotype of the +424 T / C polymorphism (rs1059510) was associated with a lower probability (OR = 0.06) of HLA-E expression in the Kupffer cell in relation to the absence of its expression (P = 0.009), was associated with a lower probability (OR=0,22) of moderate/severe necroinflammatory activity in relation to the mild inflammatory activity (P=0,047) and was associated with a lower probability (OR = 0.17) of moderate / severe hepatic fibrosis in relation to mild fibrosis (P = 0.049). The results of the present study suggest that the study for immunogenic factors such as HLA-E liver expression and the identification of certain polymorphisms and alleles of the HLA-E gene may have applicability in the clinical management of patients since it aids in discrimination of those at greatest risk of reaching advanced forms of chronic hepatitis C.

INTRODUÇÃO: Pacientes com coinfecção HIV e hepatite C, em geral, apresentam rápida progressão da fibrose hepática. No entanto, a maior parte dos estudos, que avaliam essa questão, caracteriza a progressão da fibrose de forma indireta, utilizando para isso uma única biópsia hepática e tendo como base de cálculo o tempo estimado de infecção pelo vírus da hepatite C. OBJETIVO: Os objetivos do presente trabalho são: 1-Estimar a taxa de progressão da fibrose hepática de forma direta, através da análise de biópsias pareadas em pacientes coinfectados HIVhepatite C, não submetidos a tratamento prévio para hepatite C; 2- Avaliar a possível associação dessa progressão a determinadas variáveis clínicas. MÉTODOS: Trinta pacientes coinfectados com HIV e hepatite C, sem antecedente de tratamento prévio da hepatite C, submetidos a duas biópsias hepáticas pareadas foram avaliados. Calculou-se a taxa de progressão de fibrose direta e foram feitas determinações de progressão, estabilização e regressão da fibrose. Procedeu-se então à análise estatística, testando-se a associação entre progressão de fibrose e algumas variáveis clínicas e demográficas. RESULTADOS: A taxa de progressão média foi de 0,13 UF/ano, com 36,7% dos pacientes configurando-se como progressores. Em análise univariada, a progressão de fibrose hepática esteve associada a níveis de alanina aminotransferase (p<0,001) e aspartato aminotransferase (p<0,0340) acima de 3 vezes o limite superior da normalidade à época da primeira biópsia. Verificou-se também associação entre níveis de alanina aminotransferase (p=0,049) e aspartato aminotransferase (p=0,013) acima da normalidade e atividade necroinflamatória à primeira biópsia. CONCLUSÕES: Elevações de alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase parecem estar associadas a uma maior atividade necroinflamatória em pacientes co-infectados pelo HIV e hepatite C e também a uma progressão mais acelerada da fibrose hepática nesse grupo de pacientes / INTRODUCTION: HIV and hepatitis C virus co-infected patients usually exhibit rapid liver fibrosis progression. However, most studies evaluating this issue indirectly characterize fibrosis progression via single liver biopsy, further using this as basis for calculating the estimated duration of hepatitis C infection. OBJECTIVE: Objectives of this study include: 1- Estimate the annual rate of direct liver fibrosis progression, using analyses of paired biopsy samples from HIVhepatitis C co-infected patients without prior treatment for hepatitis C; 2- Assess the possible association of fibrosis progression with certain clinical variables. METHODS: We evaluated 30 HIV-hepatitis C co-infected patients, with no history of prior treatment for hepatitis C, who underwent two paired liver biopsies. We calculated the annual rate of direct fibrosis progression and determined fibrosis progression, stabilization, and regression. We then performed statistical analysis, testing the association between fibrosis progression and several clinical and demographic variables. RESULTS: The average annual progression rate was 0.13 FU/year, with 36.7% of patients defined as progressors. In univariate analysis, liver fibrosis progression was associated with alanine aminotransferase (p<0.001) and aspartate aminotransferase (p<0.0340) levels over three times the upper limit of normal present at first biopsy. There was also an association between above-normal alanine aminotransferase (p=0.049) and aspartate aminotransferase (p=0.013) levels and necroinflammatory activity at first biopsy. CONCLUSION: Elevated alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels appear to be associated with higher necroinflammatory activity and more accelerated liver fibrosis progression among HIV-hepatitis C co-infected patients

A Hepatite Autoimune (HAI) é uma doença inflamatória crônica oriunda de autoimunidade, ocasionando fibrose hepática. O objetivo desse estudo foi verificar possíveis inter-relações entre HLA-G, BAMBI e processos inflamatórios/fibrogênicos hepáticos na Hepatite Autoimune, tanto em biópsias de pacientes pré quanto póstratamento com imunossupressores. Foram selecionadas noventa e cinco biópsias de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto diagnosticados com HAI, associados ou não a depósitos de ferro no fígado. As biópsias foram submetidas à imuno-histoquímica para marcação das proteínas HLAG e BAMBI. As estatísticas foram determinadas pelos testes Mann-Whitney e correlação de Spearman. A expressão de HLA-G e de BAMBI se apresentou aumentados conforme o agravamento da inflamação e fibrose em pacientes pré- tratamento com boa ou má resposta ao tratamento. No entanto, a expressão de HLAG e de BAMBI foi reduzida nas biópsias pós-tratamento apenas nos pacientes bom respondedores (diminuição da fibrose). Não houve quaisquer relações entre as quantificações de HLA-G e BAMBI com o número de plasmócitos ou com depósitos de ferro no fígado tanto em pacientes pré quanto pós-tratamento. Os resultados sugerem que tanto HLA-G quanto BAMBI são imunorreguladores sensíveis à intensidade do processo inflamatório no fígado, tendo suas expressões aumentadas ou diminuídas de acordo com a demanda por substâncias que regulem compostos e células imunológicas na HAI. Sugerem também que o infiltrado plasmocitário não é regulado diretamente pelo HLA-G ou BAMBI, e que os depósitos de ferro no fígado não são capazes de influenciar nem o grau inflamatório, nem as expressões de HLAG e BAMBI. / Autoimmune Hepatitis (HAI) is a chronic inflammatory disease originating from autoimmunity, causing liver fibrosis. The objective of this study was to verify possible interrelations between HLA-G, BAMBI and inflammatory / fibrogenic hepatic processes in Autoimmune Hepatitis, both in pre and post-treatment immunosuppressive biopsies. Ninety-five biopsies of patients from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto diagnosed with HAI, associated or not with iron deposits in the liver, were selected. Biopsies were submitted to immunohistochemistry for the labeling of HLA-G and BAMBI proteins. The statistics were determined by the Mann-Whitney tests and Spearman\'s correlation. The expression of HLA-G and BAMBI was increased as worsening of inflammation and fibrosis in pre-treatment patients with good or poor response to treatment. However, the expression of HLA-G and BAMBI was reduced in post-treatment biopsies only in patients with good responders (decreased fibrosis). There were no relationships between the quantifications of HLA-G and BAMBI with the number of plasma cells or with liver iron deposits in both pre and post-treatment patients. The results suggest that both HLA-G and BAMBI are immunoregulators sensitive to the intensity of the inflammatory process in the liver, their expressions being increased or decreased according to the demand for substances that regulate immune cells and compounds in HAI. They also suggest that plasmacytic infiltrate is not directly regulated by HLA-G or BAMBI, and that the liver iron deposits are not capable of influencing either the inflammatory grade or the expressions of HLA-G and BAMBI.

Submitted by Cristiane Chim (cristiane.chim@ucpel.edu.br) on 2018-09-12T13:07:29Z No. of bitstreams: 1 Elza Cristina Miranda da Cunha.pdf: 2120613 bytes, checksum: 826a1788c1b8767323bb311695b02224 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-12T13:07:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elza Cristina Miranda da Cunha.pdf: 2120613 bytes, checksum: 826a1788c1b8767323bb311695b02224 (MD5) Previous issue date: 2018-03-26 / Chronic Hepatitis C (CHC) is a worrisome public health problem that can lead the infected patient to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Treatment of Hepatitis C virus (HCV) in Brazil in monoinfected patients is provided according to the degree of fibrosis and genotype of the virus. It is an expensive treatment and in some situations presents important side effects. The objective of this work is to evaluate the patients before and during treatment with Peginterferon and Ribavirin and is divided into three articles. The first article was a transversal study evaluated noninvasive tests (APRI, FIB-4 and GPR) in relation to liver biopsy to evaluate liver fibrosis according to the viral genotypes in 94 patients in the pre-treatment. The APRI concordance for liver biopsy for advanced fibrosis presented AUROC = 0.67 (95% CI 0.55-0.79). The GPR index represents an AUROC = 0.59 (95% CI 0.46-0.73) for advanced fibrosis, whereas the FIB-4 represents an AUROC = 0.69 (95% CI 0.58-0.80) for advanced fibrosis. No significant difference was found when compared the three tests used (p = 0.306). Moreover, when evaluated the tests in relation to the viral genotypes, we found only statistical difference for GPR (P = 0.006), with better accuracy for genotype 2-3. The second article was a Coorte Study evaluated in 136 patients the influence of sociodemographic factors on hematological parameters during the first 12 weeks of treatment. Men had higher hemoglobin levels along the treatment (p = 0.001), while older patients (p = 0.012) and non-Caucasians (p = 0.008) had lower values. Platelet levels decreased in the elderly (p = 0.007) and men (p = 0.001) along the treatment. In conclusion, social factors such as sex, age and ethnicity showed a greater impact on the hematological variables during CHC treatment. The third article was a Coorte study evaluated the association between major depression and depressive symptoms and the rs12979860 polymorphism (SNP) in the IL28B gene during the first 12 weeks of treatment in 90 patients. There was no statistically significant relationship with depression in the pre-treatment and during the treatment. However, regarding the symptoms, there was an association of the T-allele with risk for irritability (p = 0.021) and a trendy for loss of appetite (p=0.072) and agitation (p=0.060). / A Hepatite C crônica (HCC) é um preocupante problema de saúde pública, podendo levar o paciente infectado à cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. O tratamento do vírus da Hepatite C (HCV) no Brasil, em pacientes monoinfectados, é fornecido conforme o grau de fibrose e genótipo do virus. É um tratamento dispendioso e em algumas situações apresenta importantes paraefeitos. O presente trabalho avaliou pacientes infectados com HCV no pré e durante o tratamento com Peginterferon e Ribavirina e se divide em três partes, divididas por artigos. No primeiro artigo foi realizado em estudo transversal que avaliou testes não invasivos (APRI, FIB-4 e GPR) em relação à biópsia para avaliação de fibrose hepática avançada conforme os genótipos virais em 94 pacientes no pré-tratamento. A concordância do APRI em relação à biópsia hepática para fibrose avançada apresentou AUROC = 0,67 (IC 95% 0,55-0,79). O index GPR apresenta um AUROC = 0,59 (IC 95% 0,46-0,73) para fibrose avançada, enquanto a FIB-4 apresenta um AUROC = 0,69 (IC 95% 0,58-0,80) para fibrose avançada. Não houve diferença quando comparado os três métodos (p=0.306). Houve diferença entre os genótipos quando avaliado o GPR (p=0.006) com melhor acurácia relacionada ao genótipo 2 e 3. No segundo artigo foi realizado um estudo de coorte com 136 pacientes avaliando a influência de fatores sociodemograficos nos parâmetros hematológicos durante as primeiras 12 semanas de tratamento. Os homens apresentaram maiores valores de hemoglobina ao longo do tratamento (p = 0,001), enquanto os pacientes mais velhos (p = 0,012) e não caucasianos (p = 0,008) apresentam valores mais baixos. Os níveis de plaquetas reduziram nos pacientes idosos (p = 0,007) e homens (p = 0,001) ao longo do tratamento. Em conclusão, fatores sociais como sexo, idade e etnia, mostraram maior impacto nas variáveis hematológicas durante o tratamento da HCC. No terceiro artigo foi realizado um estudo de coorte que avaliou a associação entre a depressão maior e sintomas depressivos com o polimorfismo (SNP) rs12979860 no gene do IL28B durante as primeiras 12 semanas de tratamento em 90 pacientes. Não houve relação estatisticamente significativa com depressão no pré-tratamento, e ao longo do tratamento. Entretanto, em relação aos sintomas depressivos houve uma associação do alelo-T com maior risco de irritabilidade (p=0.021) e tendência para agitação (p=0.060) e perda do apetite (p=0.072).

A Hepatite Autoimune (HAI) é uma doença inflamatória crônica oriunda de autoimunidade, ocasionando fibrose hepática. O objetivo desse estudo foi verificar possíveis inter-relações entre HLA-G, BAMBI e processos inflamatórios/fibrogênicos hepáticos na Hepatite Autoimune, tanto em biópsias de pacientes pré quanto póstratamento com imunossupressores. Foram selecionadas noventa e cinco biópsias de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto diagnosticados com HAI, associados ou não a depósitos de ferro no fígado. As biópsias foram submetidas à imuno-histoquímica para marcação das proteínas HLAG e BAMBI. As estatísticas foram determinadas pelos testes Mann-Whitney e correlação de Spearman. A expressão de HLA-G e de BAMBI se apresentou aumentados conforme o agravamento da inflamação e fibrose em pacientes pré- tratamento com boa ou má resposta ao tratamento. No entanto, a expressão de HLAG e de BAMBI foi reduzida nas biópsias pós-tratamento apenas nos pacientes bom respondedores (diminuição da fibrose). Não houve quaisquer relações entre as quantificações de HLA-G e BAMBI com o número de plasmócitos ou com depósitos de ferro no fígado tanto em pacientes pré quanto pós-tratamento. Os resultados sugerem que tanto HLA-G quanto BAMBI são imunorreguladores sensíveis à intensidade do processo inflamatório no fígado, tendo suas expressões aumentadas ou diminuídas de acordo com a demanda por substâncias que regulem compostos e células imunológicas na HAI. Sugerem também que o infiltrado plasmocitário não é regulado diretamente pelo HLA-G ou BAMBI, e que os depósitos de ferro no fígado não são capazes de influenciar nem o grau inflamatório, nem as expressões de HLAG e BAMBI. / Autoimmune Hepatitis (HAI) is a chronic inflammatory disease originating from autoimmunity, causing liver fibrosis. The objective of this study was to verify possible interrelations between HLA-G, BAMBI and inflammatory / fibrogenic hepatic processes in Autoimmune Hepatitis, both in pre and post-treatment immunosuppressive biopsies. Ninety-five biopsies of patients from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto diagnosed with HAI, associated or not with iron deposits in the liver, were selected. Biopsies were submitted to immunohistochemistry for the labeling of HLA-G and BAMBI proteins. The statistics were determined by the Mann-Whitney tests and Spearman\'s correlation. The expression of HLA-G and BAMBI was increased as worsening of inflammation and fibrosis in pre-treatment patients with good or poor response to treatment. However, the expression of HLA-G and BAMBI was reduced in post-treatment biopsies only in patients with good responders (decreased fibrosis). There were no relationships between the quantifications of HLA-G and BAMBI with the number of plasma cells or with liver iron deposits in both pre and post-treatment patients. The results suggest that both HLA-G and BAMBI are immunoregulators sensitive to the intensity of the inflammatory process in the liver, their expressions being increased or decreased according to the demand for substances that regulate immune cells and compounds in HAI. They also suggest that plasmacytic infiltrate is not directly regulated by HLA-G or BAMBI, and that the liver iron deposits are not capable of influencing either the inflammatory grade or the expressions of HLA-G and BAMBI.

INTRODUÇÃO: Pacientes com coinfecção HIV e hepatite C, em geral, apresentam rápida progressão da fibrose hepática. No entanto, a maior parte dos estudos, que avaliam essa questão, caracteriza a progressão da fibrose de forma indireta, utilizando para isso uma única biópsia hepática e tendo como base de cálculo o tempo estimado de infecção pelo vírus da hepatite C. OBJETIVO: Os objetivos do presente trabalho são: 1-Estimar a taxa de progressão da fibrose hepática de forma direta, através da análise de biópsias pareadas em pacientes coinfectados HIVhepatite C, não submetidos a tratamento prévio para hepatite C; 2- Avaliar a possível associação dessa progressão a determinadas variáveis clínicas. MÉTODOS: Trinta pacientes coinfectados com HIV e hepatite C, sem antecedente de tratamento prévio da hepatite C, submetidos a duas biópsias hepáticas pareadas foram avaliados. Calculou-se a taxa de progressão de fibrose direta e foram feitas determinações de progressão, estabilização e regressão da fibrose. Procedeu-se então à análise estatística, testando-se a associação entre progressão de fibrose e algumas variáveis clínicas e demográficas. RESULTADOS: A taxa de progressão média foi de 0,13 UF/ano, com 36,7% dos pacientes configurando-se como progressores. Em análise univariada, a progressão de fibrose hepática esteve associada a níveis de alanina aminotransferase (p<0,001) e aspartato aminotransferase (p<0,0340) acima de 3 vezes o limite superior da normalidade à época da primeira biópsia. Verificou-se também associação entre níveis de alanina aminotransferase (p=0,049) e aspartato aminotransferase (p=0,013) acima da normalidade e atividade necroinflamatória à primeira biópsia. CONCLUSÕES: Elevações de alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase parecem estar associadas a uma maior atividade necroinflamatória em pacientes co-infectados pelo HIV e hepatite C e também a uma progressão mais acelerada da fibrose hepática nesse grupo de pacientes / INTRODUCTION: HIV and hepatitis C virus co-infected patients usually exhibit rapid liver fibrosis progression. However, most studies evaluating this issue indirectly characterize fibrosis progression via single liver biopsy, further using this as basis for calculating the estimated duration of hepatitis C infection. OBJECTIVE: Objectives of this study include: 1- Estimate the annual rate of direct liver fibrosis progression, using analyses of paired biopsy samples from HIVhepatitis C co-infected patients without prior treatment for hepatitis C; 2- Assess the possible association of fibrosis progression with certain clinical variables. METHODS: We evaluated 30 HIV-hepatitis C co-infected patients, with no history of prior treatment for hepatitis C, who underwent two paired liver biopsies. We calculated the annual rate of direct fibrosis progression and determined fibrosis progression, stabilization, and regression. We then performed statistical analysis, testing the association between fibrosis progression and several clinical and demographic variables. RESULTS: The average annual progression rate was 0.13 FU/year, with 36.7% of patients defined as progressors. In univariate analysis, liver fibrosis progression was associated with alanine aminotransferase (p<0.001) and aspartate aminotransferase (p<0.0340) levels over three times the upper limit of normal present at first biopsy. There was also an association between above-normal alanine aminotransferase (p=0.049) and aspartate aminotransferase (p=0.013) levels and necroinflammatory activity at first biopsy. CONCLUSION: Elevated alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels appear to be associated with higher necroinflammatory activity and more accelerated liver fibrosis progression among HIV-hepatitis C co-infected patients

A doença hepática crônica causada pelo vírus da hepatite C (HCV) tornou-se, nos últimos anos, uma das principais comorbidades dos pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) nos países desenvolvidos. Os pacientes coinfectados com HIV/HCV apresentam uma progressão mais rápida para a cirrose e as suas complicações que os pacientes monoinfectados com HCV. Embora os mecanismos responsáveis por esta evolução não estejam totalmente esclarecidos, a expressão da molécula de HLA-G, um HLA de classe Ib não clássico, que tem propriedades bem reconhecidas na regulação negativa da resposta imune, pode estar relacionada à progressão da doença hepática. Os objetivos deste trabalho foram analisar o perfil de expressão de HLA-G em tecido hepático de pacientes coinfectados HIV/HCV e identificar possíveis variáveis do hospedeiro, do HCV e do HIV que possam estar relacionadas com a expressão de HLA-G na biópsia hepática. Para isso, 57 amostras de biópsia hepática de pacientes coinfectados com HIV/HCV, nas quais a imuno-histoquímica para HLA-G foi realizada, foram analisadas retrospectivamente quanto à expressão desta molécula no tecido hepático. Avaliaram-se também outras características histopatológicas da biópsia como grau de fibrose, atividade inflamatória, deposição de ferro e gordura. Determinou-se o polimorfismo de inserção ou deleção de 14 pares de bases da região 3` não traduzida do exon 8 do gene do HLA-G, que está relacionada com a produção de RNA-mensageiro, em 43 destes pacientes, além do polimorfismo de IL-28B, relacionado com a resposta ao tratamento do HCV, em 44 deles. Características bioquímicas e virológicas, tanto do HIV quanto do HCV também foram avaliadas. O genótipo 1 do HCV foi o mais prevalente (87,75%), especialmente o subgenótipo 1a (60%). A expressão do HLA-G foi observada em 38 (66,7%) amostras de fígado, e foi mais frequente em estágios moderados e severos de fibrose do que em estágios mais leves (94,1% x 55%, P < 0,01). Não houve relação entre a expressão do HLA-G e os outros parâmetros estudados. Embora a progressão para a cirrose no contexto da coinfecção por HIV/ HCV seja um processo complexo, modulado por muitos factores, a associação da intensidade de fibrose com a expressão do HLA-G pode indicar que a expressão desta proteína desempenha um importante papel nos mecanismos que contribuem para a progressão da doença, por meio da regulação negativa da resposta imune contra o HCV na coinfecção pelo HIV. / Chronic liver disease induced by hepatitis C virus (HCV) infection has recently become one of the most common comorbidities in patients who are infected with the human immunodeficiency virus (HIV) in developed countries. HIV/HCV coinfected patients show faster progression to cirrhosis and its complications than the HCV monoinfected patients. Even though the responsible mechanisms for this evolution have not been entirely clarified yet, the expression of the HLA-G molecule, a HLA from the non-classic Ib class, with well-known properties of negatively regulating the immune response, may be related to the liver disease progression. The aims of the present work were to analyze the HLA-G expression profile in the liver micro ambience of HIV/HCV coinfected patients and to identify possible host factors, HIV or HCV, that may be related to the HLA-G expression on the liver biopsy. For this purpose, 57 liver biopsies of HIV/HCV coinfect patients, in which immunohistochemistry for HLA-G had been performed, were retrospectively analyzed according the HLA-G expression on the hepatic tissue. Other histopathological features in the liver biopsies, such as fibrosis degree, inflammatory activity, iron deposition and fat were also evaluated. The polymorphism of insertion or deletion in 14-base pairs of the 3`non-translated region of exon 8 of the HLA-G gene, which is related to the production of HLA-G messenger RNA, was evaluated in 43 of the patients. Also, the polymorphism of IL-28B, related to the response to HCV treatment, was evaluated in 44 of them. Biochemical and virological features of HIV and HCV were also evaluated. The HCV genotype 1 was the most prevalent (87.75%), especially the subgenotype 1a (60%). The expression of HLA-G was observed in 38 (66.7%) samples of the liver biopsies, and it was most frequent in moderate and severe stages of fibrosis than in the mild stages (94.1% x 55%, P < 0.01). There was no established relationship between HLA-G and other parameters studied. Although the progression to cirrhosis in the context of HIV/HCV coinfection is a complex process modulated by many factors, the association of HLA-G expression with the intensity of the liver fibrosis may indicate the protein expression play an important role in the mechanisms that contribute to the progression of the disease, through the negative regulation of the immune response against HCV setting of a coinfection with HIV.

Este trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para a diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais (CTM) em hepatócitos e a padronização de um modelo animal de fibrose hepática induzida por dimetilnitrosamina (DMN) para ensaios pré-clínicos de transplante de CTM. CTM isoladas de fontes variadas apresentaram morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico e o padrão de marcadores de superfície celular esperado na análise por citometria de fluxo. A capacidade de diferenciação osteogênica e adipogênica dessas células foi comprovada pelas colorações de vermelho de alizarina, oil red e azul de toluidina, respectivamente, confirmando, que as células isoladas para este estudo se comportaram como CTM conforme proposto pela Sociedade Internacional de Pesquisa em Células-tronco. A diferenciação hepática foi avaliada quanto à morfologia e capacidade das células diferenciadas de estocar glicogênio confirmada por PAS (ácido periódico-Schiff), de sintetizar albumina confirmada por imunofluorescência, além da capacidade de expressar genes hepato-específicos verificada por ensaios de PCR em tempo real. Com base na literatura para diferenciação hepática, diferentes protocolos de um, dois e três passos foram testados. CTM humanas mostraram capacidade de produzir e estocar glicogênio e de sintetizar albumina, apenas quando diferenciadas com protocolos de três etapas, porém sem uma expressão aumentada dos genes hepato-específicos albumina, &#945;-fetoproteína e c-Met. Uma etapa de diferenciação endodérmica, previamente aplicada à diferenciação hepática, aumentou a capacidade de produzir e estocar glicogênio das CTM diferenciadas. Para a padronização do modelo de fibrose hepática induzida por DMN, foram realizados experimentos de dose-resposta e foi verificado o efeito da hepatectomia em modelos mistos DMN/hepatectomia. A injúria hepática e o efeito do transplante de CTM foram avaliados por análise macroscópica dos fígados, histologia das biópsias de fígados corados com HE e tricromo de Masson e parâmetros bioquímicos séricos. Alterações macroscópicas, histológicas e nos níveis séricos de fosfatase alcalina indicam a indução da fibrose hepática nos ratos Wistar tratados com DMN na dose de 10 &#181;g/g de peso animal por três dias consecutivos durante quatro semanas, mas não observamos nenhum efeito induzido pela hepatectomia. Porém, este modelo com DMN se mostra semelhante a estágios iniciais de uma fibrose hepática. O transplante de 1 x 107 CTM de veia de cordão umbilical humano (VCUH) no modelo de injúria hepática induzida por DMN não resultou em melhora da fibrose, diminuição dos níveis séricos de fosfatase alcalina e nem em ganho de peso dos animais quando comparados aos animais tratados com PBSA após a injúria hepática (grupo placebo). Em conjunto, esses resultados sugerem que CTM humanas se diferenciam após tratamentos mais complexos, onde os indutores hepatogênicos são sequencialmente adicionados ao meio de modo a mimetizar a sinalização durante o desenvolvimento embrionário. O transplante de CTM de VCUH parece não ter efeito positivo em um modelo pré-clínico de injúria hepática similar a estágios iniciais de fibrose. Financiado por CNPq (573578/2008-7) e FAPESP (2007/54260-2). / This study aimed to develop an in vitro differentiation protocol of mesenchymal (MSC) stem cells to hepatocytes and to standardize an animal model for hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine (DMN) for preclinical transplant assays of MSC. MSC isolated from various sources presented fibroblastoid morphology, plastic adherence, and the expected pattern of cell surface markers by flow cytometry analysis. The capacity of osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation of these cells was confirmed by alizarin red, oil red and toluidine blue staining, respectively, confirming that the cells isolated for this study behave as MSC, as proposed by the International Society for Stem Cell Research. Hepatogenic differentiation was evaluated by analysis of cell morphology, capacity to store glycogen confirmed by PAS (periodic acid-Schiff), albumin synthesis confirmed by immunofluorescence, as well as hepatic-specific gene expression verified by real time PCR assays. Based on the published literature on hepatic differentiation, several protocols of one, two, and three steps were tested. Human MSC differentiated solely when treated in a three step-protocol, showing the ability to produce and store glycogen and synthesize albumin; however the expression of hepatic-specific genes such as albumin, &#945;-fetoprotein and c-Met was not increased. An endoderm differentiation stage, added to the hepatic differentiation protocol, increased the capacity to produce and store glycogen of differentiated MSC. In order to standardize the model of liver fibrosis induced by DMN, dose-response experiments were performed and the effect of hepatectomy in mixed models DMN/hepatectomy was observed. Severity of liver injury and the effect of cell transplantation were evaluated by macroscopic analysis of the livers, histology of liver biopsies stained with HE and Masson\'s trichrome, and evaluation of serum biochemical parameters. The macroscopic and histological observations, and altered alkaline phosphatase serum levels indicated the success in inducing liver fibrosis in DMN-treated rats at a dose of 10 &#181;g/g of animal weight for three consecutive days, during four weeks, without any additional effect upon hepatectomy. Transplanting 1 x 107 umbilical cord MSC in the model of liver injury induced by DMN did not result in improvement of the fibrosis, decrease of alkaline phosphatase serum levels, or in weight gain of the treated animals compared to animals treated with PBSA after liver injury (placebo group). Together, these results suggest that human MSC are capable of differentiating to hepatocyte-like cells after more complex protocols, where hepatogenic inducers are sequentially added to the medium in order to mimic signaling that occurs during fetal development. Transplantation of undifferentiated umbilical cord MSC did not have any positive effect in a preclinical liver injury model characterized by an early stage of fibrosis. Supported by CNPq (573578/2008-7) and FAPESP (2007/54260-2).

Introdução: A Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA) tem sido considerada atualmente a forma mais comum de doença hepática no mundo ocidental, relacionada principalmente ao aumento da prevalência da obesidade.A DHGNA abrange um largo espectro de doença, desde casos de esteatose simples (EH) até esteato-hepatite não alcoólica (EHNA) e fibrose, podendo evoluir para cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Embora se conheçam os fatores predisponentes para o desenvolvimento de EHNA, sua patogênese, assim como tratamento eficaz, permanecem pouco conhecidos.Os lípides, principalmente gorduras neutras, fosfolipídios e colesterol, são componentes fundamentais das células, assim como as proteínas e os hidratos de carbono. Embora aumentos marcantes de proteínas e hidratos de carbono não produzam quaisquer alterações macroscópicas no fígado, um acúmulo de gordura é prontamente reconhecido pela coloração amarelada e pelo aumento de volume do órgão. Várias dietas tem sido usadas em animais de laboratórios, principalmente camundongos e ratos no sentido de induzir esteatose, esteatohepatite e fibrose hepática, embora nenhuma delas consiga reproduzir na totalidade os componentes essenciais da doença humana. Não encontramos em nenhum trabalho da literatura a utilização da dieta deficiente em colina e hiperlipídica (DCH), por nós utilizada. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de uma dieta deficiente em colina e hiperlipídica (DCH) para desenvolver esteatose hepática, esteatohepatite e fibrose hepática no rato. Métodos: A doença hepática foi induzida em ratos Sprague-Dawley machos pesando de 300 a 350 gramas, hospedados em gaiolas padrão e recebendo água à vontade. Foi usado dieta deficiente em colina e hiperlipídica (DCH). Os animais foram distribuídos por meio de tabela sequencial randomizada em dois grupos. No grupo 1 dez ratos receberam a dieta por 4 meses e no grupo 2 dez ratos receberam a dieta durante 8 meses. Após o tempo estipulado das dietas os animais foram anestesiados e sacrificados. Os fígados dos animais foram retirados, pesados e enviados para estudo histopatológico de acordo com os critérios estabelecidos por Kleiner. Os animais foram pesados no início do experimento e por ocasião do sacrifício. Resultados: o peso dos animais do grupo 1 (DCH - 4 meses) no início do experimento variou de 305 a 350 gramas com média de 329,9 gramas e no fim do experimento de 529 a 615 gramas com média de 579,2 gramas. O percentual de ganho de peso dos animais variou de 60 a 86,93% com média de 75,72%. O peso dos animais do grupo 2 (DCH - 8 meses) no início do experimento variou de 320 a 353 gramas com média de 339,4 gramas e no fim do experimento variou de 661,5 a 783 gramas com média de 705,6 gramas. O percentual do ganho de peso dos animais variou de 95,58 a 123,71% com média de 107,78%. O peso do fígado dos animais do grupo 1 no fim do experimento variou de 24,5 a 29,5 gramas. O percentual do peso do fígado em relação ao peso dos animais do grupo 1 variou de 4,16 a 5,54% com média de 4,75%. O peso do fígado dos animais do grupo 2 no fim do experimento variou de 31 gramas a 39 gramas com média de 33,8 gramas. O percentual do peso do fígado em relação ao peso dos animais do grupo 2 variou de 4,63% a 5,07%, com média de 4,78%. A análise histopatológica dos animais do grupo 1 demonstrou intensa balonização e esteatose microgoticular com inflamação lobular; o estadiamento de fibrose foi discreto nestes animais. O estudo histopatológico dos animais do grupo 2 revelou intensa esteatose microgoticular e balonização com inflamação lobular; alguns animais apresentaram esteatose macrogoticular. Os animais deste grupo 2 apresentaram fibrose com grande variação individual. Os animais de ambos os grupos experimentais desenvolveram esteatohepatite, pois apresentaram o índice de atividade da doença hepática gordurosa não alcoólica (NAS)>=5. A análise comparativa demonstrou não haver diferença estatística no valor do NAS entre os dois grupos experimentais. Em relação ao estadiamento da fibrose na esteatohepatite não alcoólica, os animais do grupo 2 apresentaram uma tendência de escores mais elevados do que os animais do grupo 1. No entanto não houve diferença estatística entre os grupos devido a grande variação individual (p=0,2755). Conclusões: A dieta DCH administrada durante 4 e 8 meses induziu nos ratos aumento considerável de peso corpóreo e do peso do fígado. Os animais do grupo 1 apresentaram intensa balonização, esteatose microgoticular e inflamação lobular com discreta fibrose hepática. Os animais do grupo 2 apresentaram intensa balonização, esteatose macro e microgoticular, inflamação lobular e maior grau de fibrose hepática, bem estabelecida com formação de colágeno e expansão fibrosa nos espaços vasculares. A dieta deficiente em colina e hiperlipídica (DCH) induziu no rato esteatose hepática e esteatohepatite com fibrose, servindo de modelo experimental para proporcionar melhor entendimento para procedimentos terapêuticos futuros desta importante patologia do fígado. / Introduction: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) has currently been regarded as the most common form of liver disease in the western world, mainly related to the increased prevalence of obesity. NAFLD covers a broad spectrum of diseases, since cases of simple steatosis (HS) to steatohepatitis (EHNA) and fibrosis, and may evolve to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (CHC). Although the predisposing factors for the development of EHNA are well established, there is little knowledge on its pathogenesis as well as the effective treatment options. Lipids, especially phospholipids, neutral fats and cholesterol, are fundamental cell components, as well as proteins and carbohydrates. Although striking increases of proteins and carbohydrates do not produce liver macroscopic changes, fat build up can be rapidly recognized by the yellow coloring and increased organ volume. Many diets have been used in laboratory animals, mainly rats although none of them can fully reproduce the fundamental components of the human disease. We could not find in the literature any study on the use of choline-deficient and hiperlipidic diet (CHD), used in the present study. Goal: The objective of this study was to evaluate the effect of a cholinedeficient and hiperlipidic diet (CHD) on the development of steatosis, steatohepatitis and hepatic fibrosis in rats. Methods: The liver disease was induced in male Sprague-Dawley rats, weighing from 300 to 350 grams, hosted in standard cages and receiving water ad libitum and fed with a choline-deficient and hiperlipidic diet (CHD). The experimental animals were distributed by means of a random sequential table in two groups. In Group 1 ten rats received the diet for four months and in Group 2 ten rats received the same diet for eight months. After these predetermined feeding time periods the animals were anesthetized and sacrificed. The animal livers were then removed, weighed and sent to histopathological study according to the criteria established by Kleiner. All the animals were weighed at the beginning of the experiment and by the time of the sacrifice. Results: The weight of Group 1 animals (4 months CHD) at the beginning of the experiment varied from 305 to 350 grams with an average of 329.9 grams and at the end of the experiment from 529 to 615 grams averaging 579.2 grams. The percentage of weight gain in animals of this group ranged from 60% to 86.93% with an average of 75.72%. The weight of Group 2 animals (8 months CHD) at the start of the experiment varied from 320 to 353 grams with an average of 339.4 grams and at the end of the experiment from the 661.5 to 783 g with an average of 705.6 grams. The percentage of weight gain in animals of this group varied from 95.58% to 123.71%, averaging 107.78%. The liver weight of Group 1 animals at the end of the experiment varied from 24.5 to 29.5 grams. The percentage of liver weight in relation to the animals\' weight, in Group 1, ranged from 4.16% to 5.54%, with an average of 4.75%. The liver weight of Group 2 animals at the end of the experiment varied from 31gramas to 39 grams, with an average of 33.8 gram. The percentage of liver weight in relation to the animals\' weight, in Group 2, ranged from 4.63% to 5.07%, with an average of 4.78%. Liver histopathological analysis in Group 1 animals showed marked ballooning degeneration and microgoticular steatosis with lobular inflammation; fibrosis staging was discreet in these animals. Liver histopathological study in animals of Group 2 showed an intense microgoticular steatosis and ballooning with lobular inflammation; some animals of this group presented macrogoticular steatosis. The amount of hepatic fibrosis in animals of this group was extremely variable. Animals of both experimental groups developed steatohepatitis, as they presented the activity index of nonalcoholic fatty liver disease (NAS) >= 5. Statistical analysis did not show a significant difference between the NAS values of the two experimental groups. Fibrosis staging analysis in non-alcoholic steatohepatitis showed a trend toward higher scores in animals of Group 2 as compared to Group 1 animals. However there was no statistical difference between the groups due to a large individual variation (p = 0.2755). Conclusions: CHD diet administered for four and eight months induced considerable increases in the rats\' body weight and liver weight. Animals in Group 1 showed intense liver ballooning, steatosis and lobular inflammation with discrete microgoticular fibrosis. Animals in Group 2 presented intense ballooning, steatosis macro and microgoticular, lobular inflammation and a higher degree of well-established hepatic fibrosis, with collagen formation with fibrotic expansion in vascular spaces. Choline-deficient and hiperlipidic diet (CHD) in the rat induced hepatic steatosis and steatohepatitis with fibrosis, representing an experimental model, which can provide a better knowledge for future therapeutic procedures of this important liver pathology.