Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: No ciclo estral das vacas ocorre uma série de eventos que se repetem até o impedimento da luteólise, pela presença do embrião no útero, que provoca alterações no organismo materno de ordens hormonais, anatômicas e comportamentais. Apesar disso, a colheita de oócitos em vacas gestantes é uma alternativa para a produção in vitro de embriões. No entanto, em vista do perfil hormonal durante a gestação, os fatores envolvidos no desenvolvimento folicular podem ser comprometidos. Em vista disso, este estudo objetivou descrever o perfil proteico do líquido folicular de vacas gestantes. Foram colhidos ovários de 36 vacas gestantes em terço inicial de gestação. O líquido folicular foi puncionado e o diâmetro de cada folículo foi mensurado pela ultrassonografia, sendo classificados em três categorias ≤6,4mm, 6,5mm a 8,9mm e ≥9. Após duas centrifugações para remoção dos componentes celulares, as proteínas totais foram mensuradas e a eletroforese unidimensional realizada sob condições desnaturantes e redutoras. As bandas foram recortadas e a digestão in gel realizada objetivando a espectrometria de massas. A concentração de estrógeno e progesterona foi mensurada no líquido folicular para determinar a viabilidade dos folículos. Foram encontradas 46 bandas de proteínas na eletroforese em 67 amostras de líquido folicular. A média da concentração ± desvio padrão da progesterona foi de 71,32 ± 80,06 ng/mL e estrógeno de 27,57 ± 30,62 ng/mL, considerando todos os folículos. Hou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by FELIPE MORALES DALANEZI null (fmdalanezi@gmail.com) on 2016-03-01T17:52:28Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_EV_MIV_Felipe_Dalanezi.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-03-01T19:24:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dalanezi_fm_me_bot.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-01T19:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dalanezi_fm_me_bot.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Vários são os componentes que tem a capacidade de interferir no metabolismo e desenvolvimento do oócito no interior do folículos, dentre esses fatores estão As EVs. Sendo assim o objetivo deste estudo foi avaliar a modulação da maturação oocitária in vitro pelas EVs extraídos de vacas submetidas ao estresse térmico (ET) ou não. Para tanto 12 vacas da raça holandesa foram submetidas ao ET e 12 vacas foram mantidas em condições de termo-neutralidade, em seguida tiveram seus folículos aspirados em dois momentos do ciclo estral (pré-ovulação e desvio). Após a separação das EVs do fluido folicular, e visualizados pela microscopia eletrônica. Então As EVs foram colocados em meio de maturação para avaliação da ação destas vesículas durante a maturação oocitária. Após 22 horas de maturação, os oócitos e as células do cummulus foram recuperados para posterior análise de progressão da maturação e também para expressão de genes de interesse. Não foi observada diferença estatística entre os grupos na análise de progressão meiótica nem na integridade do DNA. Indicando que As EVs não interferiram na morfologia oocitária. A expressão gênica no entanto demonstrou que genes relacionados a expansão do cummulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), metabolismo energético (BMP15,CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 e 4) e apoptose (BCL2 e STAT3), apresentaram expressão diminuída no grupo termo-neutro. Os dados do nosso estudo indicam que o ambiente termo-neutro levou a uma sinalização intrafolicular das EVs com a finalidade de indicar uma situação favorável para o oócito. / There are several components that have the ability to interfere with the metabolism and development of the oocyte in side of follicles, among these factors are the EVs. Thus the aim of this study was to evaluate the modulation of oocyte maturation in vitro by EVs extracted from cows under heat stress or not. For that, 12 Holstein cows were subjected to heat stress and 12 cows were kept in a thermo-neutral conditions, then had their follicles aspirated in two stages of the estrous cycle (pre-ovulation and deviation). After separation of the EVs from follicular fluid, and visualized by electron microscopy. The EVs were placed in maturation medium for evaluation of the action of these vesicles during oocyte maturation. After 22 hours of maturation, oocytes and cummulus cells were recovered for further analysis of meiotic progression and for expression of genes of interest. There was no statistical difference between the groups in meiotic progression analysis or the DNA integrity. Indicating that the EVs not interfere in oocyte morphology. Gene expression however demonstrated that genes related to the expansion of the cumulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), energy metabolism (BMP15, CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 and 4) and apoptosis (BCL2 and STAT3) showed decreased expression the thermo-neutral group. The data from our study indicate that the thermo-neutral environment led to a intrafollicular signaling EVs in order to indicate a favorable situation for the oocyte.

Submitted by DIEGO SOUZA MOURA MOURA (diosmoura@yahoo.com.br) on 2016-12-09T13:03:07Z No. of bitstreams: 1 Diego Souza Moura Dissertação depois da defesa para arquivar on line.pdf: 16424035 bytes, checksum: fdfeaf59a20fcfe3cbd802420a342a7b (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-12-13T10:54:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 moura_ds_me_bot.pdf: 16424035 bytes, checksum: fdfeaf59a20fcfe3cbd802420a342a7b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T10:54:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 moura_ds_me_bot.pdf: 16424035 bytes, checksum: fdfeaf59a20fcfe3cbd802420a342a7b (MD5) Previous issue date: 2016-03-29 / No ciclo estral das vacas ocorre uma série de eventos que se repetem até o impedimento da luteólise, pela presença do embrião no útero, que provoca alterações no organismo materno de ordens hormonais, anatômicas e comportamentais. Apesar disso, a colheita de oócitos em vacas gestantes é uma alternativa para a produção in vitro de embriões. No entanto, em vista do perfil hormonal durante a gestação, os fatores envolvidos no desenvolvimento folicular podem ser comprometidos. Em vista disso, este estudo objetivou descrever o perfil proteico do líquido folicular de vacas gestantes. Foram colhidos ovários de 36 vacas gestantes em terço inicial de gestação. O líquido folicular foi puncionado e o diâmetro de cada folículo foi mensurado pela ultrassonografia, sendo classificados em três categorias ≤6,4mm, 6,5mm a 8,9mm e ≥9. Após duas centrifugações para remoção dos componentes celulares, as proteínas totais foram mensuradas e a eletroforese unidimensional realizada sob condições desnaturantes e redutoras. As bandas foram recortadas e a digestão in gel realizada objetivando a espectrometria de massas. A concentração de estrógeno e progesterona foi mensurada no líquido folicular para determinar a viabilidade dos folículos. Foram encontradas 46 bandas de proteínas na eletroforese em 67 amostras de líquido folicular. A média da concentração ± desvio padrão da progesterona foi de 71,32 ± 80,06 ng/mL e estrógeno de 27,57 ± 30,62 ng/mL, considerando todos os folículos. Houve expressão diferenciada de proteínas nas diferentes categorias de folículos. Na espectrometria de massas foram encontradas diversas proteínas, sendo as principais apolipoproteina, angiotensinogênio, heat shock protein, glutationa e suas isoformas. / Estorus cycle of cows has a series of events that are repeated until the luteolysis impediment, because the presence of embryo in the uterus, which causes hormonal, anatomical and behavioral orders, changes in the maternal organism. Nevertheless, the ovum pick-up in pregnant cows is an alternative to the in vitro production of embryos. However, in view of the hormonal profile during pregnancy, the factors involved in follicular development may be impaired. Thus, this study aimed to describe the protein profile of follicular fluid from pregnant cows. Ovaries were collected from 36 pregnant cows with gestational age 1-4 months. Follicular fluid was punctured and the diameter of each follicle was measured by ultrasonography, classified into three categories ≤6.4mm, 6.5 to 8.9 mm and ≥9. After two centrifugation to remove the cellular components, total protein were measurement and unidimensional electrophoresis was performed under denaturing and reducing conditions. The bands were cut and digestion in gel was carried out aiming to mass spectrometry. The concentration of estrogen and progesterone in follicular fluid was measured to determine the viability of follicles. We found 46 protein bands in electrophoresis in 67 follicular fluid samples. The mean ± standard deviation of progesterone concentration was 71.32 ± 80.06 considering all follicles. There was differential expression of proteins in different categories of follicles. In mass spectrometry were found many proteins, being main apolipoprotein, angiotensinogen, heat shock protein, glutathione and their isoforms.

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: Vários são os componentes que tem a capacidade de interferir no metabolismo e desenvolvimento do oócito no interior do folículos, dentre esses fatores estão As EVs. Sendo assim o objetivo deste estudo foi avaliar a modulação da maturação oocitária in vitro pelas EVs extraídos de vacas submetidas ao estresse térmico (ET) ou não. Para tanto 12 vacas da raça holandesa foram submetidas ao ET e 12 vacas foram mantidas em condições de termo-neutralidade, em seguida tiveram seus folículos aspirados em dois momentos do ciclo estral (pré-ovulação e desvio). Após a separação das EVs do fluido folicular, e visualizados pela microscopia eletrônica. Então As EVs foram colocados em meio de maturação para avaliação da ação destas vesículas durante a maturação oocitária. Após 22 horas de maturação, os oócitos e as células do cummulus foram recuperados para posterior análise de progressão da maturação e também para expressão de genes de interesse. Não foi observada diferença estatística entre os grupos na análise de progressão meiótica nem na integridade do DNA. Indicando que As EVs não interferiram na morfologia oocitária. A expressão gênica no entanto demonstrou que genes relacionados a expansão do cummulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), metabolismo energético (BMP15,CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 e 4) e apoptose (BCL2 e STAT3), apresentaram expressão diminuída no grupo termo-neutro. Os dados do nosso estudo indicam que o ambiente termo-neutro levou a uma sinalização intrafolicular das EVs com a fin... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There are several components that have the ability to interfere with the metabolism and development of the oocyte in side of follicles, among these factors are the EVs. Thus the aim of this study was to evaluate the modulation of oocyte maturation in vitro by EVs extracted from cows under heat stress or not. For that, 12 Holstein cows were subjected to heat stress and 12 cows were kept in a thermo-neutral conditions, then had their follicles aspirated in two stages of the estrous cycle (pre-ovulation and deviation). After separation of the EVs from follicular fluid, and visualized by electron microscopy. The EVs were placed in maturation medium for evaluation of the action of these vesicles during oocyte maturation. After 22 hours of maturation, oocytes and cummulus cells were recovered for further analysis of meiotic progression and for expression of genes of interest. There was no statistical difference between the groups in meiotic progression analysis or the DNA integrity. Indicating that the EVs not interfere in oocyte morphology. Gene expression however demonstrated that genes related to the expansion of the cumulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), energy metabolism (BMP15, CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 and 4) and apoptosis (BCL2 and STAT3) showed decreased expression the thermo-neutral group. The data from our study indicate that the thermo-neutral environment led to a intrafollicular signaling EVs in order to indicate a favorable situation for the oocyte. / Mestre

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 425505 bytes, checksum: c9e905b211c38a1ec8e1bb112c85e570 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study was aimed to investigate the effects that different protocols for induction and synchronization of estrus and ovulation, with the use of eCG, BE, CE or GnRH associated with progestin could have on the follicle growth and pre-ovulatory follicle diameter. Furthermore the relationship with progesterone, LH, insulin, cortisol in the follicular fluid concentration and progesterone, cortisol, insulin serum concentrations of cows submitted to protocols. Ninety Nelore suckled cows were divided into six groups, 15 cows per protocol. The protocols consisted in the placement and removal of an intravaginal progesterone device (IPD) (0.75g of progesterone) in the first and eighth day respectively; application of prostaglandin (PGF2 &#61537;) on the eighth day, and except in protocol 1 was used estradiol benzoate (EB) on day 1. The other differences in the delineation of protocols were: Protocol 1 day 1 and day 8 (GnRH); Protocol 2 day 6 (PGF2 &#61537;), day 8 (PGF2 &#61537; + estradiol cypionate (EC)); Protocol 3 day 8 (eCG + EC); Protocol 4 day 8 (eCG + EB); Protocol 5 day 8 (eCG), day 9 (EB); Protocol 6 day 9 (EB). Overall 93.3% (84/90) of cows responded to synchronization protocol. However, it was observed that 28.9% of cows (26/90) did not have a synchronization of a new follicular wave, checked by the number of cows which have not developed a dominant follicle (5/26), cows with early ovulation (15/26) and cows that had a dominant follicle in regression process (6/26). There was no statistical difference in growth and diameter of the pre-ovulatory follicle between protocols. Progesterona, LH, insulina, cortisol concentrations on follicular fluid, as well as in cortisol and insulin serum concentration did nor differ with the protocols used. Although, in protocol 2, lower progesterone concentrations (P<0.05) were observed in the withdrawal of IPD. Twenty seven oocytes were recovered, which were classified according to quality: 1 (n=12), 2 (n=6), 3 (n=7) e 4 (n=2). The antecipation in the prostaglandin application in two days from IPD withdrawal result in lower progesterone concentrations. / O objetivo desse estudo foi verificar os efeitos que diferentes protocolos de indução e sincronização do estro e da ovulação, com utilização de eCG, BE, CE ou GnRH associados a um progestágeno, podem ter sobre o crescimento e diâmetro do folículo pré-ovulatório, e suas relações com a concentração, no fluido folicular, de progesterona, LH, insulina e cortisol, e com a concentração sérica de progesterona, cortisol e insulina das vacas submetidas aos protocolos. Foram utilizadas 90 vacas Nelore solteiras, com mais de nove meses pós-parto, divididas em seis protocolos, sendo 15 vacas por protocolo. Todos os protocolos consistiam na colocação e retirada de um dispositivo intravaginal de progesterona (DIP) (0,75 gramas de progesterona) no primeiro e no oitavo dia, respectivamente; aplicação de prostaglandina (PGF2&#61537;) no oitavo dia; e exceto no protocolo 1, foi utilizado benzoato de estradiol (BE) no dia 1. As outras diferenças no esquema dos protocolos foram: protocolo 1 dia 1 e dia 8 (GnRH); protocolo 2 Dia 6 (PGF2&#61537;), dia 8 (PGF2&#61537;&#61472;&#61483;&#61472;cipionato de estradiol (CE)); protocolo 3 dia 8 (eCG + CE); protocolo 4 dia 8 (eCG + BE); protocolo 5 dia 8 (eCG), dia 9 (BE); protocolo 6 dia 9 (BE). Em geral, 93,3 % (84/90) de vacas responderam ao protocolo de sincronização. Entretanto, foi observado que 28,9 % das vacas (26/90) não apresentaram sincronização eficiente de uma nova onda folicular, constatado pelo número de vacas que não desenvolveram folículo dominante (5/26), as vacas que ovularam precocemente (15/26), e as vacas que tiveram um folículo dominante que estava em processo de regressão (6/26). Não houve diferença estatística no crescimento e diâmetro do folículo pré-ovulatório entre os protocolos. Não houve efeito, entre os protocolos, na concentração no fluido folicular de progesterona, LH, insulina, cortisol, bem como na concentração sérica de cortisol e insulina. Contudo, no protocolo 2, foi verificada menor concentração sérica (P < 0,05) de progesterona na retirada do DIP. Foram recuperados 27 ovócitos, que foram classificados de acordo com a qualidade em 1 (n=12), 2 (n=6), 3 (n=7) e 4 (n=2). A antecipação na aplicação de vprostaglandina, em dois dias da retirada do DIP, resulta em menor concentração de progesterona circulante.