Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Abstract: Biofilmes formados por Candida estão relacionados a infecções bucais, como a candidíase. Embora a resistência do biofilme seja multifatorial, a proteção exercida por sua matriz extracelular (MEC) é importante para os altos níveis de resistência a drogas antifúngicas. O conhecimento dos princípios estruturais da MEC possibilita maior compreensão de como atuar para desorganizá-la e melhorar a difusão de agentes antifúngicos para que atinjam mais eficientemente o biofilme, além de, futuramente, possibilitar o desenvolvimento de terapias mais eficazes para o controle da formação de biofilmes. Sendo assim, os objetivos principais deste estudo foram: (1) verificar a influência da inativação de genes envolvidos na filamentação (EFG1 e TEC1) em características estruturais dos biofilmes e na produção de componentes da MEC; (2) verificar a influência do fluconazol (FLZ) na MEC de biofilmes de Candida albicans ATCC 90028 (susceptível a fluconazol- CaS), C. albicans ATCC 96901 (resistente a fluconazol- CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (susceptível a fluconazol- CgS) e C. glabrata ATCC 200918 (resistente a fluconazol- CgR) e (3) estudar a ação de enzimas hidrolíticas (DNase, Dextranase e β-glucanase individualmente ou em diferentes combinações) sobre a MEC de biofilmes de CaS e CaR. Biofilmes maduros (48 horas) foram analisados através de contagem de unidades formadoras de colônia (ufc/mL), peso seco total, peso seco insolúvel e proteínas insolúveis. Os componentes da MEC- polissacarídeos... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Biofilms formed by Candida are related to bucal infections, such as candidiasis. Although the biofilm resistance is multifactorial, the protection exerted by its extracellular matrix (ECM) is essential for its high levels of resistance to antifungals. The knowledge of the structural principles of the ECM permits a better understanding of how to disorganize the ECM and improve the diffusion of antifungal drugs to reach the biofilm. Moreover, the study of the ECM may enable the development of more effective therapies to control biofilm formation. Thus, the main objectives of this study were: (1) to verify the influence of the inactivation of genes involved in filamentation and structural characteristics of the biofilms (EFG1 and TEC1) on the production of ECM components; (2) to verify the influence of fluconazole (FLZ) on the biofilms' ECM of Candida albicans ATCC 90028 (fluconazole-susceptible: CaS), C. albicans ATCC 96901 (fluconazole-resistant: CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (fluconazolesusceptible: CgS) and C. glabrata ATCC 200918 (fluconazole-resistant: CgR) and (3) to study the action of hydrolytic enzymes (DNase, Dextranase and β-glucanase individually or in different combinations) on the ECM of CaS and CaR biofilms. Mature biofilms (48 hours) were analyzed by colony counting forming units (cfu/mL), total dry weight, insoluble dry-weight and total proteins. ECM components- alkali-soluble polysaccharides (ASPs), water-soluble polysaccharides (WSPs), extracellular DNA (e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Philosophiae Doctor - PhD / One of the most common HIV-associated opportunistic infections is candidiasis, caused by Candida albicans or other Candida species. In immune suppressed subjects, this commensal organism can cause an increase in patient morbidity and mortality due to oropharyngeal or systemic dissemination. Limited information exists on the prevalence and antifungal susceptibility of Candida species in the African continent, the most HIV-affected region globally and home to new and emerging drug resistant Candida species. The mechanisms of Candida drug resistance in the African continent have also not been described. In this study, 255 Candida species isolated from the oral mucosa of HIV-positive South African and Cameroonian patients were identified using differential and chromogenic media and their drug susceptibility profiles tested using the disk diffusion method and the TREK Sensititre system, an automated broth microdilution method. Candida cell wall fractions were run on SDSPAGE and HPLC-MS with the aim of identifying peptides specifically expressed by antifungal drug resistant isolates. Comparisons between the two groups of isolates revealed differences in Candida species prevalence and drug susceptibility with interesting associations observed between specific drug resistance and duration of ARV therapy. This study showed that fluconazole, the drug of choice for the treatment of candidiasis in the African continent, is not an effective therapy for most cases of Candida infection, and suggests that regional surveillance be implemented in the continent. A multiple-drug resistant Candida strain was identified in this study, a finding that has not previously been documented. The use of proteomics tools allowed for the identification of peptides involved in drug resistance and the elucidation of Candida colonization mechanisms in HIV-infected African patients.

A Criptococose é uma enfermidade micótica sistêmica, subaguda ou crônica, que acomete a cavidade nasal, tecidos paranasais e pulmões do homem, animais domésticos e silvestres, podendo disseminar-se para o sistema nervoso central, olhos, pele e outros órgãos. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose em pequenos animais, incluindo toxicidade, desenvolvimento de resistência aos antifúngicos tradicionalmente utilizados e longos períodos de tratamento da enfermidade, o estudo objetivou avaliar a eficácia do imunomodulador ß (1-3) glucana isoladamente e em associação ao fluconazol no tratamento da criptococose experimental. Foram utilizados 100 camundongos (Mus musculus), cepa UFPel, albinos, os quais foram divididos em cinco grupos de 20 animais. O tratamento dos animais com criptococose experimental foi iniciado sete dias após a inoculação. O grupo Controle (G1) foi tratado com 0,1 ml de água destilada estéril, o grupo Fluconazol (G2) com 5 mg/kg de fluconazol, o grupo Fluconazol associado a ß (1-3) glucana (G3) com 5 mg/kg de fluconazol associado a 0,5 mg de ß (1-3) glucana, o grupo Glucana dose I (G4) com 0,5 mg de ß (1-3) glucana e o grupo Glucana dose II (G5) recebeu 0,25 mg de ß (1-3) glucana. Após acompanhamento clínico durante as seis semanas de tratamento os animais foram eutanasiados e necropsiados para avaliação anatomopatológica dos órgãos, quantificação das unidades formadoras de colônias fúngicas (UFCs), retroisolamento e avaliação histopatológica. Nas avaliações clínicas o G3 foi sempre superior ao G1 e G2, sendo que na última avaliação clínica individual, os animais pertencentes ao G3 não apresentavam nenhum sintoma clínico. O G2 teve um menor número de órgãos afetados e de alterações macroscópicas, seguido pelo G3, sendo que no primeiro não foram observadas lesões em órgãos-alvo, como pulmão e cérebro. O grupo com maior número de lesões e órgãos afetados foi o G1. Nos parâmetros retroisolamento e UFCs, o G3 foi superior aos outros tratamentos, seguido pelo G2, sendo que o pior grupo, ou seja, aquele que teve um maior número de isolamentos e maior quantificação de UFCs foi o G1. Conforme os resultados obtidos os tratamentos G2 e G3 foram os mais eficazes para a remissão da criptococose experimental, no entanto, G3 apresentou uma superioridade na maioria dos parâmetros avaliados. Portanto, de acordo com os resultados obtidos, a associação de fluconazol ao imunomodulador ß (1-3) glucana pode ser uma alternativa benéfica em considerável quantidade de pacientes com criptococose. / Cryptococcosis is a systematic sub acute or chronic mycotic condition that affects the nasal cavity, paranasal tissues and the lungs of humans, as well as domestic and wild animals, which can spread to the central nervous system, skin, and other organs. Considering the therapeutic difficulties in treating this mycosis in small animals, which include toxicity, resistance towards traditionally used antifungals, and the extended treatment of this condition, this study aimed to evaluate the ß (1-3) glucan immunomodulator efficacy when used both alone and in association with fluconazole in the treatment of experimental cryptococcosis. One Hundred albino UFPel strain mice (Mus musculus), divided into five groups of 20 animals each, were used. The treatment of these animals with experimental cryptococcosis was started seven days following inoculation. The control group (G1) was treated with 0,1 ml sterile distilled water. The fluconazole group (G2) was treated with 5 mg/kg fluconazole; the fluconazole associated with ß glucan (1-3) group (G3) was treated with 5 mg/kg fluconazole associated with 0,5 mg ß (1-3) glucan ; the group glucan dose I (G4) was treated with 0,5 mg ß (1-3) glucan, and the group glucan dose II (G5) was administered 0,25 mg ß (1-3) glucan. After the six-week treatment clinical follow-up, the aimals were euthanized and necropsied for anatomopathological evaluation of organs, quantification of fungal colony-forming units (FCUs), retro isolation and histopathological evaluation. In clinical evaluations, G3 was always superior to G1 and G2, and in the last individual clinical evaluation, G3 animals did not show any clinical symptoms. G2 had a smaller number of affected organs and microscopic alterations, followed by G3. In G2, target organ lesions, such as those in the lungs and brain, were not found. Considering retro isolation and FCU parameters, G3 was superior to other treatments, followed by G2; the worst group, that is, the one with the highest isolation occurrence and greatest FCU quantification, was G1. According to the results obtained, treatments G2 and G3 were the most efficient in experimental cryptococcosis remission; however, G3 was superior in most parameters evaluated. Therefore, according to the results obtained, the association of fluconazole with the ß (1-3) glucan immunomodulator can be a beneficial alternative to a considerable number of cryptococcosis-bearing patients.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-01-21Bitstream added on 2014-06-13T19:32:33Z : No. of bitstreams: 1 correa_jcr_me_arafcf.pdf: 630725 bytes, checksum: 5a65d5833cac2449eb1b9928587306b1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O antifúngico fluconazol é um fármaco sintético, desenvolvido na década de 1980, e o primeiro a integrar a classe dos triazóis. Este trabalho teve como objetivo desenvolver métodos analíticos seletivos e indicativos de estabilidade para fluconazol na forma de cápsulas, incluindo métodos físico-químicos e microbiológicos, realizar estudos de dissolução e de estabilidade. Os métodos de análise quantitativos empregados e validados foram: (i) espectrofotometria derivada de primeira ordem no UV a 268 nm, na faixa de concentração de 150–350 μg/mL, o teor médio nas cápsulas encontrado foi de 96,42 %; (ii) CLAE, coluna de C18 e fase móvel composta por metanol:água (60:40, V/V), o teor médio obtido foi de 97,35 %; (iii) determinação da potência microbiológica, pelo método de difusão em ágar cilindros em placa, utilizando cepas de /Candida albicans/, em que a atividade média do fluconazol em cápsulas foi 88,96%. Todos esses métodos foram validados e apresentaram ótima seletividade, precisão e exatidão. O método por CLAE é capaz de separar o fármaco de seu produto de degradação. O teste de dissolução foi desenvolvido e validado utilizando HCl 0,1 /M/ como meio de dissolução e cesto a 75 rpm. O perfil de dissolução obtido é discriminativo e apresenta ótima precisão e exatidão. O estudo de estresse do fluconazol frente à degradação ácida, alcalina, oxidativa, térmica, fotolítica e em câmara climática (40 ºC/75%) mostrou a oxidação como fator importante, sendo a única condição a apresentar produto de degradação. O decaimento do teor do fármaco em amostras sob estudo de estabilidade conduzido em estufa, câmara climática e luz-UVC, foi determinado por CLAE e por ensaio microbiológico. Os resultados foram muito discrepantes, em que o teor da substância ativa se manteve acima de 90%, mas sua atividade apresentou decaimento significativo... / The antifungal agent fluconazole is a synthetic drug, developed in the 1980s, and first joined the class of triazoles. This study aimed to develop selective analytical methods and stability indicated method for fluconazole in capsules, including physical-chemical, microbiological, dissolution and stability studies. The methods of quantitative analysis employed and validated were: (i) first order derivative spectrophotometry in the UV at 268 nm in the concentration range of 150 - 350μg/mL. The average level found in the capsules was 96.42% (ii ) HPLC, C18 column and mobile phase consisting of methanol: water (60:40, V / V), the mean level obtained was 97.35%, (iii) determining the potency microbiological diffusion method in agar cylinders plate, using strains of Candida albicans ATCC 90028, where the average activity of fluconazole capsules was 88.96%. All these methods were validated and showed good selectivity, precision and accuracy. The HPLC method is able to separate the drug from its degradation product. The dissolution test was developed and validated using 900 mL of 0.1 M HCl as dissolution medium and basket at 75 rpm. The dissolution profile obtained is discriminatory and it has highly precise and accurate. The stress study of fluconazole against the degradation acid, alkaline, oxidative, thermal, photolytic and climate chamber (40 ° C/75%) showed the oxidation as an important factor, being the only condition to show a degradation product. The decrease of the drug in samples submitted to preliminary stability (conducted in stove, climate chamber and UVC-light) was determined by HPLC and microbiological assay. The results were very inconsistent in which the concentration of the drug remained above 90% but its activity had significant decrease showing approximately 30% activity. Fluconazole is an unstable drug and changes in its molecule lead to increased absorption of UV radiation... (Complete abstract click electronic access below)

A Criptococose é uma enfermidade micótica sistêmica, subaguda ou crônica, que acomete a cavidade nasal, tecidos paranasais e pulmões do homem, animais domésticos e silvestres, podendo disseminar-se para o sistema nervoso central, olhos, pele e outros órgãos. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose em pequenos animais, incluindo toxicidade, desenvolvimento de resistência aos antifúngicos tradicionalmente utilizados e longos períodos de tratamento da enfermidade, o estudo objetivou avaliar a eficácia do imunomodulador ß (1-3) glucana isoladamente e em associação ao fluconazol no tratamento da criptococose experimental. Foram utilizados 100 camundongos (Mus musculus), cepa UFPel, albinos, os quais foram divididos em cinco grupos de 20 animais. O tratamento dos animais com criptococose experimental foi iniciado sete dias após a inoculação. O grupo Controle (G1) foi tratado com 0,1 ml de água destilada estéril, o grupo Fluconazol (G2) com 5 mg/kg de fluconazol, o grupo Fluconazol associado a ß (1-3) glucana (G3) com 5 mg/kg de fluconazol associado a 0,5 mg de ß (1-3) glucana, o grupo Glucana dose I (G4) com 0,5 mg de ß (1-3) glucana e o grupo Glucana dose II (G5) recebeu 0,25 mg de ß (1-3) glucana. Após acompanhamento clínico durante as seis semanas de tratamento os animais foram eutanasiados e necropsiados para avaliação anatomopatológica dos órgãos, quantificação das unidades formadoras de colônias fúngicas (UFCs), retroisolamento e avaliação histopatológica. Nas avaliações clínicas o G3 foi sempre superior ao G1 e G2, sendo que na última avaliação clínica individual, os animais pertencentes ao G3 não apresentavam nenhum sintoma clínico. O G2 teve um menor número de órgãos afetados e de alterações macroscópicas, seguido pelo G3, sendo que no primeiro não foram observadas lesões em órgãos-alvo, como pulmão e cérebro. O grupo com maior número de lesões e órgãos afetados foi o G1. Nos parâmetros retroisolamento e UFCs, o G3 foi superior aos outros tratamentos, seguido pelo G2, sendo que o pior grupo, ou seja, aquele que teve um maior número de isolamentos e maior quantificação de UFCs foi o G1. Conforme os resultados obtidos os tratamentos G2 e G3 foram os mais eficazes para a remissão da criptococose experimental, no entanto, G3 apresentou uma superioridade na maioria dos parâmetros avaliados. Portanto, de acordo com os resultados obtidos, a associação de fluconazol ao imunomodulador ß (1-3) glucana pode ser uma alternativa benéfica em considerável quantidade de pacientes com criptococose. / Cryptococcosis is a systematic sub acute or chronic mycotic condition that affects the nasal cavity, paranasal tissues and the lungs of humans, as well as domestic and wild animals, which can spread to the central nervous system, skin, and other organs. Considering the therapeutic difficulties in treating this mycosis in small animals, which include toxicity, resistance towards traditionally used antifungals, and the extended treatment of this condition, this study aimed to evaluate the ß (1-3) glucan immunomodulator efficacy when used both alone and in association with fluconazole in the treatment of experimental cryptococcosis. One Hundred albino UFPel strain mice (Mus musculus), divided into five groups of 20 animals each, were used. The treatment of these animals with experimental cryptococcosis was started seven days following inoculation. The control group (G1) was treated with 0,1 ml sterile distilled water. The fluconazole group (G2) was treated with 5 mg/kg fluconazole; the fluconazole associated with ß glucan (1-3) group (G3) was treated with 5 mg/kg fluconazole associated with 0,5 mg ß (1-3) glucan ; the group glucan dose I (G4) was treated with 0,5 mg ß (1-3) glucan, and the group glucan dose II (G5) was administered 0,25 mg ß (1-3) glucan. After the six-week treatment clinical follow-up, the aimals were euthanized and necropsied for anatomopathological evaluation of organs, quantification of fungal colony-forming units (FCUs), retro isolation and histopathological evaluation. In clinical evaluations, G3 was always superior to G1 and G2, and in the last individual clinical evaluation, G3 animals did not show any clinical symptoms. G2 had a smaller number of affected organs and microscopic alterations, followed by G3. In G2, target organ lesions, such as those in the lungs and brain, were not found. Considering retro isolation and FCU parameters, G3 was superior to other treatments, followed by G2; the worst group, that is, the one with the highest isolation occurrence and greatest FCU quantification, was G1. According to the results obtained, treatments G2 and G3 were the most efficient in experimental cryptococcosis remission; however, G3 was superior in most parameters evaluated. Therefore, according to the results obtained, the association of fluconazole with the ß (1-3) glucan immunomodulator can be a beneficial alternative to a considerable number of cryptococcosis-bearing patients.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the last decades the invasive mycoses caused by opportunistic fungi has showed a significant growth. The extensive use of azoles showed that the development of resistance of Candida species to these drugs is an emergent phenomenon. C. glabrata typically presents high degree of primary resistance to fluconazole what determine additional difficulties in the therapies. Here two groups of C. glabrata isolates were evaluated: the first formed by strains primarily fluconazole-susceptible and the second generated by the first, was composed by the same isolates after induction of the fluconazole-resistance. The susceptibility tests detected even in the first group, strains azole-resistant as against itraconazole and voriconazole. The induction of resistance to fluconazole was carried out in order to compare the susceptibilities between the two groups against combined drugs. The fluconazole-resistant strains (Group 2) showed MIC ≥ 64 μg/ml and cross-resistance was either detected with fluconazole, voriconazole and itraconazole as well as to other antifungal agents as amphotericin B and caspofungine. The more frequent interaction observed was indifference, however important synergisms were showed against fluconazole-resistant isolates. The best synergism was registered with amphotericin B+ flucytosine (G1 = 61,77% and G2=76,47%). Other synergistic interactions were amphotericin B+ketoconazole (G2=73,53%), amphotericin B+voriconazole (G2=55,88%), amphotericin B+voricoonazole (G2=55,88%), all of them without antagonisms. The highest percentage of the antagonism were observed with ketoconazole+flucytosine (G1=61,77% and G2= 55,88%). / A freqüência de micoses invasivas devido a fungos oportunistas tem evidenciado significativo aumento nas duas últimas décadas. O uso prolongado e indiscriminado dos azólicos evidenciou o desenvolvimento de resistência a estes fármacos nas espécies de Candida. A espécie C. glabrata caracteriza-se por elevados percentuais de resistência primária ao fluconazol fato que determina dificuldades terapêuticas adicionais. No presente estudo, dois grupos de isolados de C. glabrata foram avaliados: o primeiro formado por isolados clínicos sensíveis ao fluconazol, e o segundo, derivado do primeiro, foi formado pelos mesmos isolados, após terem sido induzidos a resistência ao fluconazol in vitro. Mesmo neste grupo de C. glabrata sensíveis ao fluconazol, os testes de suscetibilidade já evidenciaram resistência frente a outros azólicos como ao itraconazol e voriconazol. Os derivados resistentes ao fluconazol evidenciaram concentrações inibitórias mínimas maiores ou iguais a 64 g/mL. Neste grupo de isolados fluconazol-resistentes, os testes de suscetibilidade detectaram resistência cruzada com cetoconazol, voriconazol e itraconazol bem como com outros agentes de outras classes como a anfotericina B e caspofungina. A indução da resistência foi realizada com o objetivo de se comparar a suscetibilidade entre os dois grupos, frente a fármacos combinados. As associações de antifúngicos entre os grupos sensíveis e resistentes ao fluconazol resultaram, em maior parte, interações indiferentes. No entando as associações mostraram-se mais eficazes nos isolados resistentes ao fluconazol. Em ambos os grupos, a combinação que resultou em maior sinergismo foi anfotericina B com flucitosina (.G1 = 61,77%.% e G2 = 76,47%); outras combinações sinérgicas foram anfotericina B + cetoconazol (G2 = 73,53%), anfotericina B + voriconazol (G2 = 55,88%), todos com ausência de antagonismo. Os maiores percentuais de antagonismo foram observados na combinação cetoconazol + flucitosina (G1 = 61,77% e G2 = 55,88%).

A participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos, bem como a relação entre resistência aos antifúngicos e resposta ao estresse oxidativo, têm sido sugeridos. Entretanto, os dados ainda são inconclusivos e diferem entre os micro-organismos. Neste estudo estão apresentados os resultados da geração de ERO pelo fluconazol em isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes a esse antifúngico e a resposta antioxidante da levedura. Nesses isolados, tratados e não tratados com fluconazol em concentração subinibitória, de acordo com sua concentração inibitória mínima (CIM), até fase de crescimento estacionário, foi avaliado se o fluconazol geraria ERO. Subsequentemente, foram analisadas as defesas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), glutationa-S-transferase (GST), consumo de peróxido de hidrogênio e glutationa total, bem como possível dano oxidativo causado pelo fluconazol em lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos e os níveis de nitritos e nitratos. Os resultados mostram que nos isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes ao fluconazol, na presença do antifúngico, houve um aumento da geração ERO e maior atividade enzimática da GPx e SOD comparada a dos isolados não tratados com fluconazol, não havendo diferença estatística entre isolados sensíveis e resistentes nesses três parâmetros citados. Em relação à enzima GST, os isolados sensíveis mostraram maior atividade enzimática comparada aos resistentes, e quando as células sensíveis foram tratadas com fluconazol, a atividade da GST diminuiu. O fluconazol não induziu dano oxidativo em proteínas e em lipídeos, entretanto foi observado dano oxidativo ao DNA. Diante disso, sugere-se que o fluconazol gera ERO como parte do seu mecanismo antifúngico em C. glabrata em fase de crescimento estacionário, induzindo dano oxidativo no DNA. Como resposta, observa-se aumento na atividade enzimática da SOD e da GPx na levedura. O entendimento da resposta antioxidante de leveduras patogênicas tem importante interesse clínico, uma vez que o desenvolvimento racional de novas drogas antifúngicas requer conhecimento do metabolismo fúngico. / The participation of reactive oxygen species (ROS) in azoles antifungal mechanism of action has been suggested, as well as the relation between antifungal resistance and oxidative stress response. However, data are still inconclusive and differ between microorganisms. This study presents the results of ROS generation by fluconazole in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains and their antioxidant response. It was evaluated whether fluconazole generates ROS in those isolates treated and untreated with fluconazole at sub-inhibitory concentration according to their minimal inhibitory concentration (MIC). This treatment was conducted until stationary growth phase was reached. Subsequently, the antioxidant defenses glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), glutathione-S-transferase (GST), consumption of hydrogen peroxide and total glutathione, the possible oxidative damage in lipids, proteins and nucleic acids and the levels of nitrites and nitrates were analyzed. Results showed increased ROS generation in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains treated with fluconazole, and also higher GPx and SOD enzymatic activity, compared to untreated cells. No statistical difference of those three parameters was observed between susceptible and resistant strains. In relation to GST, susceptible strains demonstrated higher activity compared to the resistant ones, and when susceptible cells were treated with fluconazole the GST activity decreased compared to untreated. Fluconazole did not induce oxidative damage in proteins and in lipids, however oxidative DNA damage was observed. Therefore, it is suggested that fluconazole generates ROS as part of its antifungal mechanism in C. glabrata at stationary growth phase, inducing oxidative DNA damage. In response, there was increase in the enzymatic activity of SOD and GPx in yeast. The understanding of the pathogenic yeast antioxidant response has important clinical interest, since the rational development of new antifungal drugs requires knowledge about the fungal metabolism.

A Criptococose é uma enfermidade micótica sistêmica, subaguda ou crônica, que acomete a cavidade nasal, tecidos paranasais e pulmões do homem, animais domésticos e silvestres, podendo disseminar-se para o sistema nervoso central, olhos, pele e outros órgãos. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose em pequenos animais, incluindo toxicidade, desenvolvimento de resistência aos antifúngicos tradicionalmente utilizados e longos períodos de tratamento da enfermidade, o estudo objetivou avaliar a eficácia do imunomodulador ß (1-3) glucana isoladamente e em associação ao fluconazol no tratamento da criptococose experimental. Foram utilizados 100 camundongos (Mus musculus), cepa UFPel, albinos, os quais foram divididos em cinco grupos de 20 animais. O tratamento dos animais com criptococose experimental foi iniciado sete dias após a inoculação. O grupo Controle (G1) foi tratado com 0,1 ml de água destilada estéril, o grupo Fluconazol (G2) com 5 mg/kg de fluconazol, o grupo Fluconazol associado a ß (1-3) glucana (G3) com 5 mg/kg de fluconazol associado a 0,5 mg de ß (1-3) glucana, o grupo Glucana dose I (G4) com 0,5 mg de ß (1-3) glucana e o grupo Glucana dose II (G5) recebeu 0,25 mg de ß (1-3) glucana. Após acompanhamento clínico durante as seis semanas de tratamento os animais foram eutanasiados e necropsiados para avaliação anatomopatológica dos órgãos, quantificação das unidades formadoras de colônias fúngicas (UFCs), retroisolamento e avaliação histopatológica. Nas avaliações clínicas o G3 foi sempre superior ao G1 e G2, sendo que na última avaliação clínica individual, os animais pertencentes ao G3 não apresentavam nenhum sintoma clínico. O G2 teve um menor número de órgãos afetados e de alterações macroscópicas, seguido pelo G3, sendo que no primeiro não foram observadas lesões em órgãos-alvo, como pulmão e cérebro. O grupo com maior número de lesões e órgãos afetados foi o G1. Nos parâmetros retroisolamento e UFCs, o G3 foi superior aos outros tratamentos, seguido pelo G2, sendo que o pior grupo, ou seja, aquele que teve um maior número de isolamentos e maior quantificação de UFCs foi o G1. Conforme os resultados obtidos os tratamentos G2 e G3 foram os mais eficazes para a remissão da criptococose experimental, no entanto, G3 apresentou uma superioridade na maioria dos parâmetros avaliados. Portanto, de acordo com os resultados obtidos, a associação de fluconazol ao imunomodulador ß (1-3) glucana pode ser uma alternativa benéfica em considerável quantidade de pacientes com criptococose. / Cryptococcosis is a systematic sub acute or chronic mycotic condition that affects the nasal cavity, paranasal tissues and the lungs of humans, as well as domestic and wild animals, which can spread to the central nervous system, skin, and other organs. Considering the therapeutic difficulties in treating this mycosis in small animals, which include toxicity, resistance towards traditionally used antifungals, and the extended treatment of this condition, this study aimed to evaluate the ß (1-3) glucan immunomodulator efficacy when used both alone and in association with fluconazole in the treatment of experimental cryptococcosis. One Hundred albino UFPel strain mice (Mus musculus), divided into five groups of 20 animals each, were used. The treatment of these animals with experimental cryptococcosis was started seven days following inoculation. The control group (G1) was treated with 0,1 ml sterile distilled water. The fluconazole group (G2) was treated with 5 mg/kg fluconazole; the fluconazole associated with ß glucan (1-3) group (G3) was treated with 5 mg/kg fluconazole associated with 0,5 mg ß (1-3) glucan ; the group glucan dose I (G4) was treated with 0,5 mg ß (1-3) glucan, and the group glucan dose II (G5) was administered 0,25 mg ß (1-3) glucan. After the six-week treatment clinical follow-up, the aimals were euthanized and necropsied for anatomopathological evaluation of organs, quantification of fungal colony-forming units (FCUs), retro isolation and histopathological evaluation. In clinical evaluations, G3 was always superior to G1 and G2, and in the last individual clinical evaluation, G3 animals did not show any clinical symptoms. G2 had a smaller number of affected organs and microscopic alterations, followed by G3. In G2, target organ lesions, such as those in the lungs and brain, were not found. Considering retro isolation and FCU parameters, G3 was superior to other treatments, followed by G2; the worst group, that is, the one with the highest isolation occurrence and greatest FCU quantification, was G1. According to the results obtained, treatments G2 and G3 were the most efficient in experimental cryptococcosis remission; however, G3 was superior in most parameters evaluated. Therefore, according to the results obtained, the association of fluconazole with the ß (1-3) glucan immunomodulator can be a beneficial alternative to a considerable number of cryptococcosis-bearing patients.

A ceratite fúngica é uma doença grave que pode levar à perda da visão. O tratamento consiste na aplicação de antifúngicos, no entanto a administração tópica não tem se mostrado efetiva devido aos mecanismos de defesa do olho que levam à baixa retenção da formulação no local de aplicação e à baixa permeação do fármaco através da córnea. Sendo assim, formulações mais adequadas e sistemas de liberação vêm sendo estudados na tentativa de melhorar a biodisponibilidade local de antifúngicos. No presente trabalho foram obtidos e caracterizados dois sistemas para a liberação ocular do fluconazol (FLU), um antifúngico de atividade reconhecida: um gel termorreversível in situ e micropartículas poliméricas. A permeação passiva e iontoforética do fármaco através da córnea foi estudada in vitro a partir dos sistemas desenvolvidos. O gel termorreversível in situ contendo 16% de poloxamer e 1,0% de quitosana apresentou temperatura de geleificação adequada, propriedades mucoadesivas, melhores parâmetros mecânicos (dureza, compressibilidade e adesividade) que ambos os polímeros separadamente e mostrou-se superior que micropartículas poliméricas, com fluxo de permeação passiva cerca de duas vezes maior. A maior quantidade de fármaco retido na córnea foi obtida após aplicação da iontoforese em solução aquosa do fármaco. Ainda assim, o fluxo iontoforético do FLU não foi significativamente diferente do fluxo passivo a partir do gel termorreversível. O desempenho in vivo desta formulação foi então avaliado em modelo animal. Estudos de permeação, utilizando a técnica de microdiálise para amostragem da câmara anterior, confirmaram a maior biodisponibilidade do fármaco. Por fim, exames de cintilografia em humanos confirmaram maior tempo de retenção na superfície ocular. Portanto, o gel termorreversível in situ obtido e caracterizado no presente trabalho e a iontoforese, representam sistemas promissores para a liberação ocular tópica do FLU. O primeiro possui características promotoras de permeação, prolongado tempo de retenção e facilidade de obtenção e administração, e o segundo é capaz de promover maior retenção do fármaco na córnea. / Fungal keratitis is a serious disease that can lead to loss of sight. The treatment consists in antifungal application; however topical administration has not shown to be effective due to defense mechanisms of the eye, which leads to low retention at the application site and low permeation of the drug trough the cornea. In this way, more suitable formulations and delivery systems have been studied in an attempt to increase local availability of antifungal agents. At the present work it was obtained and characterized two systems for the passive and iontophoretic ocular delivery of fluconazole (FLU), a well known antifungal agent: an in situ forming gel and polymeric microparticles. Passive and iontophoretic drug permeation across the cornea was studied in vitro from the developed systems. The in situ forming gel containing 16% of poloxamer and 1.0% of chitosan presented more adequate gelation temperature, mucoadhesive properties, improved mechanical parameters (strength, compressibility and adhesiveness) than both polymers separately and showed to be superior to the polymeric microparticles, with passive permeation flux almost twice higher. The greatest amount of drug retained in the cornea was achieved after iontophoresis application using an aqueous solution of the drug. Even though, the iontophoretic drug flux was not significantly different from the passive drug flux using the in situ forming gel. The in vivo performance of this formulation was then evaluated in an animal model. Permeation studies, using the microdialysis technique for the anterior chamber sampling, confirmed the increased drug availability. At the end, scintigraphy exams in humans confirmed the greater retention time at the ocular surface. Therefore, the in situ forming gel obtained and characterized at the present work and iontophoresis, represent promising systems for the topical ocular delivery of FLU. The first possess permeation enhancement properties, prolonged retention time and facility of obtention and administration, and the second is capable of promoting higher drug retention in the cornea.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Widespread and prolonged usage of azoles in recent years has led to the rapid development of drug resistance in Candida species. In Candida albicans, resistance to fluconazole causes cross-resistance to other antifungals and an increase in virulence, making treatment still more difficult because of the limited therapeutical options. Nonetheless, similar phenomenon has been observed for Candida glabrata, specie that has emerged as a pathogen of clinical importance. Fluconazole resistance has been clinically described in Candida glabrata isolates and it is easily induced by in vitro exposure to the drug, but little is known about its consequences. In the present study, two groups of C. glabrata isolates were evaluated. One group was composed by fluconazole-susceptible clinical isolates (FS), and the other was composed by fluconazole-resistant (FR) laboratory derivatives from the former through an in vitro method of fluconazole resistance induction, in order to compare the activitie of the three major antifungal agent classes azoles, echinocandins and poliens. Resistant derivatives showed minimal inhibitory concentrations equal or higher than 64 μg/mL. All yeasts were tested by the broth microdilution method. Based on susceptibility parameters (MIC range, MIC50, MIC90 and geometric mean), the fluconazole-susceptible C. glabrata group (FS) was susceptible to amphotericin B (MIC90 of 0.125 μg/ml). For inhibition, the fluconazole-resistant C. glabrata group (FR) required higher concentrations of amphotericin B (MIC90 of 2 μg/ml). C. glabrata FR group showed cross-resistance with voriconazole (MIC90 of 16 μg/ml). Echinocandins showed the lowest MICs against to both group, flucoanzole-susceptible and resistant. Micafungin demostrated the lowest MIC values among all antifungal agents evaluated (MIC90 of 0.008 μg/ml in FS and 0.015 μg/ml in FR). Our results showed that resistance to fluconazole affected voriconazole susceptibility but not the echinocandin susceptibility, which demonstrated excellent activitie against tested C. glabrata groups. / O uso prolongado e indiscriminado dos azólicos nos últimos anos permitiu um rápido desenvolvimento de resistência aos fármacos nas espécies de Candida. Em Candida albicans, a resistência ao fluconazol causa resistência cruzada a outros antifúngicos e aumento na virulência, tornando o tratamento ainda mais complicado por causa das opções terapêuticas limitadas. Ainda assim, fenômeno semelhante tem sido observado para Candida glabrata, espécie que emergiu como patógenos de importância clínica. A resistência ao fluconazol tem sido clinicamente descrita em isolados de Candida glabrata, e é facilmente induzida pela exposição in vitro ao azólico, mas pouco se conhece sobre suas conseqüências. No presente estudo, dois grupos de isolados de C. glabrata foram avaliados. Um grupo era composto de isolados clínicos sensíveis ao fluconazol (FS), e o outro, derivado do primeiro através de técnica de indução de resistência, era composto de isolados resistentes ao fluconazol (FR), com o intuito de comparar a atividade das três maiores classes de agentes antifúngicos azóis, equinocandinas e poliênicos. Os derivados resistentes obtidos evidenciaram concentrações inibitórias mínimas (CIMs) maiores ou iguais a 64 μg/mL. Foram realizados testes de suscetibilidade aos antifúngicos através da técnica de microdiluição em caldo. Com base nos parâmetros de suscetibilidade (faixa de CIM, CIM50, CIM90 e média geométrica), o grupo FS foi suscetível à anfotericina B (CIM90 de 0,125 μg/ml). Entretanto, o grupo FR requereu doses maiores do antifúngico para ser inibido (CIM90 de 2 μg/ml). O grupo de C. glabrata FR evidenciou resistência cruzada com voriconazol (CIM90 de 16 μg/ml). As equinocandinas mostraram os melhores resultados frente a ambos os grupos, sensíveis e resistentes. Micafungina demonstrou os menores valores de CIM entre todos os agentes antifúngicos estudados (CIM90 de 0.008 μg/ml para FS e 0.015 μg/ml para FR). Os resultados deste estudo mostraram que a resistência ao fluconazol afeta a suscetibilidade do voriconazol, mas não das equinocandinas, as quais mostraram excelente atividade frente aos grupos de C. glabrata testados.