Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Las vacunas de ADN son una terapia alternativa altamente atractiva para combatir el cáncer. Esta estrategia consiste en la entrega in vivo de ADN plasmidial codificante de antígenos tumorales que son expresados y presentados por células dendríticas (DC) con el fin de activar linfocitos T capaces de eliminar específicamente células tumorales. Un importante paso hacia la aplicación clínica de las vacunas de ADN ha sido el uso de la electroporación in vivo, un método de entrega altamente eficiente y clínicamente aplicable, que aumenta considerablemente el ingreso de plásmidos al interior de las células. Sin embargo, la mayoría de los antígenos tumorales son antígenos propios expresados en células normales, por lo que el sistema inmune es incapaz de discriminar a los tumores como agentes potencialmente peligrosos. Es así como los esfuerzos para resolver estos inconvenientes se han enfocado, en parte, en la búsqueda y elaboración de nuevas estrategias que sean capaces de promover eficientemente la inducción de linfocitos T específicos contra estos antígenos tumorales poco inmunogénicos. El ADN usado en las vacunas puede ser reconocido por numerosos receptores de la inmunidad innata, los cuales al ser activados, señalizan a través del factor de transcripción NF-κB, induciendo la expresión de citoquinas proinflamatorias e interferones de tipo I. NF-κB es un regulador maestro de la función de las DC y de la inducción de linfocitos T mediada por vacunas de ADN, por lo tanto, el desarrollo de adyuvantes que modulen su actividad representa una estrategia interesante para promover la inducción eficiente de linfocitos T antitumorales. IκBα es uno de los principales inhibidores de NF-κB, el cual además es un gen blanco de NF-κB, por lo que actúa en un sistema de retroalimentación negativa para detener la activación de esta vía. Por otro lado, el uso de shARN que silencian la expresión de reguladores negativos de las DC ha demostrado su capacidad como adyuvantes génicos en vacunas de ADN, al inducir una respuesta inmune antitumoral más potente. Por tanto, nuestra hipótesis plantea que un shARN contra IκBα es capaz de potenciar la activación de la inmunidad innata mediada por NF-κB y, como consecuencia, la magnitud de la respuesta inmune adaptativa específica contra el antígeno tumoral codificado. En este proyecto se utilizaron plásmidos codificantes de un shARN contra IκBα como adyuvantes génicos para ser administrado junto a una vacuna de ADN que codifica para el antígeno tumoral TRP2. Se evaluó el efecto del silenciamiento de IκBα sobre la migración de las células dendríticas de la piel, particularmente sobre las células de Langerhans y sobre las células dendríticas dermales CD103+. La generación de linfocitos T específicos contra TRP2 se analizó en ratones vacunados mediante citometría de flujo y el efecto antitumoral in vivo se evaluó usando un modelo de profiláctico de melanoma metastásico y un modelo terapéutico de melanoma subcutáneo. Los resultados de este trabajo indican que la administración de ADN plásmidial en la piel incrementa la migración de células dendríticas hacia los nódulos linfáticos drenantes y que la inhibición de la expresión de IκBα con un shARN en el sitio de vacunación incrementa la migración de células dendríticas dermales CD103+ hacia el nódulo linfático drenante. Además se observó que la coadministración del shARN contra IκBα en conjunto con una vacuna de ADN dirigida contra el antígeno tumoral TRP2 potencia la generación de linfocitos T CD8 específicos e incrementa la respuesta inmune antitumoral en ensayos de metástasis pulmonar y crecimiento tumoral utilizando el modelo de melanoma murino B16F10. Dada la gran capacidad de las células dendríticas dermales CD103+ para activar linfocitos T CD8 es posible correlacionar su incremento en los nódulos linfáticos drenantes del sitio de vacunación con una mayor generación de linfocitos T CD8 específicos contra TRP2 y con un incremento en la respuesta inmune antitumoral contra melanoma cuando se coadministra el shARN contra IκBα junto con una vacuna de ADN dirigida contra el antígeno tumoral TRP2 / DNA vaccines are a highly attractive therapeutic alternative to treat cancer. This strategy consists of in vivo delivering plasmid vectors encoding tumor antigens, which are expressed and presented by dendritic cells (DC) in order to activate T cells capable of specifically eliminating tumor cells. An important step towards the clinical application of DNA vaccines has been the use of in vivo electroporation, a highly efficient delivery method that is clinically applicable and considerably increases plasmid uptake in cells. However, most of tumor antigens are self-antigens expressed by normal cells, so that the immune system is unable to recognize tumors as potentially dangerous agents. Thus, the efforts to solve these inconvenient have been focused on developing new strategies to promote the induction of T cells responses specific against such poorly immunogenic tumor antigens. DNA used for vaccines can be recognized by several innate immune receptors that, upon activation, signal through the transcription factor NF-κB which induces the expression of proinflamatory cytokines and type I interferons. NF-κB is a master regulator of both DC function and DNA vaccine-mediated induction of T cell responses, therefore the development of adjuvants that modulate NF-κB activity represents an interesting strategy to promote the efficient induction of antitumor T cell responses. IκBα is one of the major inhibitors and downstream target genes of NF-κB, therefore acting in a negative feedback loop to stop NF- κB activation. The use of shRNA silencing negative regulators of DC function has demonstrated its potential as genetic adjuvants for DNA vaccines by inducing enhanced antitumor immune responses. Hence, our hypothesis states that a shRNA targeting IκBα is able to promote the NF-κB innate immune activation and, as a consequence, the magnitude of tumor antigen-specific adaptive immune responses. In this project, plasmid-encoded shRNA targeting IκBα were generated as genetic adjuvants to be coadministrated with a DNA vaccine encoding the tumor antigen TRP2.The effect of IκBα silencing was analyzed over the migration of skin dendritic cells, particularly Langerhans cells and CD103+ dermal dendritic cells. Generation of TRP2-specific T cells was studied in vaccinated mice by flow cytometry and the in vivo antitumor effect was evaluated using prophylactic model of metastatic melanoma and a subcutaneous model of melanoma. The results obtained in this work shows that the inhibition of IκBα using a shRNA increases the migration of CD103+ dermal dendritic cells to the skin draining lymph nodes. Also the coadministration of the shRNA against IκBα and a DNA vaccine against TRP2 enhance the generation of TRP2 specific CD8 T cells increasing the antitumor immune response against melanoma. Finally due to the high ability of CD103+ dermal dendritic cells to cross-present antigens and activate CD8 T cell is possible to correlate their increase in the migration with higher levels of TRP2 specific CD8 T cells and higher antitumor immune response when the shRNA against IκBα is coadministered with a DNA vaccine against TRP2

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Doctora en Farmacología / La enfermedad de Chagas es causada por Trypanosoma cruzi. Este parásito desencadena una respuesta inflamatoria que tiende a controlar la infección en el hospedero. Sin embargo, la permanencia del parásito provoca la persistencia de la inflamación que finalmente conduce al desarrollo de la Cardiopatía Chagásica Crónica (CCC). La CCC es consecuencia de alteraciones microvasculares, entre otros mecanismos. Característicamente, la expresión de moléculas de adhesión celular (ECAMs) como ICAM-1, VCAM, y E-selectina, está aumentada para favorecer el reclutamiento de células inflamatorias. Es posible mejorar el tratamiento antichagásico actual modificando algunos aspectos de la fisiopatología en el hospedero. Así, se propone que simvastatina, por sus efectos pleiotrópicos que modulan la respuesta inflamatoria vascular, podría mejorar la disfunción endotelial inducida por T. cruzi. Este efecto estaría mediado por un mecanismo que involucra la producción de un eicosanoide proresolutorio de la inflamación denominado 15-epi-lipoxina A4, que deriva de la ruta sintética de 5-lipoxigenasa, o también conocido como lipoxinas gatilladas por aspirina. Se realizó un modelo de activación endotelial, en el que células endoteliales EA.hy926 y HUVEC fueron previamente tratadas con simvastatina 5 μM o benznidazol 20 μM durante 24 horas, y posteriormente infectadas con T. cruzi por 16 horas. Se observó que ambos fármacos fueron capaces de prevenir el aumento de la expresión de ECAMs y en consecuencia, disminuyeron la adhesión celular sin afectar la viabilidad celular ni la integridad del citoesqueleto. Además, este efecto es independiente de su actividad tripanocida. Por otra parte, ambos fármacos bloquearon la activación de la cascada de NF-κB y el traslado de p65 al núcleo, pero sólo simvastatina indujo la producción de 15-epi-lipoxina A4. Es más, la 15-epi-lipoxina A4 fue capaz de disminuir, por si misma, la expresión de ECAMs. Se concluye que simvastatina o benznidazol previenen la activación endotelial, aunque sólo simvastatina actúa a través de un mecanismo dependiente de la producción de este lípido pro-resolutorio de la inflamación, 15-epi-lipoxina A4. Como la inflamación y la disfunción endotelial tienen un rol pivotal en la patogénesis de la enfermedad de Chagas, es posible que simvastatina y benznidazol puedan modular el daño microvascular de la enfermedad de Chagas. Por lo tanto, en este trabajo presentamos las bases que soportan el uso de simvastatina en el tratamiento de la Cardiopatía Chagásica / Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi. This parasite triggers an inflammatory response to control host's infection. As the inflammatory response persists, the patients develop Chronic Chagas Cardiomyopathy (CCC). The CCC is consequence of microvascular alterations, among others mechanisms. This process is characterized by an increased expression of Endothelial Cell Adhesion Molecules (ECAMs) like ICAM-1, VCAM, and E-selectin, allowing inflammatory cell recruitment. It is possible to improve the current treatment modifying some aspects of the pathophysiology in the host. Thus, it is proposed that simvastatin may improve vascular immune response due to their pleiotropic effects in the modulating inflammatory responses and improve endothelial dysfunction induced by T. cruzi. This effect would be mediated by a mechanism that involves the production of a novel pro-resolving lipid, the 5-lypoxygenase derivative 15-epi-lipoxin A4, which belongs to aspirin triggered lipoxins. A model of endothelial activation was performed in which EA.hy926 and HUVEC endothelial cells were pretreated with 5 μM simvastatin or 20 μM benznidazole for 24 hours, and then infected with T. cruzi parasite for 16 hours. It was observed that both drugs prevented the increase in ECAMs and in consequence, decreases cell adhesion without affecting the cell viability and cytoskeleton. Thus, the effect is independent of their trypanocidal activity. Furthermore, both drugs blocked NF-κB activation and they blocked the transfer of the nucleus p65, and in the case of simvastatin, this effect was mediated by the production of 15-epi-lipoxin A4. In the other hand, the 15-epi-lipoxin A4 was able to decrease by itself, the expression of ECAMs. In conclusion, both drugs prevent the T. cruzi-induced endothelial activation but only simvastatin acts through a mechanism dependent on the production of this pro-resolving lipid, 15-epi-lipoxin A4. As the inflammation and endothelial dysfunction have a key role in the pathogenesis of Chagas disease, simvastatin and benznidazole may modulate the microvascular damage in Chagas disease. Thus, we provide the bases that support the future use of simvastatin in the treatment of cardiac Chagas disease

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Doctor en Bioquímica / Las enfermedades cardiovasculares corresponden a la principal causa de muerte. En un corazón normal, insulina promueve incorporación de glucosa y su utilización estimulando la glicolisis, y estimulando la síntesis de proteínas. Por otro lado, durante isquemia/reperfusión, insulina promueve cardioprotección. Sin embargo, todos los estudios se han enfocado en estudiar el rol de insulina durante la reperfusión; por lo tanto, los efectos de esta hormona son desconocidos durante la isquemia. Además, antecedentes sugieren que el factor transcripcional NF-κB podría ser protector durante isquemia. NF-κB, controla una variedad de procesos antiapoptóticos, inflamatorios y de adhesión celular, entre otros. Una proteína controlada tanto por insulina como por NF-κB, en células endoteliales, es VCAM-1. Esta proteína es importante para el desarrollo del corazón y la diferenciación muscular. Por lo tanto, se estudiaron el rol de NF-κB y VCAM-1 y su regulación por insulina en el cardiomiocito isquémico. Para probar esto, cardiomiocitos neonatos fueron sometidos a isquemia simulada (IS) por 8 horas en ausencia o presencia de insulina 10 nM en combinación de diferentes tratamientos (inhibición de AKT mediante AKTi VIII, inhibición de NF-κB por BAY 11-7082 y reducción de VCAM-1 por siRNA). Los efectos protectores de insulina fueron evaluados mediante conteo celular, actividad LDH presente en el medio, fragmentación del DNA. Insulina protegió frente a isquemia, disminuyendo la necrosis y apoptosis durante IS. La presencia de los inhibidores AKTi VIII y BAY 11-7082 redujeron los efectos protectores de insulina. El silenciamiento de VCAM-1 también inhibió los efectos protectores de insulina en IS. Además, el silenciamiento de VCAM-1 resultó en aumento en la activación de AKT durante IS y menos respuesta frente la presencia de insulina. Estos resultados sugieren que insulina reduce la necrosis de los cardiomiocitos a través de la activación de AKT y NF-κB. Más aún, VCAM-1 estaría regulando este rol protector de insulina durante IS a través de la regulación de AKT. Estos hallazgos aportan a clarificar el rol protector de insulina durante isquemia, y su posible utilización durante cirugías y trasplante de corazón. Finalmente, estos resultados dejan a la luz un nuevo rol de VCAM-1 en la señalización de insulina y apoyan la idea que activación de AKT no siempre es sinónimo de cardioprotección / In Chile and worldwide cardiovascular diseases are the major causes of death. In the normal heart, insulin promotes glucose uptake and its utilization via glycolysis, regulates long-chain fatty acid uptake and protein synthesis. On the other hand, during ischemia/reperfusion, insulin promotes cardioprotection. Nevertheless, all studies have focused on insulin effects during reperfusion. Moreover, the transcription factor NF-κB seems to be protective against ischemia. VCAM-1 is a protein regulated by both insulin and NF-κB. Therefore, we explored the cardioprotective action of insulin and the role of AKT, NF-κB and VCAM-1 on the protective role of this hormone during ischemia. To test this, cultured neonatal rat cardiomyocytes were exposed to simulated ischemia by 8 hours in the absence or presence of insulin in combination with different treatments (AKT inhibition by AKTi VIII, NF-κB inhibition by BAY 11-7082 and VCAM-1 reduction by siRNA transfection). Cytoprotective effects of insulin were measured by cell count, LDH release and DNA. We found that insulin protected against simulated ischemia. Moreover, insulin protected cardiomyocytes from simulated ischemia by reducing necrotic cell death. Protective effects of insulin were dependent of AKT and NFκB. Additionally, silence of VCAM-1 inhibited insulin protection against simulated ischemia. We found that VCAM-1 silencing resulted in an AKT overactivation and less insulin response. These results show that insulin reduces ischemia-induced cardiomyocyte necrosis through an AKT and NF-κB dependent mechanism. Moreover, VCAM-1 regulates this protective role of insulin during ischemia. These novel findings clarify the role of insulin during ischemia and propose a new function of VCAM-1 as an insulin signaling regulator / Conicyt, Fondap, Fondecyt, Nemesis

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / Resolvina D1 y Resolvina E1 inhiben la activación de AKT, ERK1/2 y NF-kB dependiente de LPS y previenen la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 en fibroblastos cardíacos Los fibroblastos cardiacos (FC) son células que tienen como función regular la matriz extracelular (MEC), pueden responder a estímulos endógenos o exógenos que alteren la homeostasis del sistema, y en caso de injuria, pueden proliferar y migrar hacia el sitio de daño. Uno de los agentes proinflamatorios más estudiados y utilizados es el lipopolisacárido (LPS) bacteriano, éste desencadena la respuesta inflamatoria activando las vías de señalización Akt, ERK1/2 y NF-κB, que conducen a la expresión de citoquinas proinflamatorias y factores de crecimiento los que, a su vez, aumentan la expresión de proteínas de adhesión como ICAM-1, VCAM-1, E-selectina, L-selectina, entre otras; permitiendo que células del sistema inmune viajen desde la circulación sanguínea hasta el sitio de injuria, para cicatrizar la herida. La inflamación puede ser terminada activamente por mediadores proresolutivos. Unos de estos mediadores son la Resolvina (Rv) D1 y E1. La RvD1 proviene del ácido docosahexaenoico y la RvE1 del ácido eicosapentaenoico. Estas se biosintetizan durante la inflamación y se les ha asociado propiedades antiinflamatorias, limitando la infiltración de neutrófilos, estimulando la fagocitosis de los macrófagos y reduciendo el nivel de dolor inflamatorio y fibrosis. Sin embargo, no existe evidencia de los efectos que podría tener en FC. El objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de RvD1 y RvE1 en FC, para así estudiar las acciones que tendría en un contexto inflamatorio inducido por LPS, evaluando la actividad en las vías de señalización Akt, ERK1/2 y NF-κB y sobre la expresión de las proteínas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1. 12 Los resultados obtenidos muestran que RvD1 presenta una significativa disminución de la activación de Akt y ERK1/2, no así de NF-κB. RvE1 disminuye significativamente la activación de ERK1/2, sin embargo, no presenta cambios significativos respecto al control en la fosforilación de Akt y NF-κB. Además, se demostró que en FC estimulados con LPS y pretratados con RvD1, disminuyó la activación de las vías Akt, ERK1/2 y NF- κB respecto a LPS, y consecuentemente disminuyó la expresión de VCAM-1, pero no de ICAM-1. Por otro lado, RvE1 disminuyó significativamente la activación de Akt, no así la activación de ERK1/2 y NF-κB estimuladas por LPS. Además, disminuyó la expresión de ICAM-1 estimulado por LPS, pero no de VCAM-1. En conclusión, nuestros resultados sugieren que tanto RvD1 como RvE1 poseen propiedades resolutivas en un modelo de inflamación en FC, lo cual posibilitaría su uso como nuevas herramientas terapéuticas en enfermedades cardiacas / Resolvin D1 and Resolvin E1 inhibit AKT, ERK1/2 and NF-kB activation LPSdependent and prevent ICAM-1 and VCAM-1 expression in cardiac fibroblasts Cardiac fibroblasts (CF) are cells that regulate the extracellular matrix (ECM), they can respond to endogenous or exogenous stimuli that alter the homeostasis of the system, and in case of cardiac tissue injury, they can proliferate and migrate to the site of damage. One of the most studied and used proinflammatory agents is bacterial lipopolysaccharide (LPS), it triggers the inflammatory response activating the signaling pathways Akt, ERK1/2 and NF-κB, which lead to the expression of proinflammatory cytokines and growth factors that increase the expression of adhesion proteins such as ICAM-1, VCAM- 1. E-selectin, L-selectin, among others. These effects of LPS favor to the cells of the immune system extravasate to the site of injury to degrade the microorganism and heal the wound. Inflammation can be actively terminated by proresolving mediators, such as RvD1 and RvE1. RvD1 derived from docosahexaenoic acid and RvE1 from eicosapentaenoic acid. These are biosynthesized during inflammation and have been associated with anti- inflammatory properties, limiting the infiltration of neutrophils, stimulating the phagocytic activity of macrophages and reducing the level of inflammatory pain and fibrosis. However, there is no evidence respect of the effects it could have on FC. In this study, we investigated the role of RvD1 and RvE1 in FC, to study the actions that would have in an inflammatory context induced by LPS, evaluating the activity in the signaling pathways Akt, ERK1/2 and NF-κB and the expression of adhesion proteins ICAM-1 and VCAM-1. 14 The results show that RvD1 exert a significant decrease of Akt and ERK1/2 activity, but not NF-κB; RvE1 significantly decreases the activation of ERK1/2, however, it does not present significant effect in regard to the control in the phosphorylation of Akt and NF-κB. In addition, the pretreatment with RvD1, has decreased the activation of the Akt, ERK1/2 and NF-κB pathways respect to LPS, and consequently decreased the expression of VCAM-1, but not ICAM-1. On the other hand, RvE1 has significantly decreased the activation of Akt stimulated by LPS, but not of ERK1/2 nor NF-κB. Additionally, the expression of ICAM-1 stimulated by LPS has decreased, but not of VCAM-1. In conclusion, our results suggest that RvD1 and RvE1 have resolutive properties in an inflammatory model in CF, which would make possible its use as new therapeutic tool in cardiac diseases / Proyecto Fondecyt N° 1170425