Au LOEX, un modèle de folliculogénèse a été caractérisé. Ce modèle consiste à incorporer des follicules pileux immatures de souris dans les peaux reconstruites par génie tissulaire. À l'aide des peaux reconstruites, nous avons comparé l'influence des cellules dermiques sur la différenciation des cellules souches des follicules pileux. La maturation in vitro des follicules pileux immatures sur les fibroblastes murins et humains a mené à l'apparition d'inclusions intradermiques. Cependant, les études de caractérisation ont révélé la présence de marqueurs de différenciation épidermique dans les kystes dérivants des follicules pileux immatures cultivés sur fibroblastes humains, contrairement à ceux cultivés sur fibroblastes murins. Ces derniers ont plutôt des caractéristiques histologiques qui ressemblent davantage aux cellules retrouvées au niveau de la gaine folliculaire externe du follicule pileux. Un dérèglement de la voie de signalisation Wnt pourrait expliquer ces phénomènes, puisque la p-caténine et le facteur Lef-l ne sont pas activés dans ces peaux reconstruites.

Les nucléotides cycliques sont des seconds messagers intracellulaires possédant une grande importance dans la signalisation cellulaire du follicule ovarien. Les niveaux intracellulaires en nucléotides cycliques tel que l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dépendent de leur synthèse, assurée par l'adenylyl-cyclase (AC) ainsi que leur dégradation par les phosphodiéstérases (PDE). Ces dernières appartiennent à la superfamille des métalophosphohydrolases, elles hydrolysent le groupement phosphate en 3' des nucléotides cycliques pour produire un nucléotide 5' phosphate. Dans les cellules ovariennes, plusieurs familles de PDE ont été identifiées, agissant comme modulateurs des taux intracellulaires de nucléotides cycliques. Dans le présent projet, nous nous attarderons à étudier la signalisation cellulaire chez les cellules ovariennes impliquant l'AMPc. La régulation de ses concentrations intracellulaires affecte plusieurs processus physiologiques. Le projet s'intéresse particulièrement à une famille d'enzyme de dégradation de l'AMPc, la phosphodiestérase8A (PDE8A). Nous voulons donc valider la présence fonctionnelle de la famille de PDE8A dans les cellules ovariennes ainsi que la mitochondrie afin de comprendre l'implication de cette enzyme dans la physiologie cellulaire en s'attardant à la stéroïdogenèse, étant donné que les mitochondries sont un organite cellulaire essentiel pour la stéroïdogenèse parce qu'elles représentent le site de synthèses de plusieurs hormones stéroïdiennes. En effet, des récents travaux ont montré la famille PDE8 comme un régulateur de la stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig. Dans cette étude, nous avons montré que le transcrit de PDE8A ainsi que sa protéine étaient exprimés dans les cellules de la granulosa, les cellules du cumulus et l'ovocyte chez le porc. Ainsi, la protéine PDE8a a été détectée par western blot dans des mitochondries isolées à partir des cellules de granulosa et des complexe ovocyte-cumulus (COC). Une co-localisation entre le signal immunoréactive de la PDE8A et le marquage réalisé par mitotracker a été observée dans les cellules de granulosa et des mitochondries isolées. De plus, la présence fonctionnelle de la PDE8 mesurée en tant qu'activité AMPc-PDE sensible au PF-04957325 a été détectée dans des cellules de la granulosa et des mitochondries isolées supportant la présence fonctionnelle de la PDE8A dans les mitochondries isolées. De ce fait, cette observation soutient encore la localisation fonctionnelle mitochondriale de la PDE8A. Une association entre la mitochondrie et la PDE8A a aussi été démontrée par immunomicroscopie électronique qui a confirmé l'ancrage de la protéine sur la membrane mitochondriale externe. Pour évaluer l'implication de la mitochondrie dans la stéroïdogenèse, l'effet de PDE8A sur la production de progestérone a été mesuré dans les complexes ovocyte-cumulus en utilisant le PF-04957325 comme un inhibiteur spécifique de PDE8. Lorsque les COC sont cultivés sans FSH, un niveau basal de progestérone est mesuré. Par contre en présence de FSH une augmentation significative de sécrétion de progestérone est observée. En utilisant un inhibiteur spécifique de la PDE8 (PF-04957325) avec la FSH nous avons obtenu une augmentation encore plus importante de la sécrétion de progestérone. Ces résultats démontrent la présence fonctionnelle de PDE8A dans les cellules de la granulosa et les complexes ovocyte-cumulus. Puisque les mitochondries sont l'une des localisations de PDE8A, l'effet de l'inhibiteur spécifique de PDE8 sur la sécrétion de progestérone soutient la contribution mitochondriale de PDE8 dans la stéroïdogenèse.

Le développement folliculaire est un processus finement régulé au cours duquel d'innombrables interactions se produisent. Cette régulation fine permet la production d'un ovocyte de qualité, précurseur d'un embryon apte à poursuivre les différentes étapes du développement embryonnaire. La production de cet ovocyte est dépendante des interactions avec son environnement, avec les cellules du cumulus, les cellules de la granulosa et de la thèque qui constituent le follicule ovarien. Ces cellules somatiques agissent comme régulateurs du développement ovocytaire et comme médiateurs de l'environnement maternel. Parmi les facteurs qui influencent la folliculogenèse, l'hormone folliculo-stimulante (FSH) et l'hormone lutéinisante (LH), deux principales hormones clés agissent de manière synergique et complémentaire pour assurer la croissance et l'ovulation. En plus de ces signaux hormonaux, le follicule est également sensible au métabolisme maternel qui, via différents métabolites et leurs précurseurs, influence le développement folliculaire. Dans un premier temps cette thèse s'intéresse à la caractérisation des principaux réseaux de signalisation qui sont impliqués dans la stimulation des cellules de la granulosa humaine en culture par les deux principales hormones ; la FSH et la LH. L'objectif étant d'utiliser des outils de génomique tels le séquençage à haut débit pour produire une image globale des différentes voies géniques qui répondent à l'activation des réseaux de signalisation de la protéine kinase A, de la protéine kinase C et de la protéine kinase B, trois voies de signalisation importantes dans la médiation des effets de la FSH et de la LH dans la granulosa. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse également à un autre aspect de l'environnement maternel qui, tout comme les signaux hormonaux, influence le développement folliculaire ; le métabolisme. Le deuxième volet de la thèse a donc comme objectif de décrire à l'aide des mêmes outils de génomique, l'impact des acides gras libres et de l'insuline sur les réseaux de signalisation des cellules de la granulosa humaine. L'utilisation d'un modèle cellulaire in vitro unique nous permettant l'étude des réseaux de signalisation dans un système stable et à un stade folliculaire autrement inaccessible chez la femme, a permis de mettre en évidence un rôle clair de la protéine kinase C dans la médiation des effets de la LH sur les cellules de la granulosa lors de la différenciation et maturation finale du follicule. L'étude plus en profondeur de ces réseaux de signalisation, incluant celui de la protéine kinase B au troisième chapitre, suggère que la protéine kinase A dirigerait majoritairement la différenciation folliculaire précoce alors que la protéine kinase C entrainerait une différenciation terminale impliquant des changements reliés aux processus inflammatoires et à l'ovulation. La protéine kinase B serait quant à elle une voie à caractère permissif agissant sur la survie cellulaire et qui supporterait les deux premières dans leurs actions. La thèse révèle également une certaine sensibilité des cellules de la granulosa au métabolisme maternel. Ainsi dans un contexte de maladie métabolique maternelle et d'exposition à de plus grandes quantités d'acides gras libres et d'insuline, plusieurs voies géniques reliées entre autres à la stéroïdogenèse, au métabolisme, à l'inflammation et au stress seraient perturbées dans la granulosa affectant ainsi le cours du développement folliculaire. En somme, les résultats présentés dans cette thèse suggèrent un aperçu global de l'action de certains des principaux réseaux signalétiques en action au cours de la folliculogenèse au niveau de la granulosa. Les données présentées dans cette thèse révèlent également un premier aperçu de la réponse génomique de ce tissu à certains défis métaboliques dont la prévalence est en augmentation dans la population. En plus de suggérer de nouveaux marqueurs potentiels et de générer de nouvelles hypothèses, les différentes études présentées dans cette thèse permettent l'amélioration de notre connaissance de la signature transcriptomique des cellules de la granulosa humaine en réponse aux gonadotrophines et à l'environnement métabolique maternel contribuant ainsi indirectement à l'amélioration des techniques de procréation assistée. / Folliculogenesis is a finely coordinated process that involves countless interactions which will influence the oocyte's quality and its ability to produce an embryo that will be capable of resuming the different steps of further embryonic development. Production of a good quality oocyte depends intrinsically on the interactions between the different cell types of the follicle and the exchanges with its direct environment. Granulosa cells act as the main coordinator for the follicular development and act as one of the principal mediators between the maternal environment and the oocyte. Among the many factors and hormones that influence folliculogenesis processes, the follicle-stimulating hormone (FSH) and the luteinizing hormone (LH) are both key hormones that regulate growth and ovulation in a complementary fashion. Besides these two hormones, the follicle is also sensitive to several components of the maternal metabolism such as hormones and metabolites that impact follicular development. First, the objective of this thesis was to characterize important signaling pathways involved in human granulosa cells stimulation by both FSH and LH. Using genomic technologies such as high-throughput sequencing, we were able to provide a global picture and a first insight of the three main signaling pathways activated in response to both hormones, namely the protein kinase A, the protein kinase B and the protein kinase C signaling pathways. Then, the thesis work also aims to describe, using the same technologies and the same in vitro model, the impact of maternal metabolism, more precisely of fatty acids and insulin on genomic answer in human granulosa cells. Using an in vitro cellular model allowing the study of the different signaling pathways in a very stable context and the study of a follicular stage otherwise not accessible in women, the work completed in this thesis allowed us to highlight and to specify the role of the protein kinase C as a major mediator of the LH signaling action on granulosa cells differentiation and final follicular maturation. In depth study of the main signaling pathways involved in FSH and LH signaling, including the protein kinase B, suggested that PKA signaling may drive the early differentiation of granulosa cells while PKC is thought to potentially control the "advanced" granulosa cell differentiation, mediating pathways related to inflammation and ovulatory processes. The PKB pathway should be looked at as a permissive signaling pathway that supports cell survival as well as PKA and PKC signaling but that is certainly of no less importance. The results of chapter 4 also revealed the direct sensitivity of granulosa cells to the metabolic context of the female during late folliculogenesis. Globally, when exposed to metabolic challenges such as high concentrations of fat and insulin, human granulosa cells seemed to respond through the modulation of numerous genes and pathways related to mitochondrial biofunctions, energy metabolism, and steroidogenesis and to activate as well a gene expression program linked to the immune response and to inflammatory processes. Ultimately, this thesis presents a first insight of the action of the main kinases involved in the response to gonadotrophin stimulation in human granulosa cells and an overview of the genomic reorganization in these cells triggered by metabolic challenges that are increasing in prevalence in the current population. Providing a great amount of data to potentially target new developmental or quality makers, this work also generates lots of new hypotheses on mechanisms involved in human folliculogenesis contributing to the improvement of our knowledge of human granulosa cells transcriptomic signatures and indirectly to the improvement of medically assisted reproduction techniques.

Studies were funded by Colegio de Postgraduados, México. CONACyT, México. SRE, México. Ministère de l’Éducation du Québec, University of Montreal and an Operating Grant to B.D. Murphy from the Canadian Institutes of Health Research. / Résumé L’approvisionnement en cholestérol est un facteur limitant la stéroïdogenèse ovarienne. Pour cette raison, la majorité du cholestérol requis pour la synthèse des stéroïdes est importé de la circulation via les récepteurs des lipoprotéines de haute (HDL) et de basse densité (LDL) nommés scavenger receptor (SR-BI) et low-density lipoprotein receptor (LDLr). L’ARN messager de SR-BI est exprimé dans les ovaires de porcs durant toutes les étapes de la folliculogenèse ainsi que dans le corps jaune (CL). L’expression de la protéine SR-BI a également été détectée dans les follicules de souris lors du cycle œstral. Chez les deux espèces, l’expression est concentrée dans le cytoplasme et en périphérie des cellules du follicule. Les gonadotrophines induisent l'expression de SR-BI dans les cellules de la granulosa porcines, avec une expression cytoplasmique qui augmente durant la période périovulatoire, et avec une migration aux périphéries cellulaires durant la maturation du CL. Une conformation de 82 kDa de SR-BI est fortement exprimée dans le CL porcin, avec une conformation moins abondante de 57 kDa. Les différences entre les conformations sont attribuables à la glycosylation. La culture in vitro de follicules porcins avec des gonatrophines chorioniques humaines (hCG) a induit une hausse de régulation dépendante du temps du SR-BI de 82 kDa dans les cellules du granulosa. SR-BI et LDLr ont été exprimés réciproquement, avec LDLr étant le plus élévé dans les cellules folliculaires du granulosa et diminuant précipitamment avec la formation du CL. Pour explorer plus en détail les mécanismes d’approvisionnement en cholestérol de la stéroïdogenèse ovarienne, nous avons examiné des souris soumis à un traitement de désaccouplement de l'ovulation, et des souris portant la mutation nulle du gène Scarb1 (SR-BI-/-). Les résultats ont démontré que des ovocytes enfermés dans des structures lutéinisées expriment SR-BI. Les souris SR-BI-/ - présentaient de petits CLs, et de large follicules avec des cellules de thèque hypertrophiées et des kystes folliculaires avec des cavités remplies de sang et une diminution de 50% du niveau de progestérone dans le sérum. Les souris SR-BI-/ - traitées avec une combinaison de 20 g / g de mevinoline et 100  g / g de chloroquine ont démontré une diminution de 43% du niveau de progestérone sérique chez le type sauvage et de 30% chez les souris SR-BI-/ -. L’expression protéique de l’enzyme limitant pour la synthèse du cholestérol, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGR), a augmenté chez les souris SR-BI-/-. Nous avons présenté des preuves démontrant que les cellules des follicules expriment le SR-BI durant la stéroïdogenèse et que la lutéinisation augmente l’expression de SR-BI. La maturation post-transcriptionelle est caractérisée par la glycosylation. Sous des conditions normales, l’expression de LDLr est arrêtée durant la lutéinisation. Ainsi SR-BI devient le facteur principal pour l’importation du cholestérol extracellulaire. En plus, la perturbation extracellulaire du cholestérol synthétisé de novo et l’absorption par les LDLr chez les souris SR-BI-/- diminuent la fonction lutéal. L’homéostasie du cholestérol ovarien est très importante pour une lutéinisation adéquate et sa perturbation mène à une réduction, mais non à un blocage complet, de la fonction lutéal. En conclusion, l’expression de SR-BI est un facteur important, mais non essentiel, pour maintenir l’homéostasie du cholestérol ovarien et la synthèse des stéroïdes, et la lutéinisation. Un réseau de mécanismes complémentaires et compensatoires d’approvisionnement en cholestérol agit en concert pour assurer la synthèse des stéroïdes ovariens. / Abstract Ovarian cholesterol supply is rate limiting to ovarian steroidogenesis. For this reason, the majority of cholesterol required for steroid synthesis is imported via scavenger receptor-BI (SR-BI) and the low-density lipoprotein (LDL) receptor from circulating HDL and LDL. SR-BI mRNA is expressed in pig ovaries at all stages of folliculogenesis and in the corpus luteum (CL). SR-BI protein expression in mouse ovary during estrous cycle was also detected. In both species, expression is concentrated in cytoplasm and periphery of follicular cells. Gonadotropins induce SR-BI expression in pig granulosa cells, with cytoplasmic expression increasing through the periovulatory period, with migration to the cell periphery as the CL matured. An 82-kDa form of SR-BI is strongly expressed in the pig CL, with the less abundant 57-kDa form, differences between forms are attributable to glycosylation. In vitro culture of pig follicles with human chorionic gonadotropin (hCG) induced time-dependent upregulation of 82-kDa SR-BI in granulosa cells. SR-BI and LDL receptor were reciprocally expressed, with the latter highest in follicular granulosa cells, declining precipitously with CL formation. To further explore mechanisms of cholesterol supply to ovarian steroidogenesis, we examined mice treated to uncouple ovulation and mice bearing null mutation of the Scarb1 gene (SR-BI-/-). Results show entrapped oocytes in luteinized structures expressed SR-BI. SR-BI-/- mice displayed small corpora lutea, large follicles with theca cells hypertrophied, follicular cysts with blood filled cavities and 50% decreased in plasma progesterone. In SR-BI-/- mice, treatment with a combination of 20 g/g of mevinolin and 100 g/g of chloroquine (CHLORO) was employed to disturbed cholesterol sources. Serum progesterone was reduced by 43% in wild type and 30% in SR-BI-/- mice. The protein expression of the rate-limiting enzyme for cholesterol synthesis, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGR) increased in SR-BI-/- mice. It was concluded that follicular cells express SR-BI during follicle development and luteinization causes upregulation of SR-BI expression. Posttranslational maturation is characterized by glycosylation. Under normal conditions expression of the LDLr (low density lipoprotein recepors) is extinguished during luteinization such that SR-BI becomes the principal means of importation of extracellular cholesterol. Further, perturbation of cholesterol de novo synthesis and uptake from LDLr in SR-BI-/- mice leads to a reduction of luteal function. Ovarian cholesterol homeostasis is central to adequate luteinization, and its perturbation leads to reduction, but not to complete impairment, of luteal function. We conclude that SR-BI expression is an important but not essential factor in maintaining ovarian cholesterol homeostasis, steroid synthesis and luteinization. A network of complementary and compensatory cholesterol supply mechanisms act in concert to assure ovarian steroid synthesis.

Comprendre les événements paracriniens qui régulent la fertilité chez la vache est nécessaire non seulement en raison de l'importance agricole de cette espèce, mais aussi pour son utilisation potentielle comme modèle chez l’humain. L'oxyde nitrique (NO), un gaz de radicaux libres, a été impliqué dans la croissance folliculaire et l'ovulation chez les rongeurs et d'autres espèces, mais chez la vache c’est une énigme fascinante : le NO est produit par les cellules de la granulosa bovine et est régulé par la FSH, mais la présence et le profil d'expression des enzymes responsables de la synthèse de NO (NOS) dans les cellules de la granulosa tout au long de la croissance folliculaire ne sont pas claires. Les objectifs de cette thèse sont: (1) élucider le mécanisme de contrôle des NOS et les conséquences de la production d'oxyde nitrique pour le fonctionnement des cellules de la granulosa au cours du développement folliculaire chez la vache et (2) déterminer la régulation des NOS pendant la cascade ovulatoire induite par LH chez les cellules de la granulosa bovine et si l'activité des NOS pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire chez cette espèce. Les résultats sont séparés en 2 articles. Dans le premier article, la régulation de NOS2 dans les cellules de la granulosa bovine a été explorée. L'abondance des ARNm codant pour NOS2 a été stimulée par la FSH et l’IGF1 en augmentant l’estradiol, et un blocage de l'action de l’estradiol a conséquemment réduit les niveaux d'ARNm codant pour NOS2. De plus, l'inhibition de l'activité des NOS a augmenté l'apoptose dans les cellules de la granulosa in vitro. Dans le second article, il a été démontré que le pic de LH induit une activation des NOS dans les cellules de la granulosa, et que l'activité de NOS induit la production de NO, ce qui est essentiel pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire induite par LH comme EREG/AREG/PTGS2. Ensemble, les résultats présentés dans ces 2 articles suggèrent que les niveaux physiologiques d'activité des NOS peuvent contribuer à la croissance et la survie des cellules de la granulosa et indiquent également que NO peut être essentiel pour l'ovulation chez les bovins. / Understanding the paracrine events that regulate fertility in the cow is necessary not only because of the agricultural importance of this species, but also its potential use as a model for humans. Nitric oxide (NO), a free-radical gas, has been implicated in follicular growth and ovulation in rodents and other species, but the cow is an intriguing enigma: NO is produced by bovine granulosa cells and is regulated by FSH, but the presence and the expression pattern in granulosa cells of the enzymes responsible for NO synthesis (NOS) throughout follicular growth are unclear. The objectives of the present thesis were (1) to elucidate the mechanism of control of NOS and the consequences of nitric oxide production for granulosa cell function during follicle development in cattle; and (2) to determine the regulation of NOS during the LH-induced ovulatory cascade in bovine granulosa cells and whether NOS activity is critical for the ovulatory cascade in this species. The results are separated in 2 articles. In the first article, the regulation of NOS2 in bovine granulosa cells was explored. Abundance of mRNA encoding NOS2 was stimulated by FSH and IGF1 through increased estradiol, and a blockade of estradiol action consequently lowered NOS2 mRNA levels. Further, inhibition of NOS activity increased apoptosis in granulosa cells in vitro. In the second article, it was demonstrated that the LH surge induces NOS activation in granulosa cells, and that NOS activity induces the production of NO, which is essential for EREG/AREG/PTGS2 expression, critical genes in the LH-induced ovulatory cascade. Together, the results presented in these 2 articles suggest that physiological levels of NOS activity may contribute to growth and survival of granulosa cells, and also indicate that NO may be essential for ovulation in cattle.

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L'ovaire est au cœur de la physiologie de la reproduction féminine. Il est à la fois à l'origine des ovocytes nécessaires à la fécondation et acteur des régulations endocrines du système reproducteur. Les ovocytes de l'ovaire fœtal sont groupés en amas bordés de cellules somatiques et d'une membrane basale, formant les cordons ovariens. Ces cordons ovariens se fragmentent pour former les follicules ovariens: un ovocyte bordé de cellules somatiques et d'une membrane basale. Cette fragmentation se déroule sur une courte période (/in utero/ chez la femme et juste après la naissance chez les rongeurs) et fait intervenir une vague de mort cellulaire programmée touchant les ovocytes pendant leur méiose et un remodelage de la membrane basale. La formation des follicules est une période cruciale du développement ovarien puisque le stock de follicules formés à l'issue de ce processus est non renouvelable. Son altération peut donc être à l'origine de troubles de la fonction de reproduction chez le futur adulte. Il existe une fragile homéostasie œstrogénique en place au moment de la formation folliculaire: chez la femme, l'ovaire se développe /in utero/, sous l'influence des œstrogènes circulants maternels et la production ovarienne fœtale. Chez les rongeurs, les follicules se forment lors de la levée de l'imprégnation hormonale maternelle au moment de la naissance. Nous avons souhaité comprendre comment le 17b-œstradiol (E2), œstrogène endogène, pouvait contribuer à la mise en place des follicules. Pour cela, des rattes Sprague-Dawley ont été traitées pendant la période de formation des follicules avec de l'E2 à différentes doses entre 0.01 et 10 µg/jour. Nos travaux démontrent que le traitement de rattes par des œstrogènes entre leur naissance et 3 jours induit une réduction dose-dépendante de leur nombre d'ovocytes. Bien que le traitement entrave le développement normal du système de détoxication hépatique et ovarien, l'animal est capable d'accroître ses capacités d'élimination des œstrogènes. Ces capacités sont toutefois insuffisantes pour bloquer les effets du traitement. Quelle que soit la dose d'E2 utilisée (0.1 ou 10 µg/jour), la puberté est plus précoce chez les femelles exposées mais toutes sont fertiles, au moins transitoirement. Cependant le traitement induit une dégradation rapide des capacités reproductives. L'E2 modifie la dynamique folliculaire chez l'adulte, longtemps après l'arrêt du traitement. Si une forte dose d'E2 réduit la survie des ovocytes lors de la formation des follicules et conduit à une infertilité secondaire due à un dysfonctionnement général du tractus reproducteur, une dose faible n'affecte pas la survie des ovocytes à court terme mais conduit à une sénescence reproductive précoce vraisemblablement d'origine ovarienne. L'origine de ces troubles pourrait résider dans les effets précoces de l'exposition à E2 : cette molécule altère le transcriptome ovarien et induit de nombreuses lésions de l'ADN des cellules ovariennes.

Résumé L’approvisionnement en cholestérol est un facteur limitant la stéroïdogenèse ovarienne. Pour cette raison, la majorité du cholestérol requis pour la synthèse des stéroïdes est importé de la circulation via les récepteurs des lipoprotéines de haute (HDL) et de basse densité (LDL) nommés scavenger receptor (SR-BI) et low-density lipoprotein receptor (LDLr). L’ARN messager de SR-BI est exprimé dans les ovaires de porcs durant toutes les étapes de la folliculogenèse ainsi que dans le corps jaune (CL). L’expression de la protéine SR-BI a également été détectée dans les follicules de souris lors du cycle œstral. Chez les deux espèces, l’expression est concentrée dans le cytoplasme et en périphérie des cellules du follicule. Les gonadotrophines induisent l'expression de SR-BI dans les cellules de la granulosa porcines, avec une expression cytoplasmique qui augmente durant la période périovulatoire, et avec une migration aux périphéries cellulaires durant la maturation du CL. Une conformation de 82 kDa de SR-BI est fortement exprimée dans le CL porcin, avec une conformation moins abondante de 57 kDa. Les différences entre les conformations sont attribuables à la glycosylation. La culture in vitro de follicules porcins avec des gonatrophines chorioniques humaines (hCG) a induit une hausse de régulation dépendante du temps du SR-BI de 82 kDa dans les cellules du granulosa. SR-BI et LDLr ont été exprimés réciproquement, avec LDLr étant le plus élévé dans les cellules folliculaires du granulosa et diminuant précipitamment avec la formation du CL. Pour explorer plus en détail les mécanismes d’approvisionnement en cholestérol de la stéroïdogenèse ovarienne, nous avons examiné des souris soumis à un traitement de désaccouplement de l'ovulation, et des souris portant la mutation nulle du gène Scarb1 (SR-BI-/-). Les résultats ont démontré que des ovocytes enfermés dans des structures lutéinisées expriment SR-BI. Les souris SR-BI-/ - présentaient de petits CLs, et de large follicules avec des cellules de thèque hypertrophiées et des kystes folliculaires avec des cavités remplies de sang et une diminution de 50% du niveau de progestérone dans le sérum. Les souris SR-BI-/ - traitées avec une combinaison de 20 g / g de mevinoline et 100  g / g de chloroquine ont démontré une diminution de 43% du niveau de progestérone sérique chez le type sauvage et de 30% chez les souris SR-BI-/ -. L’expression protéique de l’enzyme limitant pour la synthèse du cholestérol, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGR), a augmenté chez les souris SR-BI-/-. Nous avons présenté des preuves démontrant que les cellules des follicules expriment le SR-BI durant la stéroïdogenèse et que la lutéinisation augmente l’expression de SR-BI. La maturation post-transcriptionelle est caractérisée par la glycosylation. Sous des conditions normales, l’expression de LDLr est arrêtée durant la lutéinisation. Ainsi SR-BI devient le facteur principal pour l’importation du cholestérol extracellulaire. En plus, la perturbation extracellulaire du cholestérol synthétisé de novo et l’absorption par les LDLr chez les souris SR-BI-/- diminuent la fonction lutéal. L’homéostasie du cholestérol ovarien est très importante pour une lutéinisation adéquate et sa perturbation mène à une réduction, mais non à un blocage complet, de la fonction lutéal. En conclusion, l’expression de SR-BI est un facteur important, mais non essentiel, pour maintenir l’homéostasie du cholestérol ovarien et la synthèse des stéroïdes, et la lutéinisation. Un réseau de mécanismes complémentaires et compensatoires d’approvisionnement en cholestérol agit en concert pour assurer la synthèse des stéroïdes ovariens. / Abstract Ovarian cholesterol supply is rate limiting to ovarian steroidogenesis. For this reason, the majority of cholesterol required for steroid synthesis is imported via scavenger receptor-BI (SR-BI) and the low-density lipoprotein (LDL) receptor from circulating HDL and LDL. SR-BI mRNA is expressed in pig ovaries at all stages of folliculogenesis and in the corpus luteum (CL). SR-BI protein expression in mouse ovary during estrous cycle was also detected. In both species, expression is concentrated in cytoplasm and periphery of follicular cells. Gonadotropins induce SR-BI expression in pig granulosa cells, with cytoplasmic expression increasing through the periovulatory period, with migration to the cell periphery as the CL matured. An 82-kDa form of SR-BI is strongly expressed in the pig CL, with the less abundant 57-kDa form, differences between forms are attributable to glycosylation. In vitro culture of pig follicles with human chorionic gonadotropin (hCG) induced time-dependent upregulation of 82-kDa SR-BI in granulosa cells. SR-BI and LDL receptor were reciprocally expressed, with the latter highest in follicular granulosa cells, declining precipitously with CL formation. To further explore mechanisms of cholesterol supply to ovarian steroidogenesis, we examined mice treated to uncouple ovulation and mice bearing null mutation of the Scarb1 gene (SR-BI-/-). Results show entrapped oocytes in luteinized structures expressed SR-BI. SR-BI-/- mice displayed small corpora lutea, large follicles with theca cells hypertrophied, follicular cysts with blood filled cavities and 50% decreased in plasma progesterone. In SR-BI-/- mice, treatment with a combination of 20 g/g of mevinolin and 100 g/g of chloroquine (CHLORO) was employed to disturbed cholesterol sources. Serum progesterone was reduced by 43% in wild type and 30% in SR-BI-/- mice. The protein expression of the rate-limiting enzyme for cholesterol synthesis, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGR) increased in SR-BI-/- mice. It was concluded that follicular cells express SR-BI during follicle development and luteinization causes upregulation of SR-BI expression. Posttranslational maturation is characterized by glycosylation. Under normal conditions expression of the LDLr (low density lipoprotein recepors) is extinguished during luteinization such that SR-BI becomes the principal means of importation of extracellular cholesterol. Further, perturbation of cholesterol de novo synthesis and uptake from LDLr in SR-BI-/- mice leads to a reduction of luteal function. Ovarian cholesterol homeostasis is central to adequate luteinization, and its perturbation leads to reduction, but not to complete impairment, of luteal function. We conclude that SR-BI expression is an important but not essential factor in maintaining ovarian cholesterol homeostasis, steroid synthesis and luteinization. A network of complementary and compensatory cholesterol supply mechanisms act in concert to assure ovarian steroid synthesis. / Studies were funded by Colegio de Postgraduados, México. CONACyT, México. SRE, México. Ministère de l’Éducation du Québec, University of Montreal and an Operating Grant to B.D. Murphy from the Canadian Institutes of Health Research.

Alors que le protéome de l'ovocyte isolé, aux stades VG et MII a déjà été étudié, celui du follicule en croissance n'a jamais été décrit.Dans cette étude, nous avons cherché à identifier, comparer et caractériser les profils protéiques de follicules ovariens de souris à trois stades de leur développement in vitro distincts morphologiquement : follicules secondaires en début de culture - stade initial (IS), follicules avec une rupture complète de la membrane de Slavjanski (RMS) et follicules avec une cavité similaire à l'antrum (FA).Après un préfractionnement par IEF et une analyse LC-MS/MS en deux configurations (1D et 2D), 1403 protéines ont pu être identifiées dans le follicule ovarien de souris. 43,4 % (609) des protéines identifiées étaient communes aux trois stades et d'autres ont été identifiées uniquement à un stade : 71 au stade IS, 182 au stade RMS et 193 au stade FA. De plus, on a identifié 365 protéines qui n'avaient pas été décrites antérieurement dans le protéome de l'ovocyte ce qui pourrais indiquer qu'elles sont exprimées dans les cellules somatiques du follicule. Des analyses qualitatives et quantitatives complémentaires ont démontré une surreprésentation pour 44 fonctions biologiques par rapport aux fonctions biologiques des gènes constituant le génome de Mus musculus et mis en évidence des différences d'expression et d'abondance des protéines liées au cycle cellulaire, à la fixation des ions de calcium et à la glycolyse selon le stade de développement. Ces résultats représentent un point de départ pour beaucoup d'autres études de caractérisation moléculaire du développement folliculaire.

Comprendre les événements paracriniens qui régulent la fertilité chez la vache est nécessaire non seulement en raison de l'importance agricole de cette espèce, mais aussi pour son utilisation potentielle comme modèle chez l’humain. L'oxyde nitrique (NO), un gaz de radicaux libres, a été impliqué dans la croissance folliculaire et l'ovulation chez les rongeurs et d'autres espèces, mais chez la vache c’est une énigme fascinante : le NO est produit par les cellules de la granulosa bovine et est régulé par la FSH, mais la présence et le profil d'expression des enzymes responsables de la synthèse de NO (NOS) dans les cellules de la granulosa tout au long de la croissance folliculaire ne sont pas claires. Les objectifs de cette thèse sont: (1) élucider le mécanisme de contrôle des NOS et les conséquences de la production d'oxyde nitrique pour le fonctionnement des cellules de la granulosa au cours du développement folliculaire chez la vache et (2) déterminer la régulation des NOS pendant la cascade ovulatoire induite par LH chez les cellules de la granulosa bovine et si l'activité des NOS pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire chez cette espèce. Les résultats sont séparés en 2 articles. Dans le premier article, la régulation de NOS2 dans les cellules de la granulosa bovine a été explorée. L'abondance des ARNm codant pour NOS2 a été stimulée par la FSH et l’IGF1 en augmentant l’estradiol, et un blocage de l'action de l’estradiol a conséquemment réduit les niveaux d'ARNm codant pour NOS2. De plus, l'inhibition de l'activité des NOS a augmenté l'apoptose dans les cellules de la granulosa in vitro. Dans le second article, il a été démontré que le pic de LH induit une activation des NOS dans les cellules de la granulosa, et que l'activité de NOS induit la production de NO, ce qui est essentiel pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire induite par LH comme EREG/AREG/PTGS2. Ensemble, les résultats présentés dans ces 2 articles suggèrent que les niveaux physiologiques d'activité des NOS peuvent contribuer à la croissance et la survie des cellules de la granulosa et indiquent également que NO peut être essentiel pour l'ovulation chez les bovins. / Understanding the paracrine events that regulate fertility in the cow is necessary not only because of the agricultural importance of this species, but also its potential use as a model for humans. Nitric oxide (NO), a free-radical gas, has been implicated in follicular growth and ovulation in rodents and other species, but the cow is an intriguing enigma: NO is produced by bovine granulosa cells and is regulated by FSH, but the presence and the expression pattern in granulosa cells of the enzymes responsible for NO synthesis (NOS) throughout follicular growth are unclear. The objectives of the present thesis were (1) to elucidate the mechanism of control of NOS and the consequences of nitric oxide production for granulosa cell function during follicle development in cattle; and (2) to determine the regulation of NOS during the LH-induced ovulatory cascade in bovine granulosa cells and whether NOS activity is critical for the ovulatory cascade in this species. The results are separated in 2 articles. In the first article, the regulation of NOS2 in bovine granulosa cells was explored. Abundance of mRNA encoding NOS2 was stimulated by FSH and IGF1 through increased estradiol, and a blockade of estradiol action consequently lowered NOS2 mRNA levels. Further, inhibition of NOS activity increased apoptosis in granulosa cells in vitro. In the second article, it was demonstrated that the LH surge induces NOS activation in granulosa cells, and that NOS activity induces the production of NO, which is essential for EREG/AREG/PTGS2 expression, critical genes in the LH-induced ovulatory cascade. Together, the results presented in these 2 articles suggest that physiological levels of NOS activity may contribute to growth and survival of granulosa cells, and also indicate that NO may be essential for ovulation in cattle.