Trabalho realizado no LEPAE-Laboratory for Process, Environmental and Energy Engineering - Department of Chemical Engineering - Faculty of Engineering, Univerty of Oporto / Tese de Doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Staphylococcus aureus e Streptococcus uberis são dois patógenos causadores mastite bovina que podem apresentar capacidade de produção de biofilme, o que pode resultar em infecções intramamárias crônicas, menor resposta à terapia, redução de produção de leite e maior risco de descarte das vacas infectadas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a: 1) capacidade de formação de biofilme de S. aureus e S. uberis isolados de vacas com mastite clínica (MC) e subclínica (MSC); 2) sensibilidade in vitro e a multirresistência destes agentes a antimicrobianos selecionados (n=12); 3) associação entre a capacidade de formação de biofilme e resistência aos antimicrobianos de S. aureus e S. uberis. Um total de 197 cepas S. aureus e 128 S. uberis foram isoladas a partir de amostras de leite de vacas com MSC e MC, oriundas de 24 rebanhos. Os isolados de S. aureus e S. uberis foram avaliados quanto a capacidade de formação de biofilme pelo método??? e a sensibilidade in vitro aos antimicrobianos foi determinada pela técnica de disco difusão em ágar. A capacidade de formação de biofilme foi classificada em 4 categorias: forte, moderado, fraco e não formador de biofilme. Do total de cepas avaliadas, S. aureus (54,8%) e S. uberis (52,9%) apresentaram capacidade de formação de biofilme (forte, moderado ou fraco). Entre os isolados de S. aureus formadores de biofilme, a frequência de distribuição dos isolados foi de 19,3% na categoria forte, 18,8% moderado, e 16,7% na categoria fraco. Para os isolados de S. uberis, a frequência de distribuição entre as categorias de formação de biofilme foi 17,6% forte, 25,2% moderado, 17,6% fraco. Dentre as cepas de S. aureus isoladas de casos de MC, 55,8% foram classificados como forte formador de biofilme, enquanto 7,6% das cepas isoladas de MSC apresentaram capacidade de formação de biofilme. Todos os isolados de S. uberis (n=30; 100%) provenientes de MC apresentaram capacidade de formação de biofilme na categoria moderado. Quanto à sensibilidade aos antimicrobianos, os isolados de S. aureus apresentaram resistência à penicilina (92,9%), ampicilina (50,8%) e tetraciclina (18,3%); e os isolados de S. uberis apresentaram resistência à penicilina (86,5%), oxacilina (85,5%), tetraciclina (37,5%). Os isolados de S. aureus apresentaram maior chance de resistência aos antimicrobianos ampicilina, tetraciclina e ceftiofur que S. uberis. Em conclusão, S. aureus e S. uberis apresentam elevada capacidade de produção de biofilme, mas não houve interação entre a característica de multirresistência e formação de biofilme. Isolados de S. aureus e S. uberis foram altamente resistentes aos antimicrobianos das classes de beta-lactâmicos e tetraciclinas. / Staphylococcus aureus and Streptococcus uberis are both mastitis causing pathogens that can present ability to produce biofilm, which can result in chronic intramammary infection, reduced response to the therapy, reduction of milk yield, and greater risk of cows\' culling. The objectives of this study were to evaluate the: 1) biofilm-forming capacity of S. aureus and S. uberis isolated from clinical (CM) and subclinical mastitis (SCM); in vitro sensibility and multi-resistance of these agents to the antimicrobials; 3) association between the biofilm-forming capacity and antimicrobial resistance. A total of 197 S. aureus and 128 S. uberis were isolated from milk samples collected from cows with SCM and CM from 24 dairy herds. The biofilm-forming ability were classified in 4 categories: strong, moderate, weak, and non-biofilm producers. Of all isolates evaluated, S. aureus (54.8%) and S. uberis (52.9%) presented biofilm-forming ability (strong, moderate or weak). Among the biofilm-forming isolates, the frequency of distribution of S. aureus was 19.3% for the strong, 18.8% for the moderate, and 16.7% for the weak categories. For the S. uberis isolates, the frequency of distribution among the biofilm-forming categories was 17.6% strong, 25.2% moderate, and 17.6% weak. In relation to the mastitis presentation form, the strong biofilm-forming category had 55.8% of S. aureus isolates from CM cases; and among all biofilm-forming categories, the strong category was the one with the higher number of isolates of S. aureus (n=43; 19,2%). All S. uberis isolates (n=30; 100%) from CM presented moderate biofilm-forming ability. In relation to the antimicrobial susceptibility, the isolates of S. aureus were resistant to penicillin (92.9%), ampicillin (50.8%) and tetracycline (18.3%); and the isolates of S. uberis presented resistance to penicillin (86.5%), oxacillin (85.5%) and tetracycline (37.5%). The isolates of S. aureus and S. uberis, S. aureus had higher odds to be resistant to ampicillin, tetracycline and ceftiofur than S. uberis. In conclusion, S. aureus and S. uberis presented high ability of production of biofilm, but there was no interaction between multi-resistance and biofilm production ability. Isolates of S. aureus and S. uberis were highly resistant to antimicrobials of the class of beta lactams and tetracycline.

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Another important characteristic is its capacity to regulate or to acquire antibiotic resistance, specifically through oxacilinases, encoded by the gene OXA, that presents potent hydrolytic activity against penicilinase-resistant penicillins. Until the moment, 250 types of OXA were already described. The expression of OXA genes can be increased in the presence of the insertion element ISAba1, which when located upstream of the gene, confer a selective advantage for the isolate when this depends on the efficient expression of a variety of resistance genes. In its absence, the resistance is usually expressed in the presence of two or more OXA genes. The capacity of biofilm formation and the presence of the genes blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA- 51, OXA-58 and ISAba1 were investigated among 84 isolates from 64 patients of the Intensive Care Units of Goiânia. It was observed that 78.5% of the isolates formed biofilm, of which 23% presented the gene blaPER-1. The presence of OXA-51 gene was detected in all isolates, whereas 64.3% of the isolates had the OXA-23 gene and 24.0% of the isolates had the OXA-58 gene. The ISAba1 gene was detected upstream of the OXA-51, OXA-23 and OXA-58 genes in 33.3% (28/84), 92.6% (50/54) and 10.0% (2/20) of the isolates, respectively. None of the isolates studied presented the gene OXA-40. Of the 62 isolates resistant to imipenem and meropenem, 76.0% possessed the OXA-23 gene while 24.2% of the isolates possessed the OXA-58 gene. Of these isolates, 79.0% (49/62) presented the gene ISAba1. In the present study, the blaPER-1 gene presence was not associated with the biofilm formation, while the presence of OXA genes was related to resistance in Acinetobacter baumannii. / A espécie Acinetobacter baumannii é a representante mais importante do gênero, sendo considerado o patógeno de maior relevância, dentro do complexo A. baumannii – A. calcoaceticus, para as instituições de saúde mundialmente. Sua importância clínica tem aumentado nos últimos anos em parte devido a sua notável capacidade de aderência a superfícies devido a presença de estruturas como pili, produção de EPS (exopolissacarídeo) e presença de genes que favorecem a formação de biofilme, proporcionando maior adesão entre as células e consequente resistência aos antimicrobianos. Outro destaque é sua capacidade de regular ou adquirir resistência, em particular por meio das oxacilinases, codificadas pelo gene OXA, que apresentam atividade hidrolítica potente contra penicilinas resistentes às penicilinases. Até o momento, 250 tipos de OXA já foram descritas. A expressão de genes OXA pode ser aumentada na presença do elemento de inserção ISAba1, localizado à montante do gene, conferindo uma vantagem seletiva para o isolado quando este depende da expressão eficiente de uma variedade de genes de resistência a antibióticos. Na sua ausência, a resistência geralmente é expressa na presença de dois ou mais genes OXA. A capacidade de formar biofilme e a presença dos genes blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA-58 e ISAba1 foram investigados em 84 isolados provenientes de 64 pacientes de UTIs de Goiânia. Observou-se que 78,5% dos isolados formaram biofilme, dos quais 23% apresentaram o gene blaPER-1. A presença do gene OXA-51 foi detectada em todos os isolados, enquanto que 64,3% dos isolados apresentavam o gene OXA-23, e em 24% dos isolados foi encontrado o gene OXA-58. O gene ISAba1 foi detectado à montante dos genes OXA-51, OXA-23 e OXA-58, em 33,3% (28/84), 92,6% (50/54) e 10% (2/20) dos isolados, respectivamente. Nenhum isolado estudado apresentou o gene OXA-40. Dos 62 isolados resistentes ao imipenem e meropenem, 76% dos isolados possuíam o gene OXA-23 enquanto que 24,2% possuíam o gene OXA-58. Dentre estes isolados, 79% (49/62) apresentaram a sequência de inserção ISAba1. No presente estudo, a presença do gene blaPER-1 não foi associada com a formação de biofilmes, enquanto que a presença de genes OXA estava relacionada à resistência em Acinetobacter baumannii.

Staphylococcus aureus e Streptococcus uberis são dois patógenos causadores mastite bovina que podem apresentar capacidade de produção de biofilme, o que pode resultar em infecções intramamárias crônicas, menor resposta à terapia, redução de produção de leite e maior risco de descarte das vacas infectadas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a: 1) capacidade de formação de biofilme de S. aureus e S. uberis isolados de vacas com mastite clínica (MC) e subclínica (MSC); 2) sensibilidade in vitro e a multirresistência destes agentes a antimicrobianos selecionados (n=12); 3) associação entre a capacidade de formação de biofilme e resistência aos antimicrobianos de S. aureus e S. uberis. Um total de 197 cepas S. aureus e 128 S. uberis foram isoladas a partir de amostras de leite de vacas com MSC e MC, oriundas de 24 rebanhos. Os isolados de S. aureus e S. uberis foram avaliados quanto a capacidade de formação de biofilme pelo método??? e a sensibilidade in vitro aos antimicrobianos foi determinada pela técnica de disco difusão em ágar. A capacidade de formação de biofilme foi classificada em 4 categorias: forte, moderado, fraco e não formador de biofilme. Do total de cepas avaliadas, S. aureus (54,8%) e S. uberis (52,9%) apresentaram capacidade de formação de biofilme (forte, moderado ou fraco). Entre os isolados de S. aureus formadores de biofilme, a frequência de distribuição dos isolados foi de 19,3% na categoria forte, 18,8% moderado, e 16,7% na categoria fraco. Para os isolados de S. uberis, a frequência de distribuição entre as categorias de formação de biofilme foi 17,6% forte, 25,2% moderado, 17,6% fraco. Dentre as cepas de S. aureus isoladas de casos de MC, 55,8% foram classificados como forte formador de biofilme, enquanto 7,6% das cepas isoladas de MSC apresentaram capacidade de formação de biofilme. Todos os isolados de S. uberis (n=30; 100%) provenientes de MC apresentaram capacidade de formação de biofilme na categoria moderado. Quanto à sensibilidade aos antimicrobianos, os isolados de S. aureus apresentaram resistência à penicilina (92,9%), ampicilina (50,8%) e tetraciclina (18,3%); e os isolados de S. uberis apresentaram resistência à penicilina (86,5%), oxacilina (85,5%), tetraciclina (37,5%). Os isolados de S. aureus apresentaram maior chance de resistência aos antimicrobianos ampicilina, tetraciclina e ceftiofur que S. uberis. Em conclusão, S. aureus e S. uberis apresentam elevada capacidade de produção de biofilme, mas não houve interação entre a característica de multirresistência e formação de biofilme. Isolados de S. aureus e S. uberis foram altamente resistentes aos antimicrobianos das classes de beta-lactâmicos e tetraciclinas. / Staphylococcus aureus and Streptococcus uberis are both mastitis causing pathogens that can present ability to produce biofilm, which can result in chronic intramammary infection, reduced response to the therapy, reduction of milk yield, and greater risk of cows\' culling. The objectives of this study were to evaluate the: 1) biofilm-forming capacity of S. aureus and S. uberis isolated from clinical (CM) and subclinical mastitis (SCM); in vitro sensibility and multi-resistance of these agents to the antimicrobials; 3) association between the biofilm-forming capacity and antimicrobial resistance. A total of 197 S. aureus and 128 S. uberis were isolated from milk samples collected from cows with SCM and CM from 24 dairy herds. The biofilm-forming ability were classified in 4 categories: strong, moderate, weak, and non-biofilm producers. Of all isolates evaluated, S. aureus (54.8%) and S. uberis (52.9%) presented biofilm-forming ability (strong, moderate or weak). Among the biofilm-forming isolates, the frequency of distribution of S. aureus was 19.3% for the strong, 18.8% for the moderate, and 16.7% for the weak categories. For the S. uberis isolates, the frequency of distribution among the biofilm-forming categories was 17.6% strong, 25.2% moderate, and 17.6% weak. In relation to the mastitis presentation form, the strong biofilm-forming category had 55.8% of S. aureus isolates from CM cases; and among all biofilm-forming categories, the strong category was the one with the higher number of isolates of S. aureus (n=43; 19,2%). All S. uberis isolates (n=30; 100%) from CM presented moderate biofilm-forming ability. In relation to the antimicrobial susceptibility, the isolates of S. aureus were resistant to penicillin (92.9%), ampicillin (50.8%) and tetracycline (18.3%); and the isolates of S. uberis presented resistance to penicillin (86.5%), oxacillin (85.5%) and tetracycline (37.5%). The isolates of S. aureus and S. uberis, S. aureus had higher odds to be resistant to ampicillin, tetracycline and ceftiofur than S. uberis. In conclusion, S. aureus and S. uberis presented high ability of production of biofilm, but there was no interaction between multi-resistance and biofilm production ability. Isolates of S. aureus and S. uberis were highly resistant to antimicrobials of the class of beta lactams and tetracycline.

Este projeto estudou a influência do substrato na dinâmica do processo de formação do biofilme em espuma de poliuretano, em reatores anaeróbios horizontais de leito fixo diferenciais, alimentados com extrato de carne, glicose, amido, lipídeos e esgoto sanitário sintético. O estudo constitui em acompanhar a colonização das matrizes de espuma, ao longo do tempo, em relação a quantidade de biomassa aculumada, polímero extracelular produzido e características morfológicas das células presentes nos suportes retirados dos reatores diferenciais. O uso dessas técnicas permitiu o melhor entendimento do processo de aderência, além da verificação da composição morfológica e a estrutura do biofilme aderido ao suporte, possibilitando correlacionar a ocorrência de determinadas morfologias com cada etapa da colonização observada. A influência do substrato na dinâmica de aderência foi verificada devido aos diferentes padrões de colonização encontrados. Foi observada uma grande variabilidade morfológica em relação ao substrato utilizado. Todavia, uma grande ocorrência de organismos semelhantes a Methanosaeta sp foi verificada em todos os ciclos, principalmente em relação a Methanosarcina sp. O fenômeno de excreção de polímeros pareceu ser de fundamental importância no processo de colonização de matrizes de poliuretano, estando vinculado provavelmente à fixação das células aos suportes. A produção de polímeros, na etapa de aderência inicial, apresentou comportamento diferenciado para cada substrato utilizado. De acordo com os modelos propostos e as análises de microscopia eletrônica de varredura, verificou-se que os polímeros extracelulares podem estar ligados ao entupimento de reatores de leito fixo, permanecendo no interior dos suportes e nos interstícios do leito, causando problemas operacionais. As rápidas partidas observadas em trabalhos utilizando reatores de leito fixo e espuma de poliuretano como suporte podem estar vinculadas à rápida aderência dos organismos em todos os ciclos estudados. / This work focused on the influence of the type of substrate on the process of biofilm formation onto polyurethane foam matrices, in differential horizontal anaerobic immobilized sludge reactors, fed with meat extract (protein), glucose, starch, lipid and synthetic domestic wastewater. It consisted of accompanying the colonization of foam matrices with time, regarding to biomass amount, extracellular polymers produced and the morphological characteristics of the cells present on the supports packed in the differential reactors. These techniques permitted a better understanding of the adhesion process, besides a verification of the morphological composition and the structure of the biofilm attached to the support, making possible a correlation of the particular morphologies occurrences with each colonization step. The influence of the substrate was verified due to the different colonization patterns found. It was observed considerable morphological variety depending on the substrate utilized. However, the presence of Methanosaeta sp.- like organisms was often verified in all cycles, specially Methanosarcina sp. The excretion of polymers seemed to be crucial in the colonization process of the polyurethane matrices, being probably related to the cell fixation on the support. The polymeric production, in the inital adhesion step, showed a particular behavior for each substrate employed. According to the proposed models and the scanning electronic microscopy analysis, it was verified that the extracellular polymers can be related to the clogging of the fixed-bed reactors, as it keeps into the supports and the bed interstices, causing operational problems. The fast start-ups observed in works using fixed-bed reactors and polyurethane foam as support can be related to the fast cell adhesion during all cycles studied.

Este projeto estudou a influência do substrato na dinâmica do processo de formação do biofilme em espuma de poliuretano, em reatores anaeróbios horizontais de leito fixo diferenciais, alimentados com extrato de carne, glicose, amido, lipídeos e esgoto sanitário sintético. O estudo constitui em acompanhar a colonização das matrizes de espuma, ao longo do tempo, em relação a quantidade de biomassa aculumada, polímero extracelular produzido e características morfológicas das células presentes nos suportes retirados dos reatores diferenciais. O uso dessas técnicas permitiu o melhor entendimento do processo de aderência, além da verificação da composição morfológica e a estrutura do biofilme aderido ao suporte, possibilitando correlacionar a ocorrência de determinadas morfologias com cada etapa da colonização observada. A influência do substrato na dinâmica de aderência foi verificada devido aos diferentes padrões de colonização encontrados. Foi observada uma grande variabilidade morfológica em relação ao substrato utilizado. Todavia, uma grande ocorrência de organismos semelhantes a Methanosaeta sp foi verificada em todos os ciclos, principalmente em relação a Methanosarcina sp. O fenômeno de excreção de polímeros pareceu ser de fundamental importância no processo de colonização de matrizes de poliuretano, estando vinculado provavelmente à fixação das células aos suportes. A produção de polímeros, na etapa de aderência inicial, apresentou comportamento diferenciado para cada substrato utilizado. De acordo com os modelos propostos e as análises de microscopia eletrônica de varredura, verificou-se que os polímeros extracelulares podem estar ligados ao entupimento de reatores de leito fixo, permanecendo no interior dos suportes e nos interstícios do leito, causando problemas operacionais. As rápidas partidas observadas em trabalhos utilizando reatores de leito fixo e espuma de poliuretano como suporte podem estar vinculadas à rápida aderência dos organismos em todos os ciclos estudados. / This work focused on the influence of the type of substrate on the process of biofilm formation onto polyurethane foam matrices, in differential horizontal anaerobic immobilized sludge reactors, fed with meat extract (protein), glucose, starch, lipid and synthetic domestic wastewater. It consisted of accompanying the colonization of foam matrices with time, regarding to biomass amount, extracellular polymers produced and the morphological characteristics of the cells present on the supports packed in the differential reactors. These techniques permitted a better understanding of the adhesion process, besides a verification of the morphological composition and the structure of the biofilm attached to the support, making possible a correlation of the particular morphologies occurrences with each colonization step. The influence of the substrate was verified due to the different colonization patterns found. It was observed considerable morphological variety depending on the substrate utilized. However, the presence of Methanosaeta sp.- like organisms was often verified in all cycles, specially Methanosarcina sp. The excretion of polymers seemed to be crucial in the colonization process of the polyurethane matrices, being probably related to the cell fixation on the support. The polymeric production, in the inital adhesion step, showed a particular behavior for each substrate employed. According to the proposed models and the scanning electronic microscopy analysis, it was verified that the extracellular polymers can be related to the clogging of the fixed-bed reactors, as it keeps into the supports and the bed interstices, causing operational problems. The fast start-ups observed in works using fixed-bed reactors and polyurethane foam as support can be related to the fast cell adhesion during all cycles studied.

A inibição do quorum sensing (QS) altera a comunicação bacteriana, reduzindo a expressão de fatores de virulência e a formação de biofilmes, o que pode conferir menor pressão seletiva em comparação aos antibióticos tradicionais. As frutas e hortaliças constituem uma fonte rica em compostos com propriedades potenciais de inibição do QS. Entretanto, há pouca referência sobre o potencial de pimentas do gênero Capsicum e de seus compostos isolados como inibidores do QS. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos orgânicos obtidos das variedades de pimenta-malagueta e pimentão vermelho sobre o sistema QS dependente do sinalizador AI-1 (acil homoserina lactona - AHL) em bactérias Gram-negativas. Os extratos foram obtidos por extração em fase sólida e separados em uma fração metanólica e outra amônica; sendo os compostos característicos identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e pela curva de crescimento de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. O efeito anti-QS dos extratos foi avaliado pelos testes de difusão em ágar e quantificação da produção de violaceína em meio líquido por C. violaceum e sobre a formação de biofilme, avaliado pelo ensaio de cristal violeta e microscopia confocal, em S. liquefaciens e P. aeruginosa nas temperaturas 30 ºC e 37 ºC. Os resultados obtidos pela CLAE indicaram que o extrato metanólico de pimenta-malagueta (EMPM) continha capsaicinoides como a capsaicina e dihidrocapsaicina, luteolina e outros compostos não identificados; já o extrato amônico desta não continha os compostos capsaicinoides. Ambos os extratos de pimentão vermelho continham luteolina e compostos não identificados, mas não apresentaram capsaicinoides. Como o EMPM era representativo dos demais extratos, por conter tanto capsaicinóides quanto luteolina, o foco deste trabalho foi avaliar os efeitos do EMPM sobre fenótipos microbianos nas concentrações 5; 2,5; 1,25 e 0,625 mg/ml, além de utilizar a capsaicina como controle comparativo em concentrações equivalentes às do extrato (25, 50 e 100 µg/ml). Os resultados da atividade antimicrobiana mostraram inibição parcial do crescimento das bactérias nas concentrações sub-MIC (MIC >5 mg/ml) de 5 e 2,5 mg/ml de EMPM. A capsaicina também inibiu parcialmente o crescimento das bactérias a 100 µg/ml, com exceção de S. liquefaciens a 37 ºC, cujo crescimento foi induzido em 50 e 25 µg/ml. A produção de violaceína foi reduzida pelo EMPM a 1,25 e 0,625 mg/ml, sem afetar o crescimento de C. violaceum. Ensaios com C. violaceum CV026, estirpe biosensora capaz de produzir o pigmento na presença de AI-1 exógeno, sugerem que o possível mecanismo de atuação do extrato sobre o sistema QS em C. violaceum 12472 é sobre a síntese do sinalizador, já que não foi observada inibição da produção de violaceína em CV026 pelo extrato. Contrariamente, a capsaicina incrementou a produção do pigmento na estirpe 12472, mas ensaios com a estirpe CV026 indicaram que a capsaicina não atua como sinalizador do QS, uma vez que esta não induziu a produção de violaceína nesta estirpe. Já a formação de biofilme foi incrementada na presença do EMPM, sendo consideravelmente maior em P. aeruginosa a 30 ºC. Igualmente, observou-se indução da formação de biofilme por capsaicina em S. liquefaciens (37 ºC) e P. aeruginosa (30 ºC). Porém, a capsaicina não teve efeito sobre a formação de biofilme de S. liquefaciens quando cultivada a 30 ºC, nem P. aeruginosa a 37 ºC. Os resultados revelam que a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472 é inibida pelo EMPM, mas não pela capsaicina. Já, o EMPM e a capsaicina, de forma geral, não inibem a formação de biofilme de S. liquefaciens MG1 nem P. aeruginosa PAO1. Outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos pelos quais o EMPM e a capsaicina agem sobre os fenótipos avaliados neste trabalho. / Quorum sensing inhibition alters bacterial communication by reducing virulence factors expression and biofilm formation, exerting less selective pressure compared to antibiotics. Fruits and vegetables are rich sources of compounds with potential QS-inhibition properties. However, there are few references about the potential of peppers belonging to the genus Capsicum and its isolated compounds as QS inhibitors. This study aimed to assess the effect of organic extracts obtained from Capsicum varieties, pimenta-malagueta (red chili) and pimentão vermelho (red bell pepper), on the AI-1 dependent QS system. The extracts were obtained by solid phase extraction and split into a methanolic and an ammonic fraction. Characteristic compounds were identified and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The antimicrobial activity of the extracts was assessed by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) and the growth curve of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. The anti-QS effect of the extracts was evaluated by the agar diffusion assay and the quantification of violacein production was assessed in liquid medium by C. violaceum, as well as in the biofilm formation test determined by the crystal violet assay and confocal microscopy with S. liquefaciens and P. aeruginosa at 30 ºC and 37 ºC. HPLC results showed that the methanolic extract of pimenta-malagueta (EMPM) contained capsaicinoids such as capsaicin and dihidrocapsaicin, luteolin and other unidentified compounds in lower concentrations; while its ammonic extract did not have capsaicinoids. Both pimentão vermelho extracts contained luteolin and other unidentified compounds in low concentrations, but they did not contain capsaicinoids. As EMPM was representative among the extracts because it contained capsaicinoids and luteolin, the focus of this work was to assess the effect of EMPM over microbial phenotypes at concentrations of 5, 2.5, 1.25 and 0.625 mg/ml, using capsaicin as a comparative control at equivalent concentrations to those in EMPM (25, 50 and 100 µg/ml). Antimicrobial activity assays showed a partial inhibition growth of bacteria at sub-MIC concentrations (MIC >5 mg/ml) of EMPM at 5 and 2.5 mg/ml. Similarly, capsaicin partially inhibited bacterial growth at 100 µg/ml, except for S. liquefaciens at 37 ºC in which growth was induced at 50 and 25 µg/ml. Violacein production was reduced by EMPM at 1,25 and 0,625 mg/ml without affecting C. violaceum growth. Assays with C. violaceum CV026, a biosensor strain that produces violacein in the presence of exogenous AI-1, suggest that EMPM reduced violacein production in C. violaceum 12472 by interfering with the AI-1 synthesis. In contrast, capsaicin incremented violacein synthesis in strain 12472, but experiments with strain CV026 revealed that capsaicin does not function as an analog of AI-1. Biofilm formation was increased in EMPM presence, being remarkably superior in P. aeruginosa cultivated at 30 ºC, as opposed to cultivation at 37 ºC. Similarly, capsaicin induced biofilm formation in S. liquefaciens (37 ºC) and P. aeruginosa (30 ºC). However, capsaicin did not affect biofilm formation on S. liquefaciens cultured at 30 ºC, neither on P. aeruginosa at 37 ºC. These results show that violacein production in C. violaceum ATCC 12472 is inhibited by EMPM, but not by capsaicin. In general, EMPM and capsaicin did not inhibit biofilm formation in S. liquefaciens MG1 neither in P. aeruginosa PAO1. More studies are necessary to elucidate the mechanisms by which EMPM and capsaicin affect the studied phenotypes in this work.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-01Bitstream added on 2014-06-13T19:43:46Z : No. of bitstreams: 1 storti_a_dr_arafcf.pdf: 1083866 bytes, checksum: 46bd528115c854e2d63db0b4111bbd28 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Os cateteres venosos centrais são muito usados nas Unidades de Terapia Intensiva (UTIs). O seu uso está freqüentemente associado a complicações incluindo infecções fatais. Durante o período de janeiro de 2004 a janeiro de 2005, foram analisadas 118 pontas de cateteres e 42 amostras de sangue provenientes de 100 pacientes hospitalizados em Unidade de Terapia Intensiva de um hospital da região Noroeste do estado de São Paulo. O objetivo deste estudo foi analisar, por meio de cultura e microscopia eletrônica de varredura, a colonização do cateter intravenoso central de vialon Intracath de lúmem único. Para detectar a produção de slime dos microrganismos isolados foi usado o método de Christensen et al., (1985) e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com o (NCCLS-M2-A7-2000). Das 118 pontas de cateteres estudadas pelo método semi-quantitativo, 34 (28,8%) estavam colonizadas (d15 UFC/placa) em que foram isolados 55 microrganismos. Desses, 32 (58,2%) foram classificados como Gram-positivos com freqüência maior para 15 (27,3%) Staphylococcus aureus, seis (10,9%) Staphylococcus epidermidis; 19 (34,5%) classificados como Gram-negativos com freqüência maior para seis (10,9%) Acinetobacter baumannii, três (5,4%) Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes respectivamente e ainda quatro (7,3%) classificadas como leveduras sendo duas (3,6%) Candida albicans e duas (3,6%) Candida parapsilosis.... / The aim of the present study was to evaluate the hepatotoxicity, pharmacokinetic parameters and biotransformation of isoniazid when rats were treated with isoniazid (INH); rifampicin (RMP); and INH + RMP. Daily doses of the tuberculostatic drugs were administrated intragastrically to the animals (Wistar rats) for one period of 21 days as follow: sterile water (group I, control); INH (100mg/Kg) (group II), RMP (100mg/Kg) (group III); INH (100mg/Kg) + RMP (100mg/Kg) (group IV). The serum levels of the biomarkers aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were determined before the administration of the drugs (basal) and after the 21 days treatments. On day 21, blood samples were obtained before and 15þ; 30þ; 45þ; 60þ; 1,5; 3h; 6h; 12h and 24 hours after the dose. (five animals for each point). The blood samples were deproteinized with 10% trichloroacetic acid, derivatized by 1% cinnamaldehyde and analyzed by liquid chromatograph. For the determination of the acetylated metabolites acetylisoniazid (AcINH) and acetylhydrazine (AcHz) a previous hydrolysis with 6 M hydrochloride acid was performed. The results are presented as mean and SEM. ...(Complete abstract, click electronic address below).

A inibição do quorum sensing (QS) altera a comunicação bacteriana, reduzindo a expressão de fatores de virulência e a formação de biofilmes, o que pode conferir menor pressão seletiva em comparação aos antibióticos tradicionais. As frutas e hortaliças constituem uma fonte rica em compostos com propriedades potenciais de inibição do QS. Entretanto, há pouca referência sobre o potencial de pimentas do gênero Capsicum e de seus compostos isolados como inibidores do QS. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos orgânicos obtidos das variedades de pimenta-malagueta e pimentão vermelho sobre o sistema QS dependente do sinalizador AI-1 (acil homoserina lactona - AHL) em bactérias Gram-negativas. Os extratos foram obtidos por extração em fase sólida e separados em uma fração metanólica e outra amônica; sendo os compostos característicos identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e pela curva de crescimento de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. O efeito anti-QS dos extratos foi avaliado pelos testes de difusão em ágar e quantificação da produção de violaceína em meio líquido por C. violaceum e sobre a formação de biofilme, avaliado pelo ensaio de cristal violeta e microscopia confocal, em S. liquefaciens e P. aeruginosa nas temperaturas 30 ºC e 37 ºC. Os resultados obtidos pela CLAE indicaram que o extrato metanólico de pimenta-malagueta (EMPM) continha capsaicinoides como a capsaicina e dihidrocapsaicina, luteolina e outros compostos não identificados; já o extrato amônico desta não continha os compostos capsaicinoides. Ambos os extratos de pimentão vermelho continham luteolina e compostos não identificados, mas não apresentaram capsaicinoides. Como o EMPM era representativo dos demais extratos, por conter tanto capsaicinóides quanto luteolina, o foco deste trabalho foi avaliar os efeitos do EMPM sobre fenótipos microbianos nas concentrações 5; 2,5; 1,25 e 0,625 mg/ml, além de utilizar a capsaicina como controle comparativo em concentrações equivalentes às do extrato (25, 50 e 100 µg/ml). Os resultados da atividade antimicrobiana mostraram inibição parcial do crescimento das bactérias nas concentrações sub-MIC (MIC >5 mg/ml) de 5 e 2,5 mg/ml de EMPM. A capsaicina também inibiu parcialmente o crescimento das bactérias a 100 µg/ml, com exceção de S. liquefaciens a 37 ºC, cujo crescimento foi induzido em 50 e 25 µg/ml. A produção de violaceína foi reduzida pelo EMPM a 1,25 e 0,625 mg/ml, sem afetar o crescimento de C. violaceum. Ensaios com C. violaceum CV026, estirpe biosensora capaz de produzir o pigmento na presença de AI-1 exógeno, sugerem que o possível mecanismo de atuação do extrato sobre o sistema QS em C. violaceum 12472 é sobre a síntese do sinalizador, já que não foi observada inibição da produção de violaceína em CV026 pelo extrato. Contrariamente, a capsaicina incrementou a produção do pigmento na estirpe 12472, mas ensaios com a estirpe CV026 indicaram que a capsaicina não atua como sinalizador do QS, uma vez que esta não induziu a produção de violaceína nesta estirpe. Já a formação de biofilme foi incrementada na presença do EMPM, sendo consideravelmente maior em P. aeruginosa a 30 ºC. Igualmente, observou-se indução da formação de biofilme por capsaicina em S. liquefaciens (37 ºC) e P. aeruginosa (30 ºC). Porém, a capsaicina não teve efeito sobre a formação de biofilme de S. liquefaciens quando cultivada a 30 ºC, nem P. aeruginosa a 37 ºC. Os resultados revelam que a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472 é inibida pelo EMPM, mas não pela capsaicina. Já, o EMPM e a capsaicina, de forma geral, não inibem a formação de biofilme de S. liquefaciens MG1 nem P. aeruginosa PAO1. Outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos pelos quais o EMPM e a capsaicina agem sobre os fenótipos avaliados neste trabalho. / Quorum sensing inhibition alters bacterial communication by reducing virulence factors expression and biofilm formation, exerting less selective pressure compared to antibiotics. Fruits and vegetables are rich sources of compounds with potential QS-inhibition properties. However, there are few references about the potential of peppers belonging to the genus Capsicum and its isolated compounds as QS inhibitors. This study aimed to assess the effect of organic extracts obtained from Capsicum varieties, pimenta-malagueta (red chili) and pimentão vermelho (red bell pepper), on the AI-1 dependent QS system. The extracts were obtained by solid phase extraction and split into a methanolic and an ammonic fraction. Characteristic compounds were identified and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The antimicrobial activity of the extracts was assessed by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) and the growth curve of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. The anti-QS effect of the extracts was evaluated by the agar diffusion assay and the quantification of violacein production was assessed in liquid medium by C. violaceum, as well as in the biofilm formation test determined by the crystal violet assay and confocal microscopy with S. liquefaciens and P. aeruginosa at 30 ºC and 37 ºC. HPLC results showed that the methanolic extract of pimenta-malagueta (EMPM) contained capsaicinoids such as capsaicin and dihidrocapsaicin, luteolin and other unidentified compounds in lower concentrations; while its ammonic extract did not have capsaicinoids. Both pimentão vermelho extracts contained luteolin and other unidentified compounds in low concentrations, but they did not contain capsaicinoids. As EMPM was representative among the extracts because it contained capsaicinoids and luteolin, the focus of this work was to assess the effect of EMPM over microbial phenotypes at concentrations of 5, 2.5, 1.25 and 0.625 mg/ml, using capsaicin as a comparative control at equivalent concentrations to those in EMPM (25, 50 and 100 µg/ml). Antimicrobial activity assays showed a partial inhibition growth of bacteria at sub-MIC concentrations (MIC >5 mg/ml) of EMPM at 5 and 2.5 mg/ml. Similarly, capsaicin partially inhibited bacterial growth at 100 µg/ml, except for S. liquefaciens at 37 ºC in which growth was induced at 50 and 25 µg/ml. Violacein production was reduced by EMPM at 1,25 and 0,625 mg/ml without affecting C. violaceum growth. Assays with C. violaceum CV026, a biosensor strain that produces violacein in the presence of exogenous AI-1, suggest that EMPM reduced violacein production in C. violaceum 12472 by interfering with the AI-1 synthesis. In contrast, capsaicin incremented violacein synthesis in strain 12472, but experiments with strain CV026 revealed that capsaicin does not function as an analog of AI-1. Biofilm formation was increased in EMPM presence, being remarkably superior in P. aeruginosa cultivated at 30 ºC, as opposed to cultivation at 37 ºC. Similarly, capsaicin induced biofilm formation in S. liquefaciens (37 ºC) and P. aeruginosa (30 ºC). However, capsaicin did not affect biofilm formation on S. liquefaciens cultured at 30 ºC, neither on P. aeruginosa at 37 ºC. These results show that violacein production in C. violaceum ATCC 12472 is inhibited by EMPM, but not by capsaicin. In general, EMPM and capsaicin did not inhibit biofilm formation in S. liquefaciens MG1 neither in P. aeruginosa PAO1. More studies are necessary to elucidate the mechanisms by which EMPM and capsaicin affect the studied phenotypes in this work.