Os envenenamentos ofídicos constituem um problema relevante de saúde pública em diversas regiões do mundo, particularmente em países da zona tropical e neotropical. A fisiopatologia do acidente ofídico é constituída por uma série de eventos complexos tanto a nível local quanto sistêmico, e o soro antiofídico é o único tratamento utilizado. No entanto, os efeitos tóxicos locais induzidos durante o envenenamento por serpentes, principalmente do gênero Bothrops, não são eficientemente neutralizados pela soroterapia tradicional. Por esta razão, procuram-se alternativas complementares, como as plantas medicinais antiofídicas que são usadas por comunidades que não têm acesso a soroterapia. A flora brasileira possui uma ampla variedade de plantas medicinais com potencial antiofídico, as quais têm sido pouco estudadas cientificamente. Neste estudo foram realizados ensaios in vitro e in vivo de neutralização de peçonhas ofídicas com o extrato aquoso das entrecascas de Anacardium humile (EAAh), e, o isolamento e a caracterização fitoquímica de um inibidor de miotoxinas, o ácido gálico (AG). Para os ensaios de inibição, foram utilizadas soluções contendo peçonha bruta ou toxina isolada misturadas com diferentes quantidades de extrato vegetal que foram previamente incubadas por 30 min a 37°C. Também foi realizada administração do extrato após o envenenamento em diferentes intervalos de tempo para os testes de inibição da miotoxicidade. Observou-se que EAAh tem atividade inibitória sobre os efeitos tóxicos (letalidade, miotoxicidade, e hemorragia) e farmacológicos/enzimáticos (edema, atividade fosfolipásica e coagulante) induzidos pelas peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e das toxinas isoladas. O extrato vegetal inibiu 100% a letalidade induzida pela peçonha de C. d. terrificus e sua principal neurotoxina, a crotoxina. O EAAh foi submetido a fracionamento cromatográfico analítico, e em condições polares foi possível identificar e isolar o ácido gálico, o qual demonstrou tempo de retenção e espectros de ressonância magnética nucleares similares ao padrão comercial e a dados de literatura deste mesmo composto, respectivamente. O ácido gálico isolado foi capaz de inibir a atividade miotóxica induzida pela peçonha bruta de B. jararacussu e sua principal miotoxina, a bothropstoxina-I, uma PLA2-símile Lys49. A análise dos espectros de dicroísmo circular e os estudos de interação por modelagem molecular sugerem que o ácido gálico forma um complexo com a BthTX-I de B. jararacussu em seu sítio ativo, inibindo sua atividade tóxica. A ligação do ácido gálico com as miotoxinas não modificou nem a forma e nem a intensidade dos espectros de dicroísmo circular, não induzindo alterações significativas na porcentagem dos diversos domínios que constituem a estrutura secundária destas proteínas. O ácido gálico assim como outros taninos, tem revelado-se um bom inibidor das ações tóxicas de peçonhas de serpentes e está relacionado com a ação inibitória do extrato de Anacardium humile. / Ophidian envenomations are a significant problem of public health in several regions of the world, particularly in tropical and neotropical countries. The pathophysiology of snakebite accidents is constituted by a complex series of events both locally and systemically, and the antivenom serum is the only treatment used. However, local toxic effects induced during envenomation by snakes, especially from the genus Bothrops, are not effectively neutralized by the traditional serum therapy. For this reason, additional alternatives are made necessary, such as the use of medicinal plants that are used by communities with no access to serum therapy. The Brazilian flora possesses a wide variety of medicinal plants with antiophidian potential, which have been little-studied scientifically. In the present study, we performed in vitro and in vivo neutralization of snake venoms with the aqueous extract of inner bark of Anacardium humile (EAAh), and the isolation and phytochemical characterization of an inhibitor of myotoxins, the gallic acid (GA). For the inhibition assays, we used solutions containing crude venom or isolated toxin mixed with different amounts of plant extracts that were previously incubated for 30 min at 37°C. Administration of the extract after envenomation was also performed at different time intervals for myotoxicity inhibition assays. It was observed that EAAh has inhibitory activity against the toxic (lethality, myotoxicity and hemorrhage) and pharmacological/enzymatic effects (edema-inducing, coagulant and phospholipase activities) induced by snake venoms of the genera Bothrops, Crotalus, Lachesis and isolated toxins. The plant extract inhibited 100% of the lethality induced by C. d. terrificus venom and its major neurotoxin, crotoxin. The EAAh was subjected to analytical chromatographic separation, and in polar conditions, it was possible to identify and isolate the gallic acid, which showed retention time and nuclear magnetic resonance spectra similar to the commercial standard and to literature data of this same compound, respectively. Gallic acid alone was able to inhibit the myotoxic activity induced by crude venom of B. jararacussu and its main myotoxin, BthTX-I, a Lys49 PLA2-like enzyme. The analysis of circular dichroism spectra and interaction studies by molecular modeling suggest that gallic acid forms a complex with BthTX-I in its active site, which inhibits its toxic activity. The binding of gallic acid to myotoxins did not change neither the form nor the intensity of circular dichroism spectra, not inducing significant changes in the percentage of the various domains that form the secondary structure of these proteins. The gallic acid and other tannins have been showed to be good inhibitors of the toxic effects of snake venoms, and our study showed that this acid is related to the inhibitory action of the Anacardium humile extract.

Os venenos do gênero Bothrops induzem efeitos locais caracterizados por hemorragia, necrose, edema e dor intensa. Apesar da importância clínica do fenômeno de dor, os estudos sobre os mecanismos envolvidos na gênese deste fenômeno são ainda escassos. Além disso, não existem dados sobre a capacidade do antiveneno em neutralizar este fenômeno. Neste trabalho foi investigada, a capacidade dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops asper e da miotoxina III (Fosfolipase A2, variante Asp 49), uma toxina isolada do veneno de Bothrops asper, em induzir hiperalgesia em ratos, a mediação química deste fenômeno e a capacidade dos antivenenos em neutralizar esta ação dos venenos. A possível correlação entre a hiperalgesia e a resposta edematogênica causada pelos venenos ou miotoxina foi também avaliada. O limiar de dor foi determinado antes e em diferentes tempos após a administração dos venenos ou toxina, empregando o teste de pressão de pata de rato. Para o estudo da resposta edematogênica, o aumento do volume das patas posteriores foi determinado por pletismografia. Os venenos e a toxina, administrados por via intraplantar, nas doses de 5µg (VBj), 15µg (VBa) ou 10µg (MIII), induziram hiperalgesia e edema, com respostas máxima na 1a (VBj, MIII) ou 2a (VBa) hora, não sendo mais detectadas na 24a hora. Para o estudo da neutralização, foram utilizados o antiveneno botrópico produzido no Instituto Butantan e o antiveneno polivalente produzido no Instituto Clodomiro Picado da Costa Rica, administrados por via endovenosa, 15 min. ou imediatamente antes ou 15 min. após a injeção dos venenos. O AVIB, quando injetado 15 min. antes do VBj, foi capaz de reverter a hiperalgesia induzida pelo veneno. Em relação ao edema, esta inibição foi observada quando o antiveneno foi administrado 15 min. ou imediatamente antes do VBj. Por outro lado, o AVCP não interferiu com a dor e o edema acarretados pelo VBa. Quando o VBj e o VBa foram incubados, in vitro, por 30 min., a 370C com os AV correspondentes, a hiperalgesia e o edema foram abolidos. Estes resultados indicam que a incapacidade do AVCP, quando administrado in vivo, de bloquear a hiperalgesia e o edema induzidos pelo VBa, não é consequência da ausência de anticorpos específicos no antiveneno, uma vez que estes efeitos foram inibidos quando o veneno foi pré-incubado com o antiveneno. Para avaliação da mediação química da hiperalgesia e do edema, os animais foram submetidos a tratamentos com inibidores de síntese, antagonistas de receptores, anticorpos ou drogas depletoras destes mediadores. Os resultados mostraram que o Hoe-140, dexametasona e NDGA inibem a hiperalgesia induzida pelo VBa, enquanto que apenas a prometazina interferiu com o edema causado pelo veneno. A hiperalgesia induzida pela MIII foi revertida pelo tratamento com prometazina, metisergida, Hoe-140, dexametasona e por NDGA, enquanto que o edema foi inibido apenas por prometazina e dexametasona. Estes dados sugerem que: a) a MIII é um importante componente do veneno para a geração de hiperalgesia, b) a bradicinina e os derivados da lipoxigenase são mediadores da dor acarretada pelo VBa e pela MIII, c) histamina e serotonina participam também da hiperalgesia induzida pela miotoxina e d) a histamina é mediador do edema induzido pelo VBa e pela MIII. Com relação à hiperalgesia induzida pelo VBj, somente o tratamento com Hoe-140 diminuiu este fenômeno, indicando a participação da bradicinina. Por outro lado, este tratamento não foi capaz de interferir com o edema induzido por este veneno. Cabe ressaltar que TEIXEIRA et al. (1994) demonstraram a participação de eicosanóides e PAF na hiperalgesia induzida pelo VBj. Os dados em conjunto sugerem ainda, dissociação entre os fenômenos de dor e edema acarretados por ambos os venenos e pela miotoxina. / Bothrops venoms cause pronounced local tissue-damage characterized by hemorrhage, myonecrosis, edema and pain. Venom-induced pain has been poorly investigated, despite its clinical relevance. Furthermore, the ability of antivenom to neutralize hyperalgesia induced by these venoms is not known. In the present study the hyperalgesia and edema induced by Bothrops jararaca (BjV) and Bothrops asper (BaV) venom and by myotoxin III-MIII (Asp49- phospholipase A2), a toxin isolated from BaV, were investigated. The chemical mediators involved in these phenomena and the ability of the antivenom to neutralize the hyperalgesia and edema induced by these venoms were also investigated. Pain threshold was assessed before and at several intervals after venom injection, using the rat paw pressure test. Edema of paw was measured phethysmographically at the same periods of time. The intraplantar injection of BjV (5µg/paw), BaV (15µg/paw) or MIII (10µg/paw) caused hyperalgesia and edema, whose peak were observed at the 1st (BjV, MIII) or 2nd (BaV) hours after venom/toxin administration, decreasing thereafter. For neutralization studies, the antivenoms produced either at Instituto Butantan from Brazil (AVIB) or Instituto Clodomiro Picado from Costa Rica (AVCP) were administered intravenously 15 min prior to, or immediately before, or 15 min after venoms injection. When the antivenom from Instituto Butantan was injected 15 min. before BjV, the hyperalgesia and edema were abolished. Furthermore, partial inhibition of edema was also observed when the antivenom was injected together with BjV. On the other hand, hyperalgesia and edema induced by BaV were not modified by AVCP. Incubation of BjV and BaV, for 30 min. at 37oC, with the antivenoms in vitro, abolished the hyperalgesia and edema. The inability of the in vivo treatment with antivenom in abolishing hyperalgesia and edema induced by BaV seems not to be related to the lack of neutralizing antibodies in antivenom, because neutralization was achieved in pre-incubation experiments. In order to investigate the chemical mediation of hyperalgesia and edema induced by the venoms or toxin, animals were treated with several drugs. Pretreatment with Hoe-140, dexamethasone and NDGA blocked the hyperalgesia induced by BaV, whereas only promethazine reduced the edema induced by this venom. The MIII-induced hyperalgesia was blocked by promethazine, methysergide, Hoe-140, dexamethasone and NDGA, whereas the edema was reduced only by promethazine and dexamethasone. These results suggest that: a) MIII may contribute to the BaV-induced hyperalgesia, b) bradykinin and leukotrienes mediate the BaV- and MIII-induced pain and MIII; c) histamine and serotonin also participate in the myotoxin-induced hyperalgesia and d) the edema induced by BaV and MIII is mediated by histamine. Pre-treatment of the animals with Hoe-140 abolished BjV-induced hyperalgesia, suggesting that bradykinin may mediate the venom-induced hyperalgesia. However, this treatment did not modify the BjV-induced edema. It is important to stress that previous studies have shown that BjV-induced hyperalgesia is mediated, at least partially, by eicosanoids and PAF (TEIXEIRA et al.,1994). The data presented herein also suggest that distinct mechanisms may be involved in the development of hyperalgesia and edema induced by both venoms and myotoxin III.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:20:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_SimoneCristinaBuzzo_D.pdf: 2257171 bytes, checksum: dafe56777caf52fdf6e83be317bb28f9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de glicações sobre a PLA2 secretórias isoladas do veneno das serpentes Crotalus durissus collilineatus e Bothrops jararacussu. A técnica de MALDI-TOF foi usado para comprovar a glicação dos carboidratos nas PLA2: a PLA2 de Cdcolli apresentou glicação a 6 moléculas de D-Glicose e de 5 moléculas de D-Lactose, mas aparentemente não houve glicação com nenhuma molécula de D-Galactose; a BthTX-I apresentou glicação com 5 moléculas de D-Glicose, 1 molécula de D-Galactose e 4 moléculas de D-Lactose; a BthTX-II apresentou ligação a 6 moléculas de D-Glicose, a 1 molécula de D-Galactose e a 4 moléculas de D-Lactose; além disso, a dimerização das PLA2 não ocorreu. A glicação da PLA2 de Cdcolli com D-Glicose e D-Lactose aumentou sua atividade enzimática e mudou seu perfil alostérico, da mesma forma, esses carboidratos aumentaram a ação edematogênica e anularam a atividade citotóxica dessa PLA2. No entanto, D-Lactose e D-Glicose diminuíram o efeito miotóxico e modificaram o perfil de agregação plaquetária da PLA2 de Cdcolli nativa, embora apenas a D-Lactose tenha diminuído significantemente a agregação. A glicação de BthTX-I a D-Glicose e D-Galactose diminuiu sua ação edematogênica, e sua glicação aos carboidratos testados diminuiu seu efeito miotóxico. A glicação de BthTX-II a D-Lactose diminuiu sua atividade enzimática, a ação edematogência foi diminuída pela glicação a todos os carboidratos, enquanto a glicação a D-Glicose e D-Galactose diminuíram seu efeito miotóxico. A fluorescência intrínseca apresenta mudanças na estrutura terciária de BthTX-I e BthTX-II após a glicação e o dicroísmo circular sugere modificação na estrutura secundária da PLA2 de Cdcolli. Além disso, a modelação da PLA2 de Cdcolli apresentou várias regiões da proteína livres onde pode estar ocorrendo a glicação. Esse resultados sugerem que a glicação modifica a estrutura da PLA2, modulando de forma diferente a atividade enzimática e o efeito biológico, possivelmente a mudança estrutural ou mesmo os carboidratos ligados a estrutura da PLA2 estão modificando sua afinidade a receptores de membrana. Adicionalmente, os resultados evidenciam que os sítios responsáveis pelas atividades enzimática e biológica estão em lugares diferentes dentro da estrutura da PLA2 / Abstract: The objective of this work was evaluate the effect of glycations in the secretory PLA2 isolated from Crotalus durissus collilineatus (Cdcolli) and Bothrops jararacussu (BthTX-I, catalytic inative K49 and BthTX-II, catalytic active D49) rattlesnake venom. The MALDI-TOF technic was used to test the glycation in the PLA2: Cdcolli showed glycation to 6 molecules of D-Glucose and 5 molecules of D-Lactose, but no glycation to D-Galactose; the BthTX-I showed glycation to 5 molecules of D-Glucose, 1 molecule of D-Galactose and 4 molecules of D-Lactose; the BthTX-II showed glycation to 6 molecules of D-Glucose, 1 molecule of D-Galactose and 4 molecules of D-Lactose. The glycation of PLA2 from Cdcolli to D-Glucose and D-Lactose increased the enzymatic activity and changed its alosteric profile, in the same way, theses carbohydrates increased the edematogenic effect and annuled the citotoxic activity. However, D-Lactose and D-Glucose decreased the miotoxic effect and changed the platelet aggregation profile of native PLA2, although only D-Lactose had decreased the aggregation. The glycation of BthTX-I to D-Glicose and D-Galactose decreased the edematogenic effect and its glycation to all carbohydrates decreased the miotoxic effect. The glycation of BthTX-II to D-Lactose decreased its enzymatic activity; the edematogenic effect was decreased by the glycation to all the carbohydrates, while the glycation to D-Glucose and D-Galactose decreased the miotoxic effect. The intrinsec fluorescence shows changes in the terciary structure of BthTX-I and BthTX-II after glycation and the circular dichroism suggests modification in the secundary structure of glycated PLA2 from Cdcolli. Besides, the structure modelation shows many free areas in the PLA2 from Cdcolli, where the glycation can be happening. Theses results suggest that the glycation modifies the structure of PLA2, modulating in a different way the enzymatic and the biologic activity; probably the structure changes or even the linked carbohydrates to the PLA2 structure are modifying the affinity for membrane receptors. Additionally, the results show that the enzymatic and biological sites are in different areas in the PLA2 structure. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador:Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T05:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_D.pdf: 15606775 bytes, checksum: 3232092d1eced36a575f660d994b44a9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: No Brasil a espécie predominante de serpente peçonhenta do gênero Crotalus é a Crotalus durissus, que é composta por várias subespécies encontradas em todo território nacional, as subespécies alvos de nosso estudo são a Crotalus durissus ruruima e a Crotalus durissus cumanenses, presentes na região amazônica e na Venezuela respectivamente, mas que ainda não foram tão bem estudadas quanto a Crotalus durissus terrificus. As principais frações já caracterizadas para o veneno total de Crotalus são: convulxina, giroxina, crotoxina e crotamina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular e em fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas "trombina-like") dos venenos totais. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foi detectado com atividade fosfolipásica nas frações crotoxínicas de Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus cumanenses sendo confirmado através de eletroforese PAGE-SDS e espectrometria de massa MALDI-TOF. As PLA2 das duas subespécies alvo apresentaram alta homegeneidade com massa molecular de aproximadamente 14kDa e mostraram uma maior quantidade de aminoácidos básicos; lisina e arginina para um total de 122 aminoácidos. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de PLA2 mostrou homologia com outras proteínas PLA2 do gênero crotálico. A fosfolipase (PLA2) constitui o maior componente presente no veneno de serpente e tem sido extensivamente investigado não só por ser mais abundante, mas por exibir uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo neurotoxidade, miotoxicidade, citotoxidade, efeito edematogênico, anti-coagulante, agregação plaquetária, hipotensivo, bactericida, anti-HIV, anti- tumor e anti-parasitário. Devido a esta diversidade funcional, estas proteínas estruturalmente semelhantes despertaram o interesse de muitos pesquisadores como modelos moleculares para o estudo das relações estrutura-função. No presente trabalho foi nosso propósito purificar o veneno total de Crotalus dirussus ruruima e Crotalus durissus cumanenses, isolar a fração fosfolipásica e verificar que as atividades biológicas e bioquímicas foram afetadas após prévias modificações estruturais com p-bromofenacil brometo e cumarinas sintéticas. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar novos conhecimentos à relação entre sítios farmacológicos, região catalítica nas fosfolipases A2 e função / Abstract: In Brazil the predominant species of poisonous snake of the genus Crotalus is the Crotalus durissus, which is composed of several subspecies found throughout the country. The sub-targets of our study is the Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis present in the Amazon region and Venezuela respectively, that haven't been as well studied as the Crotalus durissus terrificus. The main fractions we know for the total of Crotalus poison were convulxin, giroxin, crotoxin and crotalin. Through a combination of many methodologies such as HPLC molecular exclusion and in a reverse phase we managed isolate the principal components of crotoxin (PLA2, crotapotin and proteins "thrombin-like") of the total poison. During the division of the total poison in column HPLC the molecular exclusion was detected a phospholipase activity in the fractions crotoxin Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis that confirmed through SDS-PAGE and electrophoresis of the mass MALDI-TOF. The two subspecies of PLA2 show us they are highly homogeneous with the molecular mass of almost 14kDa and a great amount of basic amino acids, lysine and arginine for a total of 122 amino acids. The N-terminal amino acid sequence of PLA2 showed homology with other proteins of the kind Crotalus PLA2. The phospholipase (PLA2) is the major component present in snake poison and has been extensively investigated not only because it is more abundant, but it shows a wide range of biological effects, including neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, edematogenic effect, anti-coagulant, platelet aggregation, hypotensive, bactericidal, anti-HIV, anti-tumor and anti-parasitic. Because of this functional diversity, these proteins structurally similar aroused the interest of many researchers as molecular models for the study of structure-function relationships. In this study our purpose was to purify the total poison of Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis and isolate the fraction of phospholipase and found that the biochemical and biological activities were affected after previous structural changes with p-bromofenacil bromide and synthetic coumarins. The results presented in this work allow them to obtain a useful biochemical tool to add new knowledge to the relation between pharmacological sites, the catalytic region in phospholipases A2 and function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:19:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RomeroVargas_FreyFrancisco_M.pdf: 1233125 bytes, checksum: 85502fc7f4b2dd6cdb2a6fc0c220c5b2 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As serpentes do gênero Crotalus incluem várias espécies amplamente distribuídas nocontinente Americano. Os venenos crotálicos das serpentes encontradas no Brasil apresentam características próprias. Entre os componentes bioativos, as fosfolipases A2 (E.C. 3.1.1.4.) destacam-se por ser a principal componente, tais enzimas são dependentes de cálcio e hidrolisam a ligação sn-2 éster dos fosfolipídios e alem disso induz uma variedade de efeitos. Nesta tese, primeiramente nos desenvolvemos um novo protocolo de purificação com uma coluna C18 µ-Bondapack em HPLC de fase reversa destas toxinas, Os perfis obtidos mostraram que o veneno total da espécie Crotalus durissus cumanensis foi fracionado em quatorze picos, onde as frações 9 e 10 apresentam atividade PLA2. Do veneno de Crotalus durissus ruruima foram obtidos dezoito picos, sendo que as frações 12 e 13 apresentaram atividade PLA2 também. Assim, neste trabalho, nos apresentamos o isolamento, purificação determinação de sua estrutura primaria de duas isoformas fosfolipase A2 para cada espécie crotálica: Crotalus durissus cumanensis e Crotalus durissus ruruima denominados como Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 e Cdr-13, respectivamente. Todas elas são formadas por 122 resíduos de aminoácidos. O alinhamento dos aminoácidos, das isoformas Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 e Cdr-13 mostram um alto nível 93.4 % de homologia seqüencial para as duas primeiras e 92.6% para as outras, observaram-se com respeito a distintas PLA2 que diminuíram para cerca de 50 % de homologia. Todas elas foram identificadas como miotoxinas e apresentaram atividade fosfolipásica. Foi possível realizar, a partir das isoformas nativas um processo de modificação química, utilizando-se reagentes seletivos para amino ácidos específicos (His, Tyr e Lys) os quais estão envolvidos na rede catalítica ou na interação com sua interface, logo após, foram analisadas quanto a suas características físico-químicas e biológicas. Nossos estudos de miotoxicidade local e sistêmica de todas as isoformas nativas e modificadas dos venenos crotálicos in vivo, evidenciaram o incremento nos níveis de creatina cinase (CK) séricos e nas isoformas modificadas foram inibidas na sua atividade catalítica ou devido às mudanças estruturais que afetam outras regiões alem do sitio catalítico, revelando a importância de conhecer a relação estrutura-função. Em contraste, o efeito indutor de edema, não pode ser rapidamente correlacionado com suas diferenças estruturais. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar nosso conhecimento da relação dos sítios farmacológicos alem da região catalítica nas fosfolipases A2 / Abstract: The serpents of the genus Crotalus include several species widely distributed in the American continent. The poisons crotálicos of the serpents found in Brazil, they present own characteristics. Among the components bioativos, the phospholipases A2 (E.C. 3.1.1.4.) standing out to be the main component, such enzymes are dependents of calcium and hidrolise the bond sn-2 éster of the fosfolipídios and besides that induced a variety of effects. In this thesis, firstly we develop a new purification protocol with a column C18 µ- Bondapack in HPLC of reverse phase of these toxins, The obtained profiles showed that the total poison of the species Crotalus durissus cumanensis was fractioned in fourteen picks, where the fractions 9 and 10 present activity PLA2. Of the poison of Crotalus durissus ruruima they were obtained eighteen picks, and the fractions 12 and 13 also presented activity PLA2. This way, in this work, we present the isolation, purification, determination of his primary structure of two isoforms fosfolipase A2 for each species crotálics: Crotalus durissus cumanensis and Crotalus durissus ruruima denominated like Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 and Cdr-13, respectively. All of them are formed by 122 residues of amino acids. The alignment of amino acids of the isoforms Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 and Cdr-13 it shows a high level of sequential homology 93.4% for the first two and 92.6% for the other ones, they were observed with regard to different PLA2 that decreased for about 50% of homology. All of them were identified as miotoxins and they presented phospholipasic activity. it was possible to carry out starting from the native isoforms a process of chemical modification, being used selective reagents for amino specific acids (His, Tyr and Lys) which are involved in the catalytic net or in the interaction with his interface, soon after, they were analyzed as for their physio-chemical and biological characteristics. Our studies of local and systemic miotoxicity of all the native and modified isoforms in vivo of the poisons crotálicos, evidenced the increment in the levels of creatine kinase (CK) séricos and in the modified isoformas they were inhibited in his activity catalytic or due the structural changes that they affect other regions besides the catalytic place, revealing the importance of knowing the relationship structure-function. In contrast, the effect producing edema, it cannot be correlated quickly with their structural differences. The results presented in this work provide the obtaining of an useful biochemical tool to increase our knowledge of the relationship of the pharmacological sites also of the catalytic region in the phopholipases A2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Hialuronidases são responsáveis pela hidrólise de hialuronan, o principal componente da matriz intersticial. Estas enzimas são ubíquas nas peçonhas de serpentes, contudo suas concentrações e características podem variar entre as espécies. Embora estudos indiquem a presença de atividade hialuronidásica na peçonha de Crotalus durissus terrificus e a hialuronidase apresente importante papel no envenenamento local e sistêmico, a enzima ainda não havia sido estudada. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização funcional e estrutural da hialuronidase (CdtHya1) presente na peçonha de serpente Crotalus durissus terrificus. CdtHya1 foi purificada por cromatografia de troca iônica seguida de filtração molecular e interação hidrofóbica (recuperação proteica = 0,23%), consistindo no primeiro estudo de isolamento e caracterização de uma hialuronidase crotálica. Os 44 primeiros aminoácidos do seu N-terminal foram determinados por degradação de Edman e mostraram compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras hialuronidases depositadas em bancos de dados. CdtHya1 é uma glicoproteína e apresentou atividade máxima a 37°C, pH 5,5 e na presença de NaCl 0,2 mol/L. Seu monômero de 64,5 kDa foi estimado por SDS-PAGE sob condições redutoras. A atividade específica da peçonha solúvel foi 145 unidades turbidimétricas reduzidas por miligrama (UTR/mg), contra 5.066 UTR/mg para CdtHya1. A enzima apresentou Kcat de 3.781,0 min-1 sobre hialuronan e em torno de 400 min-1 sobre os sulfatos de condroitina A, B e C, indicando maior atividade sobre hialuronan. Cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e NaCl 1 mol/L reduzem significativamente a atividade enzimática. A enzima pura (32 UTR/40 ?L) diminuiu o edema provocado pela injeção subplantar de tampão, crotoxina ou fosfolipase A2 (PLA2), aumentando a difusão destes pelos tecidos dos camundongos. CdtHya1 potencializou a ação da crotoxina, como evidenciado pela morte de camundongos até o final do ensaio de edema de pata. A enzima nativa pura foi submetida a ensaios cristalográficos preliminares onde foram obtidos os primeiros cristais, constituindo assim um passo importante para a determinação da primeira estrutura tridimensional de hialuronidase de peçonha de serpente. Este estudo relata o procedimento de purificação da CdtHya1, a primeira hialuronidase isolada de peçonhas crotálicas com alta atividade antiedematogênica. / Hyaluronidases are responsible for hyaluronan hydrolysis, the major component of the interstitial matrix. These enzymes are ubiquitous in snake venoms, however their concentrations and characteristics may vary between species. Although studies indicate the presence of hyaluronidase activity in the Crotalus durissus terrificus venom and hyaluronidase presents important role in local and systemic envenoming, the enzyme has not been studied yet. The objectives of this study focused on the isolation and functional and structural characterization of hyaluronidase (CdtHya1) presents in Crotalus durissus terrificus snake venom. CdtHya1 was purified by ion exchange chromatography followed by molecular filtration and hydrophobic interaction (protein recovery = 0.23%), consisting in the first study on the isolation and characterization of a crotalic hyaluronidase. Its first 44 N-terminal amino acids were determined by Edman degradation and showed to share a high level of sequence identity against other hyaluronidases deposited in data banks. CdtHya1 is a glycoprotein and it showed maximum activity at 37 °C, pH 5.5 and in the presence of 0.2 mol/L NaCl. Its monomer of 64.5 kDa was estimated by SDS-PAGE under reducing conditions. The soluble venom specific activity was 145 turbidity reducing units per milligram (TRU/mg), against 5,066 TRU/mg for CdtHya1. The enzyme showed Kcat of 3,781.0 min-1 on hyaluronan and about 400 min-1 on chondroitin sulphates A, B or C, indicating higher activity on hyaluronan. Divalent cations (Ca2+ and Mg2+) and 1 mol/L NaCl significantly reduce the enzyme activity.The pure enzyme (32 TRU/40 ?L) decreased the edema caused by subplantar injections of buffer, crotoxin or phospholipase A2 (PLA2), increasing their diffusion through mice tissues. CdtHya1 potentiated crotoxin action, as evidenced by mice death by the end of the paw edema assay. The pure native enzyme was subjected to preliminary crystallographic studies where the first crystals were obtained, thus providing an important step in determining the first three-dimensional structure of hyaluronidase snake venom. This study reports the purification procedure of CdtHya1, the first hyaluronidase isolated from crotalic venoms with high antiedematogenic activity.

A caracterização proteômica de venenos de serpentes contribui significativamente para o avanço das Ciências na área Biomédica. Várias destas moléculas, utilizadas como instrumentos de investigação de mecanismos celulares e moleculares, estão envolvidas em diversos processos fisiopatológicos e de intoxicação. No entanto, os venenos de serpentes ainda requerem caracterização funcional e/ou biológica adicionais. As fosfolipases A2s (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos, e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de intoxicação ocasionados por estas proteínas. Este trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica, enzimática, funcional e estrutural da primeira PLA2 Asp49 ácida, denominada Bpir-I-PLA2, isolada do veneno da serpente Bothrops pirajai, espécie endêmica da região Sul do Estado da Bahia e atualmente, integrante da Lista Nacional das Espécies da Fauna Brasileira Ameaçadas de Extinção. O isolamento da Bpir-I-PLA2 foi realizada através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de troca iônica, seguida de HPLC de fase reversa. Quanto submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas ácidas, Bpir-I-PLA2 apresentou alto grau de homogeneidade. A massa molecular relativa, determinada através de eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, foi de aproximadamente 28.000 para a forma de dímero e 14.500 para o monômero. A focalização isoelétrica demonstrou uma única banda para a fosfolipase A2, revelando pI aproximado de 4,9. A região N-terminal de Bpir-I-PLA2, seqüenciada através do método de degradação de Edman, apresentou elevada homologia entre outras PLA2s de venenos de serpentes. A composição de amioácidos da proteína corroborou com sua característica ácida, apresentando um elevado conteúdo de aminoácidos carregados negativamente. A enzima apresentou elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, Bpir-I-PLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, e também induzir efeito hipotensor in vivo e citotóxico sobre células tumorais, bactérias, fungos e leishmanias. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila neutralizou as atividades enzimática, inibitória sobre a agregação plaquetária, anticoagulante, hipotensora e antitumoral. A moderada atividade edematogênica foi parcialmente inibida. O cDNA contendo 366 bp (BPIR-A) que codifica a proteína Bpir-I-PLA2 foi clonado e a proteína recombinante, expressa. Bpir-I-PLA2 recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, estrutura secundária, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa Bpir-I-PLA2, sugerindo que a recPLA2 foi eficientemente expressa e purificada. Devido à baixa toxicidade demonstrada, a Bpir-I-PLA2 pode tornar-se uma ferramenta importante nos estudos das desordens da coagulação, como também um potencial modelo para a elaboração de novos fármacos para uso na clínica-médica. / The proteomic characterization of snake venoms significantly contributes to science advance in the biomedical area. Several venom toxins are used as instruments for the investigation of cellular and molecular mechanisms, and are involved in a number of physiopathological and intoxication processes. Nevertheless, snake venoms still require further functional and/or biological characterization. Phospholipases A2 (PLA2s) are enzymes that induce several pharmacological effects and usually correspond to the major percentage of snake venom protein contents. Being so, the isolation and characterization of PLA2s could generate important information for the better understanding of the pharmacological and toxic effects caused by these proteins. This work describes the isolation and biochemical, enzymatic and functional characterization of the first acidic Asp49 PLA2 (named Bpir-I-PLA2) from the venom of Bothrops pirajai snake, an endemic species from the south region of state of Bahia and that nowadays is part of the national list of Brazilian fauna species threatened of extinction. The isolation of Bpir-I-PLA2 was carried out by two chromatographic steps, an ion-exchange chromatography followed by reverse phase HPLC. When submitted to polyacrylamide gel electrophoresis for acidic proteins, Bpir-I-PLA2 showed high homogeneity level. The relative molecular mass, determined by polyacrylamide gel electrophoresis with denaturating agent, was of approximately 28,000 for the dimmer and 14,500 for the monomer. With high phospholipase activity and pharmacological effects, characteristic of acidic isoforms, Bpir-I-PLA2 did not present myotoxic activity and showed to be little edematogenic. However, the enzyme acts inhibiting platelet aggregation, delaying plasma clotting time and inducing hypotension, antitumoral effects, antibacteria, antifungal and parasiticide actions. The treatment of the enzyme with the reagent p-bromofenacil brometo neutralized the enzymatic activities, inhibition of aggregation platelet, anticoagulant, hypotensive and antitumoral. The moderate activity edematogenic was inhibited partially. The cDNA (BPIR-A) that codes the protein Bpir-I-PLA2 was cloned and the protein recombinant, expressed. Bpir-I-PLA2 recombinant presented the same sequence of amino acids, structures secondary, phospholipase activity and inhibitory effects on platelet of the native protein, suggesting that recPLA2 was efficiently express and isolated. Due to its low toxicity, Bpir-I-PLA2 could become an important tool in the study of the disorders of the clotting as well as a potential model for the elaboration of new drugs for use in the clinic-doctor.

Os envenenamentos ofídicos constituem um problema relevante de saúde pública em diversas regiões do mundo, particularmente em países da zona tropical e neotropical. A fisiopatologia do acidente ofídico é constituída por uma série de eventos complexos tanto a nível local quanto sistêmico, e o soro antiofídico é o único tratamento utilizado. No entanto, os efeitos tóxicos locais induzidos durante o envenenamento por serpentes, principalmente do gênero Bothrops, não são eficientemente neutralizados pela soroterapia tradicional. Por esta razão, procuram-se alternativas complementares, como as plantas medicinais antiofídicas que são usadas por comunidades que não têm acesso a soroterapia. A flora brasileira possui uma ampla variedade de plantas medicinais com potencial antiofídico, as quais têm sido pouco estudadas cientificamente. Neste estudo foram realizados ensaios in vitro e in vivo de neutralização de peçonhas ofídicas com o extrato aquoso das entrecascas de Anacardium humile (EAAh), e, o isolamento e a caracterização fitoquímica de um inibidor de miotoxinas, o ácido gálico (AG). Para os ensaios de inibição, foram utilizadas soluções contendo peçonha bruta ou toxina isolada misturadas com diferentes quantidades de extrato vegetal que foram previamente incubadas por 30 min a 37°C. Também foi realizada administração do extrato após o envenenamento em diferentes intervalos de tempo para os testes de inibição da miotoxicidade. Observou-se que EAAh tem atividade inibitória sobre os efeitos tóxicos (letalidade, miotoxicidade, e hemorragia) e farmacológicos/enzimáticos (edema, atividade fosfolipásica e coagulante) induzidos pelas peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e das toxinas isoladas. O extrato vegetal inibiu 100% a letalidade induzida pela peçonha de C. d. terrificus e sua principal neurotoxina, a crotoxina. O EAAh foi submetido a fracionamento cromatográfico analítico, e em condições polares foi possível identificar e isolar o ácido gálico, o qual demonstrou tempo de retenção e espectros de ressonância magnética nucleares similares ao padrão comercial e a dados de literatura deste mesmo composto, respectivamente. O ácido gálico isolado foi capaz de inibir a atividade miotóxica induzida pela peçonha bruta de B. jararacussu e sua principal miotoxina, a bothropstoxina-I, uma PLA2-símile Lys49. A análise dos espectros de dicroísmo circular e os estudos de interação por modelagem molecular sugerem que o ácido gálico forma um complexo com a BthTX-I de B. jararacussu em seu sítio ativo, inibindo sua atividade tóxica. A ligação do ácido gálico com as miotoxinas não modificou nem a forma e nem a intensidade dos espectros de dicroísmo circular, não induzindo alterações significativas na porcentagem dos diversos domínios que constituem a estrutura secundária destas proteínas. O ácido gálico assim como outros taninos, tem revelado-se um bom inibidor das ações tóxicas de peçonhas de serpentes e está relacionado com a ação inibitória do extrato de Anacardium humile. / Ophidian envenomations are a significant problem of public health in several regions of the world, particularly in tropical and neotropical countries. The pathophysiology of snakebite accidents is constituted by a complex series of events both locally and systemically, and the antivenom serum is the only treatment used. However, local toxic effects induced during envenomation by snakes, especially from the genus Bothrops, are not effectively neutralized by the traditional serum therapy. For this reason, additional alternatives are made necessary, such as the use of medicinal plants that are used by communities with no access to serum therapy. The Brazilian flora possesses a wide variety of medicinal plants with antiophidian potential, which have been little-studied scientifically. In the present study, we performed in vitro and in vivo neutralization of snake venoms with the aqueous extract of inner bark of Anacardium humile (EAAh), and the isolation and phytochemical characterization of an inhibitor of myotoxins, the gallic acid (GA). For the inhibition assays, we used solutions containing crude venom or isolated toxin mixed with different amounts of plant extracts that were previously incubated for 30 min at 37°C. Administration of the extract after envenomation was also performed at different time intervals for myotoxicity inhibition assays. It was observed that EAAh has inhibitory activity against the toxic (lethality, myotoxicity and hemorrhage) and pharmacological/enzymatic effects (edema-inducing, coagulant and phospholipase activities) induced by snake venoms of the genera Bothrops, Crotalus, Lachesis and isolated toxins. The plant extract inhibited 100% of the lethality induced by C. d. terrificus venom and its major neurotoxin, crotoxin. The EAAh was subjected to analytical chromatographic separation, and in polar conditions, it was possible to identify and isolate the gallic acid, which showed retention time and nuclear magnetic resonance spectra similar to the commercial standard and to literature data of this same compound, respectively. Gallic acid alone was able to inhibit the myotoxic activity induced by crude venom of B. jararacussu and its main myotoxin, BthTX-I, a Lys49 PLA2-like enzyme. The analysis of circular dichroism spectra and interaction studies by molecular modeling suggest that gallic acid forms a complex with BthTX-I in its active site, which inhibits its toxic activity. The binding of gallic acid to myotoxins did not change neither the form nor the intensity of circular dichroism spectra, not inducing significant changes in the percentage of the various domains that form the secondary structure of these proteins. The gallic acid and other tannins have been showed to be good inhibitors of the toxic effects of snake venoms, and our study showed that this acid is related to the inhibitory action of the Anacardium humile extract.

As fosfolipases A2 (PLA2s, E.C. 3.1.1.4) pertencem a uma superfamília de enzimas que realizam a clivagem de fosfolipídios da membrana celular em ácidos graxos e lisofosfolipídios, numa reação dependente de cálcio. As PLA2s apresentam um importante papel em várias funções celulares, incluindo manutenção dos fosfolipídios celulares, geração de prostaglandinas e leucotrienos, tradução de sinais, proliferação celular e contração muscular. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de uma fosfolipase A2 ácida tóxica(BmooTX-I) isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. A BmooTX-I foi purificada por uma combinação de cromatografias em resinas de troca iônica (DEAE-Sephacel), exclusão molecular (Sephadex G-75) e interação hidrofóbica (Phenyl-Sepharose CL-4B). A confirmação do grau de pureza foi realizada através de análise por espectrometria de massa MALDI TOF da BmooTX-I reduzida (monômero, 13.802,66 Da) e não reduzida (dímero, 27.506,38 Da), da focalização isoelétrica (pI 4,2) e de SDS-PAGE. A região N-terminal da enzima apresentou alta homologia com outras PLA2s Asp49 de peçonhas de serpentes. A BmooTX-I apresentou também elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, induzir a liberação de PGI2 por HUVECs e apresentar efeito citotóxico sobre células tumorais, bactérias e fungos. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila (BPB) neutralizou a atividade enzimática e de inibição da agregação plaquetária. A determinação da miotoxicidade foi realizada através da dosagem dos níveis de CK no plasma de camundongos previamente injetados com a toxina. A análise histopatológica das fibras musculares demonstrou a presença de infiltrado inflamatório e líquido intercelular, ambos confirmados pela análise ultra-estrutural. O presente trabalho deverá contribuir para a elucidação e determinação da composição bioquímica dos venenos animais, já que as fosfolipases A2 ácidas tóxicas possuem mecanismos de ação ainda não totalmente esclarecidos. / Phospholipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) belong to a superfamily of enzymes that perform the cleavage of phospholipids of cell membranes in fatty acids and lysophospholipids in a calcium dependent reaction. PLA2s have an important role in several cellular functions, including maintenance of cellular phospholipids, the generation of prostaglandins and leukotrienes, translation signals, cell proliferation and muscle contraction. This study aimed at the structural and functional characterization of an acidic and toxic phospholipase A¬2 (BmooTX-I) isolated from Bothrops moojeni snake venom. BmooTX-I was purified by a combination of chromatographic steps on resins of ion exchange (DEAE Sephacel), molecular exclusion (Sephadex G-75) and hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose CL-4B). The confirmation of the purity degree was analyzed by MALDI TOF mass spectrometry of reduced BmooTX-I (monomer, 13,802.66 Da) and not reduced (dimer, 27,506.38 Da), by isoelectric focusing (pI 4.2) and by SDS-PAGE. The N-terminal region of the enzyme showed high homology with other Asp49 PLA2s of snake venoms. BmooTX-I also presented high phospholipase activity and induced moderate edema in vivo. Furthermore, this enzyme was capable of inhibiting platelet aggregation and plasma coagulation, inducing the release of PGI2 by HUVECs, also showing cytotoxic effects on tumor cells, bacteria and fungi. Treatment of the enzyme with the p-bromophenacyl bromide (BPB) neutralized the enzymatic activity and the inhibition of platelet aggregation. The determination of myotoxicity was accomplished through the determination of the CK levels in plasma of mice previously injected with the toxin. The histopathological analysis of muscle fibers showed the presence of inflammatory infiltration and intercellular fluid, both confirmed by ultrastructural analysis. This work contributes to the elucidation and determination of the biochemical composition of animal venoms, since the mechanisms of action of toxic acidic phospholipases A2 are not yet fully understood.

O tratamento atual indicado para casos de envenenamentos por peçonhas é a administração intravenosa de antivenenos, produzidos através da hiperimunização de animais. Entretanto, os antivenenos disponíveis podem, algumas vezes, não proteger os pacientes e causar reações de hipersensibilidade. Fosfolipases A2 (PLA2), L-aminoácido oxidases (LAAO), metalo e serinoproteases são os principais componentes de peçonhas ofídicas e contribuem para a neurotoxicidade, hemorragia, hemólise, miotoxicidade, cardiotoxicidade e formação de edemas. Foram empregados ensaios para avaliar as atividades das enzimas presentes na peçonha de serpentes da espécie Lachesis muta rhombeata e aquele para atividade de protease foi otimizado. A tecnologia de Phage display foi empregada para a seleção de fagos-anticorpos capazes de reconhecer a peçonha bruta. Os fagos foram amplificados em Escherichia coli TG1 e usados para infectar E. coli HB2151, a qual produz fragmentos de anticorpos humanos solúveis. Estes foram purificados e utilizados em testes de inibição de alguns dos componentes tóxicos da peçonha. Os testes de atividade para PLA2, protease e Laminoácido oxidase foram padronizados com sucesso e as 3 proteínas mostraram elevada atividade enzimática. Após otimização, a quantidade de peçonha necessária para o ensaio de protease foi reduzida em 25 vezes. A massa molecular de PLA2 foi estimada em 17 kDa e as massas moleculares de proteases foram estimadas em 40, 35 e 24 kDa, através de zimogramas. O método de bio panning foi eficiente para a seleção de fagos-anticorpos contra a peçonha bruta. Diversos fragmentos de anticorpos foram purificados e incubados com a peçonha bruta para testar suas capacidades de neutralização sobre cada enzima. Cinco clones demonstraram-se hábeis em inibir a PLA2 através da inibição da hemólise. O clone 4E inibiu 100% da hemólise durante as duas horas de ensaio quando pré-incubado na proporção 2:1 (scFv:peçonha). Os clones 2C e 4E inibiram 100% durante uma hora quando pré-incubados na proporção 1:1 e os clones 2F e 9F inibiram a hemólise parcialmente. Outros testes serão conduzidos para a seleção de clones capazes de neutralizar as demais enzimas, os quais, juntamente com os clones já selecionados, serão analisados através de ensaios in vivo. Espera-se que eles possam contribuir para a construção de um novo antiveneno capaz de superar algumas das dificuldades associadas às técnicas de imunoterapia convencionais / The current treatment for animal envenoming is the intravenous administration of antivenoms, produced by animal hyperimmunization. Unfortunately, available antivenoms sometimes do not protect patients and may cause hypersensitivity reactions. Phospholipases A2 (PLA2), L-amino acid oxidases, metallo and serine proteases are considered the most important snake venom components and contribute to neurotoxicity, hemorrhage, hemolysis, myotoxicity, edematogeny and cardiotoxicity. Assays for evaluating the enzymes present in Lachesis muta rhombeata venom were developed and the protease one was optimized. Phage display technology was used to select phage antibodies able to recognize the crude venom. Phages were amplified in Escherichia coli TG1 and used to infect E. coli HB2151, which produces human antibody fragments. Inhibition tests aiming the neutralization of some toxic components of the venom were performed using purified antibody fragments. Activity assays for evaluating PLA2, protease and L-aminoacid oxidase were successfully performed and all enzymes showed high activity levels. The molecular mass of PLA2 was estimated in 17 kDa and the molecular mass of proteases were estimated in 40, 35 and 24 kDa, by zymography. After optimizing the conditions for proteolytic assay, it was possible to use 25 times less venom than it was necessary at first. The bio panning method was efficient for selecting specific phage antibodies against the crude venom. Several clones were selected to infect HB2151 and to produce soluble antibody fragments, which were purified and incubated with the venom to test their inhibition capacity over each enzyme. Five clones demonstrated ability to neutralize PLA2 by inhibiting hemolysis. The clone 4E could inhibit 100% of hemolysis for over 2 hours when preincubated at the ratio 2:1 (scFv:venom). Clones 2C and 4E could inhibit 100% for 1 hour when preincubated at the ratio 1:1 and clones 2F e 9F could inhibit partially. Other tests will be performed to select clones able to neutralize other enzymes and, together with the clones already selected, will be evaluated by in vivo experiments. It is expected that they may contribute to the construction of a potential new antivenom able to overcome some of the problems associated with conventional immunotherapy