A Apis mellifera é um inseto pertencente à ordem Himenóptera, família Apidae, possui ocorrência cosmopolita e grande importância ecológica, econômica e médica. As subespécies hibridas que ocorrem no Brasil possuem características predominantemente africanas e passaram a ser conhecidas como abelhas africanizadas. As principais características das abelhas africanizadas são o comportamento agressivo, boa resistência a doenças, alta produção de mel e o aumento da frequência de enxameamentos, que tem causado preocupação por estar acompanhado, de aumento no número de acidentes. A agressividade e o aumento da frequência do exameamento fazem com que elas estejam repetidamente envolvidas em ataques massivos a humanos e animais, tornando esse tipo de envenenamento um problema de saúde pública. A busca de tratamento para o envenenamento tem sido alvo de diversas pesquisas. De uma forma geral, os tratamentos atuam sobre os efeitos causados pelo veneno (medicamentos) ou sobre os componentes do veneno (soros e inibidores). Os principais componentes do veneno são a fosfolipase A2 (PLA2) e a melitina. A PLA2 é uma das principais proteínas do veneno, que degrada a membrana plasmática das células e tem o seu efeito potencializado pela presença da melitina. A PLA2 da Apis mellifera possui a estrutura protéica determinada e sítio ativo identificado. Essas características qualificam a PLA2 como potencial alvo de estudos de planejamento de fármacos. A estratégia de planejamento de fármacos tem como objetivo acelerar o processo de identificação de ligantes, contribuindo para o processo da descoberta de fármacos. Este trabalho teve como objetivo identificar in silico potenciais inibidores contra a PLA2 de Apis mellifera, avaliar in vitro e in vivo a potencial atividade inibitória dos compostos selecionados e identificar a citotoxicidade in vitro dos compostos. A estrutura da PLA2 foi obtida da base de dados (PDB) e a busca de compostos feita das bibliotecas Maybridge e Chembridge. A triagem virtual foi realizada com o auxilio do programa GOLD. Os compostos identificados (22 da Maybridge e 68 da Chembridge) pelos programas GOLD foram filtrados com o uso das ferramentas computacionais para seleção dos compostos com melhores interações no sítio ativo. Os parâmetros utilizados como filtros foram as análises das ligações químicas e os campos de interação molecular. Os compostos selecionados (20 da Maybridge e 29 da Chembridge) foram submetidos a um grupo de programas computacionais para predição de características físico-químicas (drug-like), toxicidade e atividade biológica dos ligantes. Os resultados das predições sugeriram que os compostos da Chembridge fossem utilizados nas análises experimentais. Os compostos da biblioteca Chembridge foram adquiridos (29 do total de 49 compostos). Os compostos tiveram as suas potenciais atividades inibitórias avaliadas in vitro e in vivo. A atividade fosfolipásica foi avaliada para os 29 compostos e 11 apresentaram atividade inibitória contra PLA2. Os 11 compostos foram avaliados in vivo com o experimento de indução de edema e 5 compostos conseguiram reduzir o edema. Os compostos foram avaliados em relação a citoxicidade que poderiam causar. A citotoxicidade in vitro foi calculada para 3 compostos dos 5 inibidores obtidos. O resultado do experimento identificou 2 compostos como citotóxicos e 1 com menor citotoxicidade. Apesar da citotoxicidade identificada, mais estudos devem ser realizados para determinar a concentração inibitória não tóxica. Portanto, o trabalho identificou 5 potenciais inibidores específicos contra a PLA2 de Apis mellifera. / Apis mellifera is an insect belonging to the order Hymenoptera , Apidae family , has cosmopolitan occurrence and major ecological , economic, and medical . The hybrid subspecies that occur in Brazil have predominantly African features and came to be known as Africanized bees . The main characteristics of Africanized bees are aggressive behavior , good disease resistance, high honey production and increased frequency of enxameamentos , which has caused concern to be monitored , the increase in the number of accidents . The aggressiveness and increased frequency of exameamento cause they are repeatedly involved in massive human and animal attacks , making this kind of poisoning a problem of public health. The search for treatments for poisoning has been the subject of several studies . In general , treatments act on the effects caused by poison ( drug ), or the components of poison ( sera and inhibitors) . The main components of the venom are A2 ( PLA2 ) and phospholipase melittin . PLA2 is a major venom proteins , which degrades the plasma membrane of the cells and its effect is potentiated by the presence of melittin . The Apis mellifera PLA2 has determined the protein structure and active site identified . These characteristics qualify PLA2 as a potential target for drug design studies . The strategy for drug design aims to accelerate the identification of ligands , contributing to the process of drug discovery . This study aimed to identify in silico potential inhibitors of PLA2 Apis mellifera , in vitro and in vivo the potential inhibitory activity of selected compounds and identify the in vitro cytotoxicity of the compounds . The structure of PLA2 was obtained from the database (PDB ) and the search for compounds made from Maybridge Chembridge and libraries. The virtual screening was done with the aid of the GOLD program. The identified compounds ( 22 and 68 of the Maybridge Chembridge ) by GOLD programs were filtered with the use of computational tools for the selection of compounds with better interactions in the active site . The parameters used were as filters analyzes of chemical bonds and the fields of molecular interaction. The selected compounds ( 20 and 29 of the Maybridge Chembridge ) were submitted to a group of computer programs for the prediction of physico- chemical characteristics ( drug -like) , toxicity and biological activity of the ligands . The results of the predictions suggest that the compounds of Chembridge were used in experimental analysis . The compounds were obtained from Chembridge library (29 of 49 compounds). The compounds had their potential inhibitory activity evaluated in vitro and in vivo . The phospholipase activity was assessed for compounds 29 and 11 showed inhibitory activity against PLA2 . The 11 compounds were evaluated in vivo experiment with the induction of edema and 5 compounds were able to reduce edema . The compounds were evaluated for cytotoxicity that could cause . The in vitro cytotoxicity was calculated for three of the compounds obtained 5 inhibitors . The result of the experiment identified as cytotoxic compounds 2 and 1 with lower cytotoxicity . Despite the cytotoxicity identified , further studies should be conducted to determine the non-toxic inhibitory concentration . Therefore, the study identified 5 potential specific inhibitors of PLA2 Apis mellifera.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:00:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rojas-Hualpa_JoseMiguel_M.pdf: 2266212 bytes, checksum: ad52a054d91af49b26ef11cf744381fe (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:30:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_VeronicaCristinaGomes_D.pdf: 49857534 bytes, checksum: b3727eb6c966531052574dc180e90fd1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Mesmo após décadas do descobrimento dos anti-inflamatórios inibidores de fosfolipase continua a busca por novas moléculas que sejam capazes de apresentar esse efeito terapêutico sem a indução de efeitos colaterais. O objetivo deste estudo foi obter extrato polar de partes aéreas de Tithonia diversifolia, viabilizando um padrão de qualidade para esse extrato a partir da identificação de seus principais constituintes e após essa determinação, avaliar o seu efeito sobre a atividade de frações de fosfolipase A2 básicas secretórias (sPLA2) obtidas de Bothrops jararacussu (Bj) e Crotalus durissus ssp (Cd). Os extratos foram obtidos por infusão e decocção e após a identificação dos constituintes por cromatografia e LC/MS-MS, determinou-se que o extrato de melhor rendimento foi obtido por decocção e que seus principais constituintes são derivados do ácido cinâmico: cafeoil-glicosídico, tagitinina C e ácido quínico. A técnica de molecular imprint (MP) permitiu uma separação dos constituintes sendo uma metodologia prática. O extrato polar apresentou atividade anti-agregante plaquetária na concentração de 0,6 a 20µg/mL, frente ao estímulo de indução por trombina, o que representa que o chá não é tão inerte e que pode promover complicações em indivíduos com distúrbios de coagulação. A purificação de Bj e Cd foi realizada por técnicas cromatográficas, com rendimento de aproximadamente 30% (p<0,05) de sPLA2. Ensaio enzimático in vitro, que utilizou substrato cromogênico sintético de PLA2 o 4-nitro-3-octanoiloxi-benzóico (NOBA) identificou que o extrato polar foi capaz de reduzir em 60% (p<0,05) a atividade enzimática de sPLA2 de Bj, independente do tipo de tratamento aplicado. A redução da atividade de sPLA2 de Cd foi reduzida em 30% (p<0,05) quando a mesma foi incubada por 30 min em presença do extrato. As modificações dos efeitos patológicos causados por sPLA2s foram avaliadas por ensaios in vivo. A ação edematogênica de sPLA2 de Bj foi reduzida em 50% (p<0,05), quando esta estava em presença do extrato, independe de prévia incubação, já a mesma ação para sPLA2 de Cd foi reduzida drasticamente pelo extrato, no entanto, após 60 min da administração do agente indutor de inflamação, a capacidade miotóxica com consequente liberação de creatina-quinase (CK) foi modulada pelo extrato de forma distinta dependendo da fonte de sPLA2. Para sPLA2 de Bj o extrato promoveu uma atividade protetora de liberação de CK, pois reduziu a liberação da enzima quando foi aplicado intraperitoneal 30 min antes do agente agressor, no entanto, a sPLA2 de Cd apresentou capacidade reduzida de liberação de CK quando foi incubada com o extrato por 30min antes da aplicação do mesmo no músculo do cobaio. Diante da ação do extrato sobre a inflamação induzida por sPLA2 buscou-se, através de técnica da reação da polimerase em cadeia em tempo real (PCR em tempo real), determinar a influência do extrato na expressão de genes envolvidos na inflamação. Determinou-se que o gene Nf-Kb, embora responda a presença do extrato, é o que mais tardiamente é ativado (ou expresso), possivelmente por ser nuclear. Através desses ensaios foi possível determinar a ação desses extratos sobre a resposta inflamatória aguda induzida pela ação de sPLA2s de venenos de serpentes / Abstract: Even after decades of the discovery of the anti-inflammatory inhibitors of phospholipase, there is a continuous search for new molecules which are able to provide this therapeutic effect without inducing side effects. The aim of this study was to obtain polar extract of the aerial parts of Tithonia diversifolia, enabling a quality standard for this extract from the identification of its main constituents and after this determination, to evaluate its effect on the activity of fractions A2 phospholipase basic secretory (sPLA2) obtained from Bothrops jararacussu (Bj) and Crotalus durissus ssp (Cd). The extracts were obtained by decoction and infusion and after the identification of the chromatography and LC / MS-MS. It was determined that the best yield of extract was obtained by decoction and its main constituents are cinnamic acid derivatives: caffeoyl - glycosidic, tagitinina C and quinic acid. Molecular imprint technique (MP) enabled separation of the constituents being a practical methodology. The polar extract showed anti-platelet activity at a concentration of 0.6 to 20 ?g/mL, opposite the stimulus induced by thrombin, which indicates that tea is not as inert and may promote complications in patients with coagulation disorders. Purification of Bj and Cd was performed by chromatographic techniques, with a yield of approximately 30% (p<0,05) of sPLA2. In vitro enzyme assay, which used synthetic chromogenic substrate of sPLA2 4-nitro-3-octanoyloxy benzoic acid (NOBA), it was identified that the polar extract was able to reduce by 60% (p<0,05) the enzymatic activity of sPLA2 Bj, regardless of the type of treatment applied, the reduction of the activity of sPLA2 Cd was reduced by 30% (p<0,05) when it was incubated for 30 min in presence of the extract. The modifications of the pathological effects caused by sPLA2s were evaluated by in vivo tests. The edematous action of sPLA2 Bj was reduced by 50% (p<0,05) when it was in presence of the extract, independent of incubation, since the same action for sPLA2 Cd was drastically reduced by the extract, however, after 60 min of administration of the agent inducer of inflammation, the myotoxic capacity with consequent release of creatine - kinase (CK) was modulated by the statement differently depending on the source of sPLA2, sPLA2 Bj to extract promoted a protective activity of CK release, because it reduced the release of enzyme, when applied intraperitoneally, 30 min before the offending agent, however, sPLA2 Cd showed reduced ability to release when CK was incubated with the extract for 30 min before application of the same muscle. Before the action of the extract on the sPLA2 induced inflammation was sought through the technique of polymerase chain reaction in real time (real time PCR), to determine the influence of the extract on the expression of genes involved in inflammation. We determined that Nf - Kb gene was the answer that although the presence of the extract is that the later is activated (or expressed), possibly because it was nuclear. Through these studies it was possible to determine the effect of these extracts on the acute inflammatory response induced by the action of sPLA2s from snake venoms / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T10:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Heleno_MauricioAurelioGomes_D.pdf: 8695465 bytes, checksum: 8ac64464abefb901cab1d4e5b6b96336 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Uma grande variedade de toxinas provenientes de venenos animais tem sido largamente utilizada no estudo de mecanismos de ação e processos fisiológicos, sendo consideradas valiosas ferramentas moleculares. As serpentes peçonhentas expressam no veneno diversas proteínas muito estudadas e utilizadas clinicamente, apresentando diferentes graus de variabilidade inter e intraespecífica em suas composições e nos seus efeitos biológicos. O conhecimento obtido com os estudos destas moléculas tem grande importância clínica na compreensão dos processos fisiopatológicos envolvidos nos envenenamentos ofidicos e também acadêmico-tecnológica, devido à possibilidade do desenvolvimento de novos instrumentos moleculares utilizados na pesquisa e também de novos modelos moleculares para princípios ativos de drogas. Neste trabalho pesquisamos as atividades neurotóxica, miotóxica e inflamatória de uma PLA2 básica, D49, purificada do veneno da serpente Bothrops roedingeri após duas etapas cromatográficas, exclusão molecular em Sephadex G-75 e hidrofobicidade em HPLC de fase reversa em coluna 'mi'-Bondapak C-18. A BrTX-I apresentou massa molecular relativa em tomo de ~14 kDa (SDS-PAGE) e confirmada por espectrometria de massas (ESI-MS), em 14.358,69 Da. A análise da composição de aminoácidos da BrTX-I, revelou que esta é constituída aproximadamente por 120 resíduos aminoacídicos, com alto conteúdo de aminoácidos básicos e hidrofóbicos, resultando em um valor calculado de pI de 8,63. A presença de 14 resíduos de cisteína sugere a formação de sete pontes dissulfeto. A análise estrutural da BrTX-I foi realizada por ESI-MS e as regiões analisadas mostraram semelhança com outras PLA2 miotóxicas isoladas de venenos botrópicos. A BrTX-I apresentou alta atividade PLA2 e um comportamento tipo sigmoidal em baixas concentrações do substrato. Atividade PLA2 ótima da BrTX-I foi em pH 8,0 e temperatura de 37°C. A BrTX-I mostrou-se dependente de Ca2+ (mM) e na sua substituição por zn+2, Mn+2, Mg+2 e Cd+2 a atividade foi reduzida. O estudo da homologia sequencial da BrTX-I mostrou posições extremamente conservadas na molécula. Nas posições 1 e 2 há predominância da sequência de aminoácidos (DL), na posição 4 (Q). Uma das regiões altamente conservadas na sequência de aminoácidos das PLA2 é a alça de ligação ao cálcio, segmento ...YGCYCGXGG. Resíduos formando a alça de ligação ao cálcio e a rede catalítica da BrTX-I mostraram um alto grau de conservação, refletindo na manutenção da atividade. A região relacionada à atividade neurotóxica pré-sináptica (80-11 O) apresentou principalmente resíduos hidrofóbicos. Em preparações ex vivo, o veneno e a BrTX-I causaram rápido bloqueio da neurotransmissão na preparação biventer cervicis de pintainho de modo similar a outras Bothrops, sem alterar significativamente as respostas contraturantes à adição de AChe de KCl (5 e 20 'mi'g/mL), indicando atividade neurotóxica pré-sináptica. Em camundongos, a BrTX-I induziu miotoxicidade local, determinada pelo aumento nos níveis plasmáticos de CK e mostrou efeito pró-inflamatório analisado através da formação do edema de pata e liberação das citocinas IL-1 , IL-6 e TNF-'alfa'. Como BrTX-I produz um efeito inflamatório, a hidrólise de fosfolipídios pode ser relevante na fisiopatología do envenenamento / Abstract: A great variety of animal venom toxins has been widely used in the study of action mechanisms and metabolic processes, thus considered valuable molecular tools. Poisonous snakes contains in their venom several well studied and clinically used proteins, showing these venoms different intra or interspecific variability degrees in their composition and biological effects. The knowledge obtained with these molecules study, has a great clinical relevancy understanding pathophysiological process regarding snake envenomations, and also academic technological, due to the possibility to develop new molecular tools and new molecular models to study active principies of some drugs. ln this work, we study neurotoxic, myotoxic and inflammatory activities of BrTX-I, a basic PLA2, purified from Bothrops roendigeri snake venom after two chromatographic steps, using molecular exclusion chromatography (Sephadex G-75) and reverse phase HPLC on 'mi'-Bondapak C-18 column. BrTX-I showed relative molecular mass around 14 kDa (PAGE) and specific molecular mass of 14,358.69 Da was determined by ESl-MS mass spectrometry. The amino acid composition analysis showed that BrTX-I contains 120 aminoacidic residues with high content of basic and hydrophobic amino acids, resulting in a calculated pi value of 8. 63. The presence of 14 Cysteine residues, suggests the formation of seven dissulfide bonds. Structural analysis of BrTX-I PLA2, performed by ESI-MS showed high identity values when compared to other myotoxic PLA2, isolated from Bothrops snakes venoms. BrTX-I presented high PLA2 activity and showed a sigmoidal behavior at low substrate concentrations. The BrTX-I reached its maximal PLA2 activity at pH 8.0 and 37 °C. Maximum PLA2 activity required Ca2+ (mM) and substitution of Ca2+ by zn+2, Mn+2, Mg+2 or Cd+2 showed reduced enzymatic activity. Sequence homology studies of BrTX-I showed extremely conserved positions in the molecule. ln positions 1 and 2, there is a predominance of the amino acids sequence (DL), and in position 4 (Q). One of the highly conserved regions in the amino acid sequences of PLA2 is the Ca2+ -binding loop, segment ... YGCYCGXGG. Residues forming the Ca2+-binding loop and the catalytic network of BrTX-I PLA2 showed a high conservation grade, reflecting the non-decreased catalytic activity. The region related to the presynaptic neurotoxic activity (80-110), showed mainly the presence of hydrophobic residues. ln ex vivo studies, the whole venom and BrTX-I caused a fast blockade of the neuromuscular transmission in young chick biventer cervicis preparations m a similar way to other Bothrops species, without alters significantly the contractures induced by ACh and KCL at doses of 5 and 20 'mi'g/mL, respectively, indicating presynaptic neurotoxic activity. ln mice, BrTX-I induced local myotoxicity, determined by increase in CK serum leveis, and showed proinflammatory effects analyzed through edema-forming activity and citokines IL-1 , IL-6, and TNF'alpha' release. Once BrTX-I induces a strong pro-inflammatory effect, the enzymatic phospholipid hydrolysis may be relevant for envenomation pathophysiology / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T11:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ponce-Soto_LuisAlberto_D.pdf: 2824712 bytes, checksum: 7aeb46c8d2e647484f7c95e4df5cfb42 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Através de metodologias otimizadas de purificação em HPLC, foram purificadas novas toxinas a partir do veneno total de Crotalus durissus collilineatus (V-1), Bothrops jararacussus PLA2 D49 Bj-V (isoforma de Bj-IV) obtida da fração BthTX-II e Bothrops alternatus PLA2 K49 Bt II-2; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. A nova neurotoxina V-1 de Crotalus durissus collilineatus caracterizada físico-quimicamente como desprovida de atividade catalítica, ácida e com uma massa molecular de 9859.45 Da, uma única cadeia polipeptídica, induz uma facilitação contínua no modelo biológico nervo frênico diafragma isolado de camundongo e uma facilitação pronunciada seguida de um bloqueio súbito em biventer cervicis de pintainho, na junção neuromuscular. Os estudos estruturais, neurotóxicos e miotóxicos da PLA2 F6 do complexo crotoxina de Crotalus durissus collilineatus mostram que a PLA2 F6 precisa da crotapotina (estudos de re-associação) para potencializar seu efeito neurotóxico na preparação nervo frênico diafragma isolado de camundongo, mas a PLA2 F6 é capaz de induzir neurotoxicidade in vitro na ausência de crotapotina na preparação biventer cervicis de pintainho. Foram purificadas, a partir da fração BthTX-II, duas PLA2 D49 Bj-IV e V, sendo consideradas como isoformas devido ao fato de que compartilham de várias características físico-químicas, tais como: massa molecular, tempo de retenção na re-purificação em HPLC de fase reversa, análise de composição de aminoácidos, pI e estrutura primária, embora a isoforma Bj-V apresente algumas mutações com respeito à isoforma Bj-IV: W3 -> F3, Q4 -> E4, F5 -> W5, I16 -> N16 e G41 -> 41D; importantes para a atividade catalítica, os efeitos neurotóxicos in vitro foram mantidos e, quando foram inibidas cataliticamente por crotapotinas crotálicas de Crotalus durissus collilineatus (F3 e F4), continuaram diminuindo a resposta contrátil na junção neuromuscular nas preparações nervo frênico diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho, mostrando que são mais pronunciadas no músculo esquelético de camundongo. A nova toxina Bt II-2 purificada, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, do veneno de Bothrops alternatus, foi caracterizada como uma PLA2 básica K49, em função das características físico-químicas, evidenciadas: massa de 13898.71 Da, possui caráter básico e uma alta homologia seqüencial na sua estrutura primária, quando comparada com outras PLA2 K49 procedentes de veneno de serpentes.Essa nova PLA2 K49 Bt II-2 revelou um potente efeito neurotóxico in vitro na preparação nervo frênico diafragma isolado de camundongo (1 µg/mL) pré-sináptico, como foi mostrado nos estudos de estímulo indireto via nervo e potencial de membrana ou repouso, diferentemente de qualquer PLA2 neurotóxica botrópica que, para causar um efeito neurotóxico, precisa de dosagem acima de 50 µg/mL. Outros perfis biológicos foram estudados para a Bt II-2, que mostrou uma miotoxicidade local ¿in vivo¿, citotoxicidade em mioblastos e miotubos C2C12, atividade inflamatória e letalidade, corroborando que se enquadra dentro da família de proteínas PLA2 homólogas K49, mas com características únicas nos estudos de neurotoxicidade in vitro. A reprodutibilidade da atividade biológica, através dos efeitos farmacológicos, só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas que mantenham a integridade da função biológica. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC, LC, espectrometria de massa, cujos resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada por veneno total ou frações impuras. Essa abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo revelar mecanismos ainda desconhecidos na relação estrutura-função das PLA2 procedentes de veneno de serpentes. A presença de um sítio farmacológico distinto do sítio catalítico presente nas PLA2 pode ser usada como ferramenta molecular para o reconhecimento dos receptores de membrana desconhecidos em células ou tecidos / Abstract: Through optimized methodologies of purification in HPLC, new toxins were purified from total venom of Crotalus durissus collilineatus (V-1), Bothrops jararacussus PLA2 D49 Bj-V (Bj-IV isoform) obtained from the fraction BthTX-II and Bothrops alternatus PLA2 K49 Bt II-2; with a high level of purity and molecular homogeneity, with no loss of biological activity. The new neurotoxin V-1 of Crotalus durissus collilineatus, chemically and physically characterized as unproved of catalytic, acid activity and with a molecular mass of 9859.45 Da, an only polypeptide sequence, induces to a continual facilitation in the biological isolated mouse phrenic nerve diaphragm model of mouse and a pronunciated facility of a subital block in chick biventer cervicis preparation en, in the neuromuscular junction. The structural, neurotoxic and miotoxic studies on PLA2 F6 from crotoxin complex of Crotalus durissus collineatus show crotapotin is necessary (re-association studies) to increase its neurotoxic effect in nerve phrenic diaphragm isolated preparation of mouse, but the PLA2 F6 is able to induce neurotoxity in vitro in ausency of crotopatin in the preparation chick biventer cervicis. Two PLA2 D49 Bj-IV and V were purified from the fraction BthTX-II and considered isoform because they share several chemical and physical characteristics, such as molecular mass, retention time in re-purification in reverse phase HPLC, analyses of amino acid composition, pI and primary structure, although the Bj-V isoform shows some mutations regarding Bj-IV: W3 -> F3, Q4 -> E4, F5 -> W5, I16 -> N16 e G41 -> 41D isoform. Important for the catalytic activity, neurotoxic in vitro effects were maintained and, when catalytically inhibited by crotapotin crotalic of Crotalus durissus collilineatus (F3 e F4), they continued dimishing the contractile reply in neuromuscular junction in nerve phrenic diaphragm isolated preparations of mouse and preparation chick biventer cervicis, which shows they are more pronunciated in the skeleton muscle of the mouse. The new and purified BtII-2 toxin of venom of Bothrops alternatus, with a high level of purity and molecular homogeneity, was characterized as a PLA2 basic K49, because its chemical and physical evidenced characteristics, mass of 13898.71 Da, basic character and a high sequential homology in its primary structure, when it is compared with other PLA2 K49 from venom of serpents. This new PLA2 K49 Bt II-2 has revealed a potent neurotoxic effect in vitro in neuromuscular junction in nerve phrenic diaphragm isolated preparation of mouse (1 µg/mL) ante-synaptic, as it was proved by studies on indirect stimulus through nerve and potential of membrane or rest, differently of some neurotoxic botropic PLA2 that needs a dose above 50 µg/mL to cause a neurotoxic effect. Other biological profiles were studied for the Bt II-2, and the conclusion was a local myotoxic ¿living¿, a cytotoxic in myoblasts and myotubes C2C12, imflammatory and letality activity, showing they are fitted in the family of proteins PLA2 homologous K49, but with particular characteristics in studies on neurotoxic in vitro. The reprodubility of biological activity, through pharmacological effects, is just possible with the utilization of chemically homogenous fractions that maintain the integrity of biological function. These fractions were obtained with high efficient methodologies as HPLC, LC, and mass spectrometry, whose results may be associated with their biological activities, eliminating the subjectivity caused by total venom or impure fractions. This approximation may be applied in the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, and it may reveal still unknown mechanisms in the relation structure-function of PLA2 from the venom of serpents. The presence of a pharmacological site different of the catalytic one in the PLA2 may be used as a molecular instrument to the recognition of the receptors of unknown membranes in cells or tissues / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sérgio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carregari_VictorCorasolla_M.pdf: 2297387 bytes, checksum: fc95267d0ed3c753978294fe999d0cf7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente trabalho apresenta a purificação e caracterização bioquímica de uma nova PLA2 neurotóxica nomeada BbilTX-I isolada do veneno da serpente Bothriopsis bilineta. Esta proteína foi purificada através de dois passos cromatográficos, em Sephadex G75 e HPLC de fase reversa C18 (?Bondapak Watters). A BbilTX-I é uma PLA2D49, com elevada atividade catalítica, massa molecular de 14185,48 Da, e alta similaridade na sua sequência N-terminal com outras PAL2 de veneno de serpentes. A temperatura ótima para a atividade enzimática da BbilTX-I está entre 25Cº e 37 ºC. A fração BbilTX-I é cálcio dependente e tem a atividade enzimática bastante diminuída quando testadas com os íons divalentes. Da mesma forma como outras PLA2 descritas na literatura, a BbilTX-I mostra o pH ótimo em torno de 8. A fração F3 isoladas de crotapotinas crotálicas e a DA2-II extraída do soro de Didelphis albiventris apresentaram um efeito inibitório de mais de 50% sobre a atividade enzimática da toxina BbilTX-I. O efeito da concentração do substrato 4-nitro-3-(octanoiloxi) ácido benzóico sobre a atividade enzimática da BbilTX-I demonstrou que a toxina é uma enzima monomérica com tendência alostérica sugerindo provavelmente um mecanismo de cooperatividade positiva mnemônical. A PLA2 BbilTX-I inserida em preparação isolada de biventer cervicis de pintainho apresentou um efeito bloqueador da transmissão nervosa na junção neuromuscular, em doses de 10, 20, 30 e 50?g/ml e causou 50% de bloqueio em 20 minutos com 10 ?g/ml, 30 minutos com 20 ?g/ml, 22 minutos com 30 ?g/ml e 20 minutos com 50 ?g/ml. Como não houve alteração significativa na resposta ao KCl (usado para detectar danos na membrana celular) e à Acetilcolina (usada para identificar atividade sobre os receptores colinérgicos nicotinicos) podemos dizer que a PAL2 BbilTX-I é uma neurotoxina pré-sináptica não miotoxica, que atua no terminal nervoso da sinapse neuromuscular interferindo sabre a liberação da ACh. A crotapotina F3 isolada do veneno da serpente Crotalus durissus cascavella e o fator anti-homorrágico DA2-II isolado do soro de Dildelphis albiventris inibiram em 64% e 57% respectivamente a atividade edematizante da fração BbilTX-I demonstrando que a ação inflamatória desta proteína é dependente de sua ação catalítica / Abstract: In this present work we described the purification and functional characterization of a new neurotoxic PLA2, named BbilTX-I from Bothriopsis bilineata snake venom. This protein was by the combination of two chromatographic steps, Molecular Exclusion on a Sephadex lunm and Reverse Phase HPLC (RP-HPLC) on a C18 ?-Bondapack (Waters) column. BbilTX-I is a monomeric PLA2-D49 showing high purity degree in SDS-PAGE in both reducing and non-reducing conditions. The purity of the toxin was confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry and shows a molecular mass of 14185.48 Da. BbilTX-I posses a high catalytic activity upon 4-nitro-3-(octanoiloxi) benzóic acid as a substrate compare with other bothropic PLA2. The optimal temperature and pH for BbilTX-I activity was determinate between 25-37 °C and around 8, respectively. This PLA2 is Ca+2 dependent but others divalent ions significatively reduce its catalytic activity, when pre­incubated with the protein. Also were tested the effects of fraction F3, crotapotin from Crotalus durrisous cascavela, and anti-hemorrhagic factor DA2-Il from Didelphis albiventris opossum sera under optimal conditions; both fraction showed an inhibitory effect over the BbilTX-I catalytic activity. At different concentrations of the substrate this monomeric PLA2 show an allosteric behavior suggesting a positive cooperative mnemonical enzyme mechanism in the catalysis. BbilTX-I showed an inhibitor effect on neuromuscular nerve transmissions on the isolated muscle biventer cervicis. At doses at 10, 20, 30 and 50 g/ml it elicited a blockade of 50% of 20, 30, 22 and 20 minutes, respectively. The effect displayed by BbilTX-I did not with the responses evoked by the addition of KCl (cell membrane damage) and (Ach functionality of cholinergic receptors), thus, we can argue that BbliTX-I is a pre-synaptic neurotoxin impairing the Ach liberation. BbilTX-I shows itself as an edematogenic PLA2 when injected in the mouse right footpad, it elicited a 70% higher than of edema when compare with the control. The edemetogenic activity of this PAL2 is related to its catalytic activity since both are inhibited by F3 crotapotin and DA2-II, 64 and 57% respectively. The reproducibility of biological activity, through the pharmacologic effects, only is possible by the use of chemically homogeneous fractions that hold biological function integrity. This fraction was obtain with high efficiency methodologies like HPLC, mass spectrometry, this result can be associated with the biological activity, disregarding the subjectivity caused by the venom or by impure fractions. This kind of methodologies can be applied to biochemical, structure and function, logical and pharmacological studies, which can reveal unknown mechanism in the function-structure relationship of snake venom PLA2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

As Fosfolipases A2 (PLA2) são enzimas que atuam desconstruindo membranas celulares, resultando em ácidos graxos e lisofosfolipidios, causando inflamação tecidual. Evidências indicam que serpentes possuem uma resistência natural devido a propriedades presentes no sangue, que inibem ações de proteínas presentes no veneno. Portanto, no presente trabalho foi isolado e caracterizado bioquimicamente e biologicamente o primeiro inibidor de PLA2 do tipo gama (&#947;PLI) do soro da serpente B. jararaca, denominado PLI_BJ. O inibidor de PLA2 foi isolado utilizando dois passos cromatográficos. O PLI_BJ mostrou, por SDS-PAGE, uma massa molecular aparente de 25 000 e 20 000 em condições redutoras e não redutoras, respectivamente. A sequência de aminoácidos parcial de PLI_BJ foi determinada por espectrometria de massa e corresponde a 72% e 68% de cobertura da sequência de aminoácidos de duas proteínas já descritas como PLI. O PLI_BJ mostrou também atividade inibitória satisfatória nos três testes realizados sugerindo um papel deste inibidor nos efeitos de envenenamento da serpente. / Phospholipases A2 (PLA2) are enzymes that act on cell membrane phospholipids resulting in fatty acids and lysophospholipids, deconstructing the cell wall causing tissue inflammation. Evidence indicates that snakes have natural resistance due to protective properties of blood that inhibits the action of proteins present in the venom. This study aimed to purify and characterize PLA2 inhibitors (PLI) from serum of the Bothrops jararaca snakes. PLA2 inhibitor was isolated using two chromatographic steps, and was named PLI_BJ. The purity of the PLI_BJ was confirmed by HPLC and SEC. The PLI_BJ showed, by SDS-PAGE, an molecular mass of 25,000 and 20,000 under reducing and non-reducing conditions, respectively. The partial amino acid sequence of PLI_BJ was determined by mass spectrometry and it corresponds to 72% and 68% of coverage of the amino acid sequence of two proteins already described as PLI. The PLI_BJ also showed satisfactory inhibitory activity in the three tests performed suggesting a role of this inhibitor in snake envenomation effects.

Os venenos de serpentes são misturas complexas com composição variada, possuindo constituintes orgânicos e inorgânicos. Dentre os compostos orgânicos, destacam-se as proteínas, tóxicas e/ou com altas atividades enzimáticas. Desta forma, os venenos desenvolvem importante papel na captura de presas e auxílio à digestão. Venenos de serpentes da família Viperidae apresentam ampla e variada gama de ações biológicas, como proteólise, coagulação, hemorragia, neurotoxicidade e miotoxidade. Populações de serpentes habitantes endemicamente em ilhas são bons modelos para estudos de evolução, especialmente quando comparadas a espécies de mesmo gênero que habitam o continente. Espécies ancestrais de serpentes do gênero Bothrops sofreram isolamento geográfico cerca de 9 mil anos atrás, quando no Período Pleistoceno porções de terra na região Sudeste do Brasil foram isoladas do continente, levando a formação de ilhas costeiras, devido a elevação do nível do mar. Tal isolamento deu origem a novas espécies insulares pertencentes ao gênero Bothrops. Estudos relacionados aos venenos destas espécies, suas especificidades e diferenças com relação a serpentes continentais são escassos. O Arquipélago de Alcatrazes localiza-se no litoral de São Paulo, distando aproximadamente 35 Km da costa. Não há relatos da existência de mamíferos na ilha, com exceção de morcegos. Serpentes adultas da espécie Bothrops alcatraz, endêmica da Ilha de Alcatrazes, apresentam características encontradas em serpentes juvenis do grupo das jararacas, como a dieta baseada exclusivamente em animais ectotérmicos e a composição diferenciada do veneno. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar as principais ações do veneno da serpente B. alcatraz, espécie endêmica e ilhoa, isolando cromatograficamente suas frações. Resultados indicam no veneno de B. alcatraz apresenta as atividades coagulante sobre plasma humano, fosfolipásica, miotóxica e edematogênica mais ativas quando comparadas com as ações do veneno de B. jararaca do continente. As ações proteolítica, hemorrágica e toxicidade para camundongos são mais potentes no veneno de B. jararaca. A presença de ação neurotóxica específica para artrópodes no veneno de B. alcatraz sugere a ação de uma fosfolipase A2, a qual foi isolada cromatograficamente. As propriedades e composição do veneno de B. alcatraz indicam uma provável evolução de toxinas adaptadas a seu tipo de presa/alimento. / Snakes venoms are complex mixtures with varied composition constituted by organic and inorganic molecules. The main organic components are proteins, which can be toxic and show high enzymatic activities, thus playing important role in prey capture and digestion in snakes. Viperidae snakes family show wide range of biological actions, as proteolytic, coagulant, hemorrhagic, neurotoxic and myotoxic activities. Snake populations inhabiting endemically islands are useful models for evolution studies, specially when compared to their congeneric continental species. Bothrops species ancestors from Southeastern Brazil underwent geographic isolation about 9 thousand years ago, during the Pleistocene Period, when land portions were separated from the continent by the sea. The isolation originated new (island endemic) Bothrops species. Studies related to those snake venoms, its specialties and differences among continental species of the genera Bothrops are scarce. The Alcatrazes Archipelago is located in São Paulo coast, 35 kilometer far from the continent. There are no register of mammals in those islands, except for bats. Bothrops alcatraz is endemic from the Alcatrazes Island. Adults show some similarities to young specimens from the continental jararaca group. They feed exclusively on ectothermic animals and their venom shows a different composition. The aim of this study was to analyze the endemic island snake, B. alcatraz, venom, isolating by chromatography the venom fractions. Results indicated that B. alcatraz venom presents coagulant, phospholipase, myotoxic and edema forming activities higher than continental B. jararaca venom. The proteolytic, haemorrhagic and mice toxicity are higher on B. jararaca venom. The specific neurotoxic action in arthropods of B. alcatraz venom suggests a phospholipase A2 action, which was isolated bt cromatography. The properties and composition of B. alcatraz venom indicates a possible evolution of toxins adapted to the prey kinds.

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

A bothropstoxina I (BthTX-I) é uma miotoxina isolada do veneno da serpente brasileira Bothrops jararacussu, a qual é um membro da família das fosfolipases A2, mas não apresentam atividade catalítica devido á substituição D49K. A proteína for fornecida pelo Prof. Dr. J. R. Giglio e Profa. Dra. A. C. O. Cintra do Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e usada em experimentos de cristalização, os quais foram realizados usando a técnica de difusão de vapor \"hanging drop\" a 18°C. A BthTX-I cristalizou em tampão HEPES 0.1 M, pH variando entre 7.0 e 7.6. O agente precipitante foi o (NH4)SO4 em concentrações que variaram de 57% a 62% de saturação. A coleta de dados foi inicialmente feita utilizando o difratômetro automático R-AXIS IIC da Rigaku Co. do Laboratório de Cristalografia de proteínas do IFSC-USP. Subseqüentemente foi realizado uma segunda coleta de dados no SERC Daresbury Laboratory na Inglaterra, usando radiação síncrotron. A BthTX-I cristalizou no grupo espacial P3121 com os seguintes parâmetros de rede: a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. O processamento de dados foi realizado com o programa MOSFLM, conduzindo a um Rmerge=6.3% e completeza de 99.6% a uma resolução de 2.1 ANGSTROM. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular, utilizando o programa AMoRe, onde foi utilizada como modelo inicial a estrutura da miotoxina da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus e refinada usando o programa XPLOR que conduziu a um fator Rfinal= 18.7% e Rfree=27.4%. A unidade assimétrica contém dois monômeros, os quais podem ser escolhidos de forma a apresentar interações similares aquelas descritas para a miotoxina II da Bothrops asper. A superfície de interface é entretanto, surpreendentemente pequena quando comparada com outras estruturas diméricas e a complementaridade é menor do que o valor esperado. Um modelo teórico para a ligação do fosfolipídeo na BthTX-I sugere que nenhuma interação direta entre a ligação ester sn-2 e a K49 deve ser esperada de forma a explicar a falta de atividade catalítica. Foi visto também, que é possível se reproduzir um dendrograma baseado na seqüência de aminoácidos, pelo uso de estruturas tridimensionais para os membros da família das PLA2 / Bothropstoxin- I (BthTX-I) is a myotoxin isolated from the Brazilian snake Bothrops jararacussu which is a member of the phospholipase A2 but presents no catalytic activity due to a D49K substitution. Protein was provided from the Departamento de Medecina de Ribeirão Preto by Prof. Dr. J. R. Giglio and Profa. Dra. A. C. O. Cintra and used in crystallization experiments which were performed using the vapor diffusion technique in hanging drops at 18°C. The BthTX-I crystallized in 0.1 M HEPES, pH ranging from 7.0 to 7.6. The precipitant was (NH4)SO4 in concentrations ranging from 57% to 62%. The data collection was initially performed using the automatic difractometer R-AXIS IIC from the Rigaku Co. at the Laboratório de Cristalografia of IFSC-USP. Subsequently a second data set was collected at SERC Daresbury Laboratory in England using synchrotron radiation. BthTX-I crystallizes in space group P3121 with a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. Processing of the data was performed with the MOSFLM program yielding an Rmerge= 6.3% and completeness of 99.6% at 2.1 ANGSTROM. resolution. The structure was solved by Molecular Replacement using the package AMoRe with the Agkistrodon piscivorus piscivorus enzyme as search model and refined using the refinement program X-PLOR to a Rfinal= 18.7% and Rfree=27.4%. The asymmetric unit contains two BthTX-I monomers, which can be chosen such that they present similar interactions to those described for the homologous myotoxin II from Bothrops asper. The interface is, however, surprisingly small when compared to other dimeric structures and is less complementary than expected. A theorical model for phospholipid building to BthTX-I suggests that no direct interactions between the sn-2 ester bond and K49 would be expected, thus explaining the lack of catalytic activity. It is shown that it is possible to reproduce a dendrogram based on amino acid sequences and by the use of three dimensional structures for members of the PLA2 family