Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando uma PTP intermediária tiofosforilada e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato na fase gasosa foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica ab initio e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e mecânica molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando estes caminhos de reação e outros dados ab initio. A calibração permitiu que conclusões semiquantitativas pudessem ser obtidas a partir das simulações enzimáticas. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo com caráter de metafosfato. As barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion desprotonado e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína para serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inacessíveis. / Protein tyrosine phosphatases (PTPs) catalyse the hydrolysis of phosphotyrosine from other proteins and, hence, regulate important biochemical processes. Two members from this family are the dual specificity phosphatases VHR and CDC25B. The first step of the catalysed reaction is the nucleophilic attack from the side chain of a cystein towards the substrate, with a possible H+ transfer from a general acid to the leaving group, forming a PTP thiophosphorylated intermediate and dephosphorylating the substrate. There are still some doubts about this step, involving the protonation states of the substrate and the nzymatic nucleophile, the inactivity of certain mutants and the identification of the general acid in CDC25s. We tried to solve this questions by computer simulations of the reactions catalysed by VHR and by CDC25B. Initially, reaction pathways of phosphate esters thiolysis and alcoholysis in the gas-phase were determined by ab initio electronic structure calculations and analysed as benchmarks for the intrinsic reactivity of phosphate esters and as models of the enzymatic activity. A hybrid potential of quantum mechanics and molecular mechanics was fully tested and calibrated, employing these reaction pathways and other ab initio data. The calibration allowed that semiquantitative conclusions could be obtained from the enzymatic simulations. Potentials of mean force were determined with the hybrid potential for the dephosphorylation of different substrates catalysed by the wild-type PTPs and their mutants. The results show that the catalysed reaction mechanism follows a concerted addition and elimination, with a dissociative transition state with metaphosphate-like. The calculated barriers are very close to the experimental activation energies. The enzymatic substrate is a deprotonated dianion and the nucleophile is ionised. The reactions of the protonated substrate or nucleophile have barriers, at least, 15 kcal/mol higher than the experimental results. The active site cystein to serine VHR mutant is inactive because the serine is protonated. The CDC25s do not employ a general acid for catalysis, differently from the other PTPs. Proposals that the general acid is the substrate or one of the glutamic acids present in the active site are not energetically accessible.

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao Ψmm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do Ψmm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o Ψmm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre Ψmm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The Ψmm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased Ψmm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that Ψmm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between Ψmm and nuclear fragmentation was observed.

Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando uma PTP intermediária tiofosforilada e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato na fase gasosa foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica ab initio e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e mecânica molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando estes caminhos de reação e outros dados ab initio. A calibração permitiu que conclusões semiquantitativas pudessem ser obtidas a partir das simulações enzimáticas. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo com caráter de metafosfato. As barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion desprotonado e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína para serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inacessíveis. / Protein tyrosine phosphatases (PTPs) catalyse the hydrolysis of phosphotyrosine from other proteins and, hence, regulate important biochemical processes. Two members from this family are the dual specificity phosphatases VHR and CDC25B. The first step of the catalysed reaction is the nucleophilic attack from the side chain of a cystein towards the substrate, with a possible H+ transfer from a general acid to the leaving group, forming a PTP thiophosphorylated intermediate and dephosphorylating the substrate. There are still some doubts about this step, involving the protonation states of the substrate and the nzymatic nucleophile, the inactivity of certain mutants and the identification of the general acid in CDC25s. We tried to solve this questions by computer simulations of the reactions catalysed by VHR and by CDC25B. Initially, reaction pathways of phosphate esters thiolysis and alcoholysis in the gas-phase were determined by ab initio electronic structure calculations and analysed as benchmarks for the intrinsic reactivity of phosphate esters and as models of the enzymatic activity. A hybrid potential of quantum mechanics and molecular mechanics was fully tested and calibrated, employing these reaction pathways and other ab initio data. The calibration allowed that semiquantitative conclusions could be obtained from the enzymatic simulations. Potentials of mean force were determined with the hybrid potential for the dephosphorylation of different substrates catalysed by the wild-type PTPs and their mutants. The results show that the catalysed reaction mechanism follows a concerted addition and elimination, with a dissociative transition state with metaphosphate-like. The calculated barriers are very close to the experimental activation energies. The enzymatic substrate is a deprotonated dianion and the nucleophile is ionised. The reactions of the protonated substrate or nucleophile have barriers, at least, 15 kcal/mol higher than the experimental results. The active site cystein to serine VHR mutant is inactive because the serine is protonated. The CDC25s do not employ a general acid for catalysis, differently from the other PTPs. Proposals that the general acid is the substrate or one of the glutamic acids present in the active site are not energetically accessible.

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao Ψmm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do Ψmm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o Ψmm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre Ψmm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The Ψmm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased Ψmm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that Ψmm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between Ψmm and nuclear fragmentation was observed.

Introdução: A lesão de isquemia/reperfusão do fígado é caracterizada pelo agravamento da lesão isquêmica hepatocelular quando o órgão é revascularizado, podendo originar, nos casos mais graves, uma reação inflamatória sistêmica com lesão de órgãos à distância. O controle desse fenômeno é importante no transplante de fígado, nas cirurgias de ressecção hepática e no choque hemorrágico. A administração de soluções salinas hipertônicas têm se mostrado eficaz no tratamento do choque hemorrágico, pois melhora as alterações hemodinâmicas e, possivelmente, apresenta uma ação antiinflamatória. Neste trabalho foram avaliados os efeitos locais e sistêmicos da administração da solução salina hipertônica na lesão de isquemia/reperfusão hepática em ratos. Métodos: Enquanto 14 ratos Wistar machos, dos 56 utilizados no estudo, compuseram o grupo controle, grupo C; os demais, que foram submetidos à uma hora de isquemia hepática e 4 horas de reperfusão, compuseram outros grupos de 14 animais: o grupo ST, animais que não receberam tratamento; o grupo SSF, animais que receberam 34 mL/kg de NaCl 0,9%, por via endovenosa, 15 minutos antes da reperfusão; o grupo SSH, animais que receberam 4 mL/kg de NaCl 7,5%, 15 minutos antes da reperfusão. Após 4 horas de reperfusão, os materiais foram coletados para análise. Foram realizadas as dosagens das transaminases AST e ALT, a avaliação das funções oxidativas e fosforilativas mitocondriais, a dosagem das interleucinas IL-6 e IL-10, as análises teciduais pulmonares e a análise histológica do fígado isquêmico e não isquêmico. Resultados: Quando comparado aos grupos ST e SSF, o grupo SSH apresentou elevação dos níveis de AST e ALT significantemente menores; preservação da função mitocondrial tanto dos lobos isquêmicos, como dos não isquêmicos, significantemente melhor; elevação dos níveis de IL-6 e IL-10 sem significância estatística; aumento da permeabilidade vascular pulmonar significantemente menor; e elevação da atividade da mieloperoxidase pulmonar sem significância estatística. Em relação à análise histológica da lesão de isquemia/reperfusão hepática, o escore da lesão do grupo SSH foi significantemente menor que o da lesão do grupo C; entretanto, quando comparados os três grupos submetidos à isquemia hepática ST, SSH e SSF não se observaram diferenças significantes estatisticamente. Conclusão: A administração da solução salina hipertônica a 7,5% na isquemia/reperfusão hepática normotérmica melhorou as lesões hepáticas locais e as lesões à distância, principalmente pulmonares / Introduction: During liver ischemia, the drop in mitochondrial energy production leads to cellular damage, which is aggravated during restoration of blood supply. Besides local hepatic injury, the ischemia/reperfusion process can trigger a systemic inflammatory syndrome producing remote organ damage. To control these alterations in clinical conditions like liver transplantation, liver resections and hypovolemic shock, is crucial to achieve proper patient management. Aim: To evaluate the effect of the sodium chloride hypertonic solution on prevention of local and systemic injury during partial liver ischemia/reperfusion. Methods: Animals underwent partial warm liver ischemia/reperfusion. Fity six Wistar male rats were randomly allocated into four groups. Fourteen animals were submitted to sham operation and allocated to C group; 42, submitted to one hour of liver ischemia followed by 4 hours of reperfusion, were allocated in three additional groups: ST group, 14 animals that received no treatment; SSF group, 14 animals that received NaCl 0.9%, 34 mL/kg, intravenously; SSH group, animals that received NaCl 7.5%, 4 mL/kg, intravenously. Blood and tissue samples were collected four hours after reperfusion, when animals were killed. Blood samples were collected to determinate AST, ALT, IL-6 and IL-10 levels. Liver and pulmonary tissues were assembled for liver histology and for liver mitochondrial phosphorylation, pulmonary vascular permeability and myeloperoxidase analyzes. Results: Hypertonic saline solution showed beneficial effects in the treatment of liver ischemia/reperfusion injury. SSH group presented elevation of AST and ALT plasma levels significantly lower than ST and SSF groups. A significant reduction on mitochondrial dysfunction was observed in SSH group compared with ST and SSH groups. Elevation in serum IL-6 and IL-10 was similar among ST, SSF and SSH groups. Pulmonary vascular permeability was significantly lower in group SSH compared with ST and SSF groups. No differences in myeloperoxidase activity were observed among these three groups. Histological score for liver ischemia/reperfusion injury was significantly lower in SSH group compared to ST group, however no differences were observed between SSH and SSF groups. Conclusion: Administration of hypertonic saline solution in an experimental rat model of liver ischemia-reperfusion ameliorated local and systemic injuries

Introdução: A lesão de isquemia/reperfusão do fígado é caracterizada pelo agravamento da lesão isquêmica hepatocelular quando o órgão é revascularizado, podendo originar, nos casos mais graves, uma reação inflamatória sistêmica com lesão de órgãos à distância. O controle desse fenômeno é importante no transplante de fígado, nas cirurgias de ressecção hepática e no choque hemorrágico. A administração de soluções salinas hipertônicas têm se mostrado eficaz no tratamento do choque hemorrágico, pois melhora as alterações hemodinâmicas e, possivelmente, apresenta uma ação antiinflamatória. Neste trabalho foram avaliados os efeitos locais e sistêmicos da administração da solução salina hipertônica na lesão de isquemia/reperfusão hepática em ratos. Métodos: Enquanto 14 ratos Wistar machos, dos 56 utilizados no estudo, compuseram o grupo controle, grupo C; os demais, que foram submetidos à uma hora de isquemia hepática e 4 horas de reperfusão, compuseram outros grupos de 14 animais: o grupo ST, animais que não receberam tratamento; o grupo SSF, animais que receberam 34 mL/kg de NaCl 0,9%, por via endovenosa, 15 minutos antes da reperfusão; o grupo SSH, animais que receberam 4 mL/kg de NaCl 7,5%, 15 minutos antes da reperfusão. Após 4 horas de reperfusão, os materiais foram coletados para análise. Foram realizadas as dosagens das transaminases AST e ALT, a avaliação das funções oxidativas e fosforilativas mitocondriais, a dosagem das interleucinas IL-6 e IL-10, as análises teciduais pulmonares e a análise histológica do fígado isquêmico e não isquêmico. Resultados: Quando comparado aos grupos ST e SSF, o grupo SSH apresentou elevação dos níveis de AST e ALT significantemente menores; preservação da função mitocondrial tanto dos lobos isquêmicos, como dos não isquêmicos, significantemente melhor; elevação dos níveis de IL-6 e IL-10 sem significância estatística; aumento da permeabilidade vascular pulmonar significantemente menor; e elevação da atividade da mieloperoxidase pulmonar sem significância estatística. Em relação à análise histológica da lesão de isquemia/reperfusão hepática, o escore da lesão do grupo SSH foi significantemente menor que o da lesão do grupo C; entretanto, quando comparados os três grupos submetidos à isquemia hepática ST, SSH e SSF não se observaram diferenças significantes estatisticamente. Conclusão: A administração da solução salina hipertônica a 7,5% na isquemia/reperfusão hepática normotérmica melhorou as lesões hepáticas locais e as lesões à distância, principalmente pulmonares / Introduction: During liver ischemia, the drop in mitochondrial energy production leads to cellular damage, which is aggravated during restoration of blood supply. Besides local hepatic injury, the ischemia/reperfusion process can trigger a systemic inflammatory syndrome producing remote organ damage. To control these alterations in clinical conditions like liver transplantation, liver resections and hypovolemic shock, is crucial to achieve proper patient management. Aim: To evaluate the effect of the sodium chloride hypertonic solution on prevention of local and systemic injury during partial liver ischemia/reperfusion. Methods: Animals underwent partial warm liver ischemia/reperfusion. Fity six Wistar male rats were randomly allocated into four groups. Fourteen animals were submitted to sham operation and allocated to C group; 42, submitted to one hour of liver ischemia followed by 4 hours of reperfusion, were allocated in three additional groups: ST group, 14 animals that received no treatment; SSF group, 14 animals that received NaCl 0.9%, 34 mL/kg, intravenously; SSH group, animals that received NaCl 7.5%, 4 mL/kg, intravenously. Blood and tissue samples were collected four hours after reperfusion, when animals were killed. Blood samples were collected to determinate AST, ALT, IL-6 and IL-10 levels. Liver and pulmonary tissues were assembled for liver histology and for liver mitochondrial phosphorylation, pulmonary vascular permeability and myeloperoxidase analyzes. Results: Hypertonic saline solution showed beneficial effects in the treatment of liver ischemia/reperfusion injury. SSH group presented elevation of AST and ALT plasma levels significantly lower than ST and SSF groups. A significant reduction on mitochondrial dysfunction was observed in SSH group compared with ST and SSH groups. Elevation in serum IL-6 and IL-10 was similar among ST, SSF and SSH groups. Pulmonary vascular permeability was significantly lower in group SSH compared with ST and SSF groups. No differences in myeloperoxidase activity were observed among these three groups. Histological score for liver ischemia/reperfusion injury was significantly lower in SSH group compared to ST group, however no differences were observed between SSH and SSF groups. Conclusion: Administration of hypertonic saline solution in an experimental rat model of liver ischemia-reperfusion ameliorated local and systemic injuries

INTRODUÇÃO: Na Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 2 (NEM2), o desenvolvimento do Carcinoma Medular de Tireoide (CMT), Feocromocitoma (FEO) e Hiperparatireoidismo primário (HPT) está associado à mutações germinativas ativadoras no proto-oncogene RET. Casos de CMT esporádico podem apresentar mutações somáticas no RET (~40%). A variabilidade fenotípica observada em casos de CMT e FEO familiais associados à NEM2 indica o envolvimento de eventos genéticos adicionais que seriam responsáveis pelas diferenças clínicas observadas nos indivíduos afetados (idade de desenvolvimento, progressão e agressividade do tumor). Outras alterações genéticas no RET como duplas mutações, SNPs e haplótipos específicos podem influenciar na susceptibilidade, agressividade e modulação do fenótipo NEM2. Entretanto, os estudos de outros genes envolvidos no processo da tumorigênese NEM2 ainda estão em andamento. Recentemente foi mostrado que RET ativado controla a expressão de proteínas inibidoras do ciclo celular (p18 e p27). Mutações germinativas no gene p27 foram recentemente associadas à susceptibilidade de tumores neuroendócrinos e estão associadas à síndrome NEM4 (Neoplasia endócrina múltipla tipo 4). Mutações somáticas, inativadoras de p27, são raramente encontradas em vários tipos de tumores. Entretanto, diversos estudos documentaram que a redução na expressão e a sublocalização citoplamática de p27 são controladas por alterações pós-transducionais e/ou epigenéticas. OBJETIVOS: o estudo teve como objetivos avaliar a participação de genes, recentemente associados ao RET ativado, em tumores de pacientes com NEM2 e também verificar se polimorfismos no gene p27 estariam atuando como moduladores de fenótipo em uma grande família com NEM2. CASUÍTICA: foram analisadas 66 amostras tumorais advindas de 36 pacientes com diagnóstico clínico e genético de NEM2 e 28 indivíduos pertencentes a uma grande família com NEM2A-CMTF e mutação C620R no gene RET. MÉTODOS: As análises somáticas do p27 e também de p15, p18 e RET foram realizadas por PCR e sequenciamento direto de DNA e análise de microssatélites para p27 foi realizada por PCR e eletroforese capilar. Análises de expressão e localização da proteína p27 celular foram realizadas por Western blot e imunohistoquímica. A análise da modulação de fenótipo na família com NEM2A foi realizada por meio da amplificação do éxon 1 do gene p27 na amostra de sangue total. RESULTADOS: Não foram encontradas mutações somáticas no gene p27 e também nos genes p15 e p18. Entretanto, verificamos baixa expressão proteica de p27 em tumores CMT e FEO, a qual se encontrava relacionada com o tipo e agressividade do códon mutado no RET, principalmente em tumores que apresentavam mutação RET no códon 634 (controle x 634 p=0,05; controle x 634/791 p= 0,032; 620 x 634 p=0,045; 620 x 634/791 p= 0,002; 620 x 634 + 634/791 p=0,036). Notou-se também correlação positiva entre os níveis de expressão de p27 na localização nuclear, analisada por imunohistoquímica, e o genótipo TT do SNP p27 p.V109G (p=0,03). CONCLUSÕES: Alterações moleculares somáticas no gene p27 nos tumores NEM2 não são frequentes. Entretanto, a redução na expressão e a localização citoplasmática de p27 provavelmente estão associadas a alterações somáticas em outros genes que controlam os processos de fosforilação da proteína p27 (eventos pós-transducionais) / INTRODUCTION: In Multiple Endocrine Neoplasia type 2 (MEN2) the development of medullary thyroid carcinoma (MTC), pheochromocytoma (PHEO) and primary hyperparathyroidism (HPT) are associated with activating germline mutations in RET proto-oncogene. Cases of sporadic MTC may have somatic RET mutations (~ 40%). The phenotypic variability observed in cases with familial MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 indicates the probable involvement of additional genetic events that could be responsible for the clinical differences observed in the affected individuals (age development, progression and aggressiveness of the tumor). Other genetic alterations such as RET double mutations, SNPs and specific haplotypes may influence susceptibility, aggressiveness and MEN2 phenotype modulation. However, studies of other genes involved in the tumorigenesis of MEN2 are still in progress. Recently, it was shown that the activated RET controls the expression of cell cycle inhibitory proteins (p18 and p27). Germline mutations in the p27 gene have recently been associated with the susceptibility to neuroendocrine tumors and are associated with the MEN4 syndrome (Multiple endocrine neoplasia type 4). Somatic inactivating mutations p27 are rarely found in many types of tumors. However, several studies have documented that reduced expression and subcellular location of p27 is controlled by post-transductional changes and/or epigenetic factors. OBJECTIVES: This study aimed to evaluate the role of genes recently associated with RET activated in tumors from MEN2 patients and also check whether polymorphisms in the p27 gene would be acting as modulators of phenotype in a large MEN2 family. PATIENTS: We analyzed 66 tumor samples from 36 patients with clinical and genetic diagnosis of MEN2 and from 28 individuals belonging to a large family with FMTC/MEN2A and RET C620R mutation. METHODS: The analyses of somatic p27, p15, p18 and RET were performed by PCR and direct sequencing of DNA and microsatellite analysis was performed for p27 by PCR and capillary electrophoresis. Expression analysis and subcellular localization of p27 protein were performed by Western blot and immunohistochemistry. The analysis of phenotype modulation in MEN2A families was performed by the amplification of exon 1 of the p27 gene in a whole blood sample. RESULTS: There were no somatic mutations in the p27 gene and also in the p15 and p18 genes. However, we verified a low p27 protein expression in MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 that showed a definite correlation with the type and aggressiveness of the mutated RET codon, mainly in those tumors from cases with germline RET codon 634 mutations (control vs 634, p=0,05; control vs 634/791, p= 0,032; 620 vs 634, p=0,045; 620 vs 634/791, p= 0,002; 620 vs 634 + 634/791, p=0,036). It was also verified a positive correlation between the immunohistochemistry expression of nuclear p27 subcellular location and the p27 p.V109G TT genotype (p=0,03). CONCLUSIONS: The reduction in the expression of p27 and its subcellular localization are likely to be associated with somatic changes in other genes that control the processes of phosphorylation of p27 protein through post-transductional events

INTRODUÇÃO: Na Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 2 (NEM2), o desenvolvimento do Carcinoma Medular de Tireoide (CMT), Feocromocitoma (FEO) e Hiperparatireoidismo primário (HPT) está associado à mutações germinativas ativadoras no proto-oncogene RET. Casos de CMT esporádico podem apresentar mutações somáticas no RET (~40%). A variabilidade fenotípica observada em casos de CMT e FEO familiais associados à NEM2 indica o envolvimento de eventos genéticos adicionais que seriam responsáveis pelas diferenças clínicas observadas nos indivíduos afetados (idade de desenvolvimento, progressão e agressividade do tumor). Outras alterações genéticas no RET como duplas mutações, SNPs e haplótipos específicos podem influenciar na susceptibilidade, agressividade e modulação do fenótipo NEM2. Entretanto, os estudos de outros genes envolvidos no processo da tumorigênese NEM2 ainda estão em andamento. Recentemente foi mostrado que RET ativado controla a expressão de proteínas inibidoras do ciclo celular (p18 e p27). Mutações germinativas no gene p27 foram recentemente associadas à susceptibilidade de tumores neuroendócrinos e estão associadas à síndrome NEM4 (Neoplasia endócrina múltipla tipo 4). Mutações somáticas, inativadoras de p27, são raramente encontradas em vários tipos de tumores. Entretanto, diversos estudos documentaram que a redução na expressão e a sublocalização citoplamática de p27 são controladas por alterações pós-transducionais e/ou epigenéticas. OBJETIVOS: o estudo teve como objetivos avaliar a participação de genes, recentemente associados ao RET ativado, em tumores de pacientes com NEM2 e também verificar se polimorfismos no gene p27 estariam atuando como moduladores de fenótipo em uma grande família com NEM2. CASUÍTICA: foram analisadas 66 amostras tumorais advindas de 36 pacientes com diagnóstico clínico e genético de NEM2 e 28 indivíduos pertencentes a uma grande família com NEM2A-CMTF e mutação C620R no gene RET. MÉTODOS: As análises somáticas do p27 e também de p15, p18 e RET foram realizadas por PCR e sequenciamento direto de DNA e análise de microssatélites para p27 foi realizada por PCR e eletroforese capilar. Análises de expressão e localização da proteína p27 celular foram realizadas por Western blot e imunohistoquímica. A análise da modulação de fenótipo na família com NEM2A foi realizada por meio da amplificação do éxon 1 do gene p27 na amostra de sangue total. RESULTADOS: Não foram encontradas mutações somáticas no gene p27 e também nos genes p15 e p18. Entretanto, verificamos baixa expressão proteica de p27 em tumores CMT e FEO, a qual se encontrava relacionada com o tipo e agressividade do códon mutado no RET, principalmente em tumores que apresentavam mutação RET no códon 634 (controle x 634 p=0,05; controle x 634/791 p= 0,032; 620 x 634 p=0,045; 620 x 634/791 p= 0,002; 620 x 634 + 634/791 p=0,036). Notou-se também correlação positiva entre os níveis de expressão de p27 na localização nuclear, analisada por imunohistoquímica, e o genótipo TT do SNP p27 p.V109G (p=0,03). CONCLUSÕES: Alterações moleculares somáticas no gene p27 nos tumores NEM2 não são frequentes. Entretanto, a redução na expressão e a localização citoplasmática de p27 provavelmente estão associadas a alterações somáticas em outros genes que controlam os processos de fosforilação da proteína p27 (eventos pós-transducionais) / INTRODUCTION: In Multiple Endocrine Neoplasia type 2 (MEN2) the development of medullary thyroid carcinoma (MTC), pheochromocytoma (PHEO) and primary hyperparathyroidism (HPT) are associated with activating germline mutations in RET proto-oncogene. Cases of sporadic MTC may have somatic RET mutations (~ 40%). The phenotypic variability observed in cases with familial MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 indicates the probable involvement of additional genetic events that could be responsible for the clinical differences observed in the affected individuals (age development, progression and aggressiveness of the tumor). Other genetic alterations such as RET double mutations, SNPs and specific haplotypes may influence susceptibility, aggressiveness and MEN2 phenotype modulation. However, studies of other genes involved in the tumorigenesis of MEN2 are still in progress. Recently, it was shown that the activated RET controls the expression of cell cycle inhibitory proteins (p18 and p27). Germline mutations in the p27 gene have recently been associated with the susceptibility to neuroendocrine tumors and are associated with the MEN4 syndrome (Multiple endocrine neoplasia type 4). Somatic inactivating mutations p27 are rarely found in many types of tumors. However, several studies have documented that reduced expression and subcellular location of p27 is controlled by post-transductional changes and/or epigenetic factors. OBJECTIVES: This study aimed to evaluate the role of genes recently associated with RET activated in tumors from MEN2 patients and also check whether polymorphisms in the p27 gene would be acting as modulators of phenotype in a large MEN2 family. PATIENTS: We analyzed 66 tumor samples from 36 patients with clinical and genetic diagnosis of MEN2 and from 28 individuals belonging to a large family with FMTC/MEN2A and RET C620R mutation. METHODS: The analyses of somatic p27, p15, p18 and RET were performed by PCR and direct sequencing of DNA and microsatellite analysis was performed for p27 by PCR and capillary electrophoresis. Expression analysis and subcellular localization of p27 protein were performed by Western blot and immunohistochemistry. The analysis of phenotype modulation in MEN2A families was performed by the amplification of exon 1 of the p27 gene in a whole blood sample. RESULTS: There were no somatic mutations in the p27 gene and also in the p15 and p18 genes. However, we verified a low p27 protein expression in MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 that showed a definite correlation with the type and aggressiveness of the mutated RET codon, mainly in those tumors from cases with germline RET codon 634 mutations (control vs 634, p=0,05; control vs 634/791, p= 0,032; 620 vs 634, p=0,045; 620 vs 634/791, p= 0,002; 620 vs 634 + 634/791, p=0,036). It was also verified a positive correlation between the immunohistochemistry expression of nuclear p27 subcellular location and the p27 p.V109G TT genotype (p=0,03). CONCLUSIONS: The reduction in the expression of p27 and its subcellular localization are likely to be associated with somatic changes in other genes that control the processes of phosphorylation of p27 protein through post-transductional events