Submitted by MELISSA REMLINGER null (melissa.remlinger@yahoo.com.br) on 2017-05-15T18:49:13Z No. of bitstreams: 1 DissertacaoMestradoMelissaRemlinger.pdf: 6915267 bytes, checksum: 6abcf69dca1b6149f3cab02b71fbd6e3 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-16T14:48:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 remlinger_m_me_araiq.pdf: 6915267 bytes, checksum: 6abcf69dca1b6149f3cab02b71fbd6e3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-16T14:48:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 remlinger_m_me_araiq.pdf: 6915267 bytes, checksum: 6abcf69dca1b6149f3cab02b71fbd6e3 (MD5) Previous issue date: 2017-04-24 / Triterpenos são produtos naturais de plantas estruturalmente complexos com numerosas aplicações medicinais. Como exemplo, friedelina é um triterpeno pentacíclico com atividade gastroprotetora, enquanto que seus derivados quinonametídicos maitenina e pristimerina apresentam promissoras atividades antiinflamatória, antitumoral, antimicrobiana, antimalárica, espermicida e antioxidante. O único triterpeno pentacíclico cetônico formado diretamente na ciclização do oxidoesqualeno é a friedelina. Sua produção se dá a partir da enzima friedelina sintase, uma oxidoesqueleno ciclase que se difere das demais oxidoesqualeno ciclases por estabilizar a ciclização promovida pelo carbocátion formado no sítio catalítico produzindo uma cetona. As oxidoesqualeno ciclases têm o mesmo substrato, porém se diferenciam pela especificidade de seus produtos formados e, por isto, a análise da estrutura primária da friedelina sintase permite estudar sua especificidade pela produção de friedelina. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo realizar o estudo da especificidade da friedelina sintase clonada de Maytenus ilicifolia por meio de mutantes desta enzima. Por meio de análises de docking da molécula de friedelina no sítio ativo da enzima foram observados resíduos de aminoácidos cuja interação poderia se relacionar à produção singular de friedelina. Os mutantes destes resíduos foram então gerados por mutagênese sítiodirigida para avaliar tais interações de acordo com o produto formado heterologamente pelos mutantes expressos em Saccharomyces cerevisiae. Os resíduos estudados e gerados por mutação sítio-dirigida foram: F183L, C369A, W417H, D484E e W612F. Os produtos assim diferencialmente produzidos foram avaliados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Assim, foi possível observar que os resíduos D484 e W417 são essenciais para a atividade da enzima, enquanto que os resíduos C369, W612 e F183 são importantes para a especificidade de produto, uma vez que a troca levou a produção de outros compostos terpênicos e/ou também a friedelina. Tais resultados permitiram avaliar resíduos importantes para a biossíntese de friedelina, contribuindo para o entendimento desta singular oxidoesqualeno ciclase. / Triterpenes are natural plant products structurally complex with numerous medicinal applications. As an example, friedelin is a pentacyclic triterpene with gastroprotective activity whereas its quinone methide derivates maytenin and pristimerin present promising anti-inflammatory, antitumor, antimicrobial, antimalarial, spermicidal and antioxidant activities. Friedelin is the only pentacyclic ketone triterpene obtained directly from ciclization of oxidosqualene. Its production occurs from the enzyme friedelin synthase, an oxidosquelene cyclase, which differs from the other oxidosqualene cyclases by stabilizing the cyclization promoted by the carbocation formed at the catalytic site forming a ketone. The oxidosqualene cyclases have the same substrate, but are differentiated by the specificity of their products formed and, therefore, the analysis of the primary structure of friedelin synthase allows to study its specificity by the production of friedelin. Thus, the present work aimed to study the specificity of the friedelin synthase cloned from Maytenus ilicifolia using mutants of the enzyme. Through the analysis of docking of the molecule friedelin in the active site of the enzyme, it was observed amino acids residues whose interation could be related to the unique production of friedelin. Mutants of these residues were generated by site-directed mutagenesis to evaluate such interactions according to the product formed heterologously by the mutants expressed in Saccharomyces cerevisiae. Residues studied and generated by site-directed mutation were: F183L, C369A, W417H, D484E and W612F. The products thus differentially produced were evaluated by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) from the expression and production of the mutants using the heterologous S. cerevisiae system. Thus, the residues D484 and W417 are essential for enzyme activity, whereas residues C369, W612 and F183 are important for product specificity, since the exchange led to the production of other terpene compounds and / or also friedelin. These results allowed the evaluation of important residues for the biosynthesis of friedelin, contributing to the understanding of this unique oxidoesqualene cyclase.

Clusia nemorosa is distributed throughout Brazil and its extract is widely used in popular medicine to treat different diseases. Although the popular use of extract of C. nemorosa, the scientific reported on their pharmacological and phytochemical analysis are scarce. In the present study, we aimed to evaluate the antinociceptive and antiinflammatory effect of hexane extract of Clusia nemorosa-derived stem bark (EHC). To evaluate the antinociceptive effect of EHC classical models of the study of pain were used, such as the abdominal writhing test induced by acetic acid, formalin test and hot plate test. In order to evaluate anti-inflammatory effect of EHC, the model of paw edema induced by carrageenan were used. Rota-rod testing and toxicological analysis in vivo and in vitro were performed. Mices submitted to abdominal writhing test, was observed a significant reduction in nociceptive response induced by acetic acid, and these effects persisted for up to 2 h after treatment. Moreover, it is important emphasizing that the EHC did not induce changes in motor function of animals when the rota-rod test was performed. In order to investigate the possible mechanism of action of EHC, the animals were pretreated with naloxone (5mg/kg), yohimbine (1 mg/kg), atropine (5 mg/kg), metoclopramide (1 mg/kg), haloperidol (2 mg/kg) and L -NAME (20 mg/kg). Only when used metoclopramide, a serotoninergic and dopaminergic antagonist receptor, it was observed an inhibition of the antinociceptivo effect of EHC, suggesting that the serotoninergic pathway may be involved in the action of the EHC, as haloperidol, a dopaminergic antagonist did not reverse the antinociception of EHC. In addition, EHC did not induce changes in the nociceptive response of animals when assessed by the hot plate test, discarding the action in the central nervous system. Then, when the animals were treated with EHC and submitted to the formalin test, it was observed that only the second phase of this test was inhibited by the EHC, indicating inhibitory actions on pain of EHC from inflammatory origin. To evaluate possible toxic effects of EHC, animals were treated for 7 consecutive days. Then after treatment, were not observed changes in behavior, blood cellularity and cytotoxicity in vitro, which ruled out possible of toxic effects in these preliminary tests. Through analysis of gas chromatography coupled with mass spectrum, the major component present in the extract was identified, friedelin, who presented antinociceptive effects on pain and inflammation of neurogenic origin, as evidenced by the formalin test. Although this model of pain induced by formalin, it was observed that the antinociceptive effects friedelin were maintained when the EHC was administered orally. In addition, friedelin inhibited the paw edema induced by carrageenan. Lastly, in vitro assays, this triterpene did not affect cell viability as measured by MTT test. Together, our results support the popular use of this plant based on their anti-inflammatory and antinociceptive effects. In addition, we report the first time the presence of pentacyclic triterpenoid, friedelin on hexane extract of Clusia nemorosa-derived stem bark, triterpenoid which is possibly responsible for the pharmacological effects evaluated. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A espécie Clusia nemorosa é bem distribuída pelo território brasileiro e seus extratos são amplamente utilizados pela medicina popular para tratar diferentes doenças. Mesmo sendo comum o consumo dos extratos de C. nemorosa (EHC), os registros científicos sobre as propriedades farmacológicas e análises fitoquímicas desta espécie ainda mostram-se escassos. Assim, no presente estudo objetivamos avaliar o efeito antinociceptivo e anti-inflamatório do extrato hexânico obtido a partir das cascas do caule de Clusia nemorosa. Para traçar o perfil antinociceptivo foram utilizados os modelos de contorção abdominal induzido por ácido acético, formalina e o teste de placa quente. Com propósito de avaliar o perfil anti-inflamatório utilizamos o teste de edema de pata induzido por carragenina. Para melhor compreender as ações do EHC, submetemos os animais tratados com o extrato ao teste de rota-rod e a análises toxicológicas in vivo e in vitro. No ensaio de contorção abdominal foi observada uma redução na resposta nociceptiva induzida por ácido acético, sendo estes efeitos persistentes por até 2 h após tratamento com EHC. Através do teste de rota rod, verificamos que o EHC não induziu alterações na motricidade dos animais. Com propósito de investigar o possível mecanismo de ação deste extrato os animais foram pré-tratados com naloxona (5 mg/kg), ioimbina (1 mg/kg), atropina (5 mg/kg), metoclopramida (1 mg/kg), haloperidol (2 mg/kg) e LNAME (20 mg/kg). Apenas quando utilizado a metoclopramida, antagonista de receptores serotoninérgicos e dopaminérgicos, ocorreu inibição do efeito antinociceptivo do EHC, sugerindo que as vias serotoninérgicas possam estar envolvidas nas ações do extrato, pois o haloperidol, um antagonista dopaminérgico não reverteu a antinocicepção do EHC. Em adição, o tratamento com EHC não induziu alterações na resposta nociceptiva dos animais quando avaliados pelo teste da placa quente, descartando possíveis ações no Sistema Nervoso Central. Em seguida, quando os animais tratados com extrato foram submetidos ao teste de formalina, foi observado que apenas a segunda fase deste teste foi inibida, indicando ações inibitórias sobre a dor de origem inflamatória, revertida pelo pré-tratamento com metoclopramida. Quando os animais foram submetidos ao tratamento por 7 dias consecutivos com o EHC não foram observadas alterações no comportamento, na celularidade do sangue e citotoxicidade in vitro, o que descartou possíveis efeitos tóxicos nestes testes preliminares. Através de análise de cromatografia gasosa acoplada a espectro de massa, foi identificado o componente majoritário presente no extrato, a friedelina (1 e 10 mg/kg; i.p.), que apresentou efeitos atinociceptivos na dor de origem neurogênica e inflamatória, evidenciado pelo teste de formalina. Ainda neste modelo, foi observado que a friedelina manteve seus efeitos antinociceptivos na dor de origem inflamatória quando administrado por via oral. Além disso, a friedelina inibiu o edema de pata induzido por carragenina. Em adição, em ensaios in vitro, este triterpeno não alterou a viabilidade celular. Em conjunto, nossos resultados sustentam o uso popular desta planta tendo por base seus efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios. Além disso, relatamos pela primeira vez a presença do triterpenóide pentacíclico, friedelina, na casca de C. nemorosa, sendo este triterpenóide possivelmente responsável pelos efeitos farmacológicos avaliados.