A mistura de hexythiazox com acaricidas de ação adulticida tem sido explorada no controle de Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) em pomares de citros. Sendo assim, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de subsidiar a recomendação de mistura de acaricidas no manejo da resistência de B. phoenicis a hexythiazox. Para esse propósito, foram realizados estudos para 1) avaliar a relação de resistência cruzada entre hexythiazox e cyhexatin em B. phoenicis;2) 2) entender a estabilidade da resistência de B. phoenicis a hexythiazox mediante a comparação da biologia das linhagens suscetível (S) e resistente (R) ao hexythiazox em condições de laboratório e a avaliação da dinâmica da resistência em condições de campo, por um período de dois anos; e 3) avaliar a estratégia da mistura de hexythiazox com os acaricidas cyhexatin ou dicofol mediante a condução de estudos de persistência da atividade biológica de acaricidas sobre as linhagens S e R, além de experimentos de campo para validar essa estratégia. A estimativa da freqüência de resistência a hexythiazox foi realizada com bioensaio de contato direto sobre ovos, utilizando-se a concentração discriminatória de 18 mg de hexythiazox/L de água. A resistência cruzada entre hexythiazox e cyhexatin foi ausente. Não foram verificadas diferenças significativas entre as linhagens S e R, com relação aos parâmetros biológicos avaliados para a confecção das tabelas de vida e fertilidade em condições de laboratório. No entanto, a resistência de B. phoenicis a hexythiazox foi instável em condições de campo; isto é, foram verificadas reduções significativas na freqüência de resistência na ausência de pressão de seleção, tanto em talhões com baixa (<20%) como em talhões com alta (>60%) freqüência de resistência. Estudos de persistência da atividade biológica de hexythiazox, utilizada na forma isolada ou em mistura com cyhexatin ou dicofol, evidenciaram que há discriminação na taxa instantânea de crescimento (ri) das linhagens S e R. Dicofol apresentou menor persistência do que hexythiazox e cyhexatin. As freqüências de resistência a hexythiazox estimadas após a utilização da mistura de hexythiazox com cyhexatin ou dicofol foram significativamente menores do que a freqüência estimada após a utilização de hexythiazox isoladamente; porém maiores do que as freqüências estimadas após a utilização de cyhexatin ou dicofol isoladamente. Apesar do controle satisfatório de B. phoenicis com a utilização da mistura em pomares com baixa freqüência de resistência a hexythiazox, essa estratégia deve ser recomendada com cautela para o manejo da resistência de B. phoenicis a hexythiazox. / The mixture of hexythiazox with acaricides with adulticidal activity has been exploited for controlling Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) in citrus groves. Therefore, this research was conducted to subsidize the recommendation of mixture of acaricides in the management of B. phoenicis resistance to hexythiazox. For this purpose, studies were undertaken 1) to evaluate cross-resistance relationship between hexythiazox and cyhexatin; 2) to understand the stability of B. phoenicis resistance to hexythiazox by comparing the life-history of susceptible (S) and resistant (R) strains of B. phoenicis to hexythiazox under laboratory conditions and by evaluating the dynamics of the resistance under field conditions, during a 2-year period; and 3) to evaluate the strategy of the mixture of hexythiazox with cyhexatin or dicofol acaricides by evaluating the persistence of biological activity of the acaricides on S and R strains and conducting field experiments to validate this strategy. The frequency of resistance to hexythiazox was estimated with direct contact bioassays on eggs with the use of discriminating concentration of 18 mg of hexythiazox/L of water. There is no cross-resistance between hexythiazox and cyhexatin. No significant differences were observed between S and R strains in relation to biological parameters evaluated to built life and fertility tables under laboratory conditions. However, the resistance of B. phoenicis to hexythiazox was unstable under field conditions; that is, significant reductions in the frequency of resistance were observed in the absence of selection pressure, either in fields with low (<20%) or high (>60%) frequency of resistance. Studies on persistence of biological activities of hexythiazox, used by itself or in mixture with cyhexatin or dicofol, showed that there is clear discrimination between S and R strains based on the instantaneous rate of increase (ri). Dicofol was less persistent than hexythiazox and cyhexatin. Frequencies of resistance to hexythiazox estimated following the use of mixture of hexythiazox with cyhexatin or dicofol were significantly lower than that with the use of hexythiazox alone; but higher than the frequencies estimated following the use of cyhexatin or dicofol alone. Despite of good control of B. phoenicis in citrus groves with low frequencies of resistance to hexythiazox, the mixture of acaricides must be recommended with cautious for managing the resistance of B. phoenicis to hexythiazox.

Este trabalho teve por objetivos: avaliar o efeito do pH inicial e o tempo de permanência no campo do atrativo alimentar Milhocina® com o conservante bórax (tetraborato de sódio) na captura de moscas-das-frutas em armadilhas do tipo McPhail; estudar densidades de armadilhas para monitoramento de moscas-das-frutas e determinar um nível de dano e de controle em cultura de laranja. Foram realizados três experimentos de campo, o primeiro em junho de 2002 em pomar de laranja de maturação precoce, cultivar Hamlin, em Itaju, região central do estado de São Paulo, para se avaliar a captura de moscas-das-frutas em armadilhas com os atrativos Milhocina® em pH 4,5, Milhocina® com bórax em pH 4,5, 6,5 e 8,5, aos 2, 4, 6 e 8 dias após a instalação no pomar. O segundo experimento foi desenvolvido de junho a agosto de 2002 (inverno seco) com laranja Hamlin em Itaju, e o terceiro experimento foi realizado de janeiro a março de 2003 (verão chuvoso) com laranja de maturação tardia, cultivar Natal, em Porto Feliz, região sul do estado, ambos para se avaliar as densidades de uma, duas, quatro e oito armadilhas por hectare e a relação entre a captura de moscas-das-frutas nas armadilhas e frutos danificados. Em Itaju, as maiores capturas de Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) ocorreram nas armadilhas com o atrativo protéico Milhocina® e bórax em pH 8,5, aos 2, 4 e 6 dias. A espécie predominante, com quase 99% das moscas-das-frutas capturadas, foi C. capitata, sendo a proporção de fêmeas capturadas de 80% em pomar com frutos e 46% em pomar sem frutos. As capturas de fêmeas, machos, e total (fêmeas e machos) de C. capitata por armadilha, nas densidades de uma, duas, quatro e oito armadilhas por hectare, foram semelhantes, indicando que C. capitata pode ser monitorada com uma armadilha por hectare em áreas de altas populações de moscas. Houve correlações entre a captura de fêmeas, e fêmeas e machos de C. capitata, e o número de frutos de laranja precoce ‘Hamlin’ danificados, sete e quatorze dias após a coleta, nas densidades de uma e duas armadilhas por hectare. Foram obtidas equações que relacionam a captura com o dano. Assim, para um dano de um fruto por árvore, o nível de controle poderia ser de 8 a 16 indivíduos de C. capitata por armadilha por dia. As perdas médias estimadas devido ao ataque de C. capitata em laranja precoce chegaram a 2,5 toneladas de frutos por hectare, ou 7,5% da produção. Em Porto Feliz, onde predominou Anastrepha fraterculus (Wiedemann, 1830), as capturas foram baixas e o dano foi observado mais freqüentemente não sendo correlacionado com as capturas de moscas-das-frutas nas armadilhas. / This research aimed to evaluate the effect of different levels of pH and the exposure time of the trap in the field, baited with Milhocina® and borax (sodium borate), on capturing fruit flies, to study different densities of McPhail trap for monitoring fruit flies and to establish the relation between fruit fly catches in traps and damaged orange fruits to determine injury and action threshold levels for fruit flies in orange groves. Three field experiments were carried out: the first one conducted in June of 2002 in a ‘Hamlin’ orange grove in Itaju, central region of state of Sao Paulo, to evaluate the trap with Milhocina® as attractant at pH 4.5 and Milhocina® and borax at pH 4.5, 6.5 and 8.5. Counts of fruit fly numbers were done at 2, 4, 6 and 8 days after placing the trap in the orange grove. The second experiment was conducted from June to August of 2002 (during dry winter) in a ‘Hamlin’ orange grove in Itaju, and the third one was conducted from January to March of 2003 (during rainy summer) in a ‘Natal’ orange grove in Porto Feliz, in southern region of state of Sao Paulo, both to evaluate the densities of one, two, four and eight traps per hectare and to study the relationship between fruit fly catches in the traps and damaged fruits. In Itaju, the highest catches of Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) were observed in traps baited with Milhocina® and borax at pH 8.5 after 2, 4 and 6 days. The most abundant fruit fly species was C. capitata, comprising almost 99% of the fruit flies captured, and the proportion of female catches was 80% in groves with fruits and 46% in groves without fruits. The fruit fly catches per trap were similar at different trap densities, indicating that C. capitata could be monitored by using one trap per hectare in areas with high fruit fly populations. Significant linear correlations were observed between females, males and females catches and damaged fruits in the following week and one week later, at densities of one and two traps per hectare. The action threshold level estimated ranged from 8 to 16 C. capitata per trap per day for one damaged fruit per tree. The mean estimated damage caused by C. capitata in ‘Hamlin’ orange was 2,500 kg of fruits per hectare which corresponds to 7.5% of the total yield. Anastrepha fraterculus (Wiedemann, 1830) was the predominant species in Porto Feliz. In this experiment, the fruit fly catches were low, the intensity of damaged fruits was higher and there was no correlation with fruit fly catches in the traps.

A rubelose é uma doença que atinge galhos e ramos, e é causada pelo fungo Erythricium salmonicolor, o qual infecta várias espécies vegetais, tais como citros, seringueira, e macieira. Esta doença vem chamando a atenção dos citricultores devido à redução de até 10% da produção de citros, a qual é preocupante para o Brasil, o maior produtor de laranja do mundo. Entretanto, a diversidade do fungo E. salmonicolor em cultivares brasileiras ainda não foi avaliada. Desta maneira, este trabalho teve como objetivos: i) avaliar a variabilidade genética, por meio de RAPD, de isolados do fungo E. salmonicolor provenientes de diferentes regiões citrícolas de São Paulo e Minas Gerais, ii) avaliar a compatibilidade vegetativa e fusão de hifas deste fungo e iii) selecionar bactérias endofíticas com potencial para o controle deste fungo fitopatogênico. Após a análise por RAPD, foram observados 6 grupos distintos (A, B, C, D, E, F), os quais não apresentaram correlação com o local de origem e espécie hospedeira. No teste de compatibilidade vegetativa houve encontro de hifas em todos os cruzamentos e 84% destes apresentaram fusão entre as hifas. Foi verificada compatibilidade entre linhagens, embora não tenha sido observada correlação com os haplótipos. No teste de antagonismo, 8 isolados bacterianos inibiram E. salmonicolor. Entretanto, foi observada diferença na interação entre as bactérias e diferentes isolados de E. salmonicolor, visto que bactérias diferentes inibiram os dois genótipos do fungo, revelando a variabilidade genética entre estas linhagens que pertencem a diferentes haplótipos. Os resultados observados neste trabalho indicam a importância de futuros estudos sobre a fase sexual de E. salmonicolor, uma vez que a anastomose de hifas precede a formação de heterocário, responsável pelos processos de recombinações sexuais e parassexuais, que geram variabilidade genética em fungos filamentosos. / The fungus Erythricium salmonicolor is the causal agent of pink disease, which infects branches of many host plants, such as citrus, rubber, and apple. This disease may be a serious problem in Brazil, since it can reduce the citrus production up to 10%. Brazil is the major world citrus producer, therefore this problem is alarming. The genetic diversity of E. salmonicolor from Brazilian plants has not been evaluated, so the aims of this study were i) to evaluate the genetic diversity by RAPD of E. salmonicolor isolates from São Paulo and Minas Gerais; ii) to evaluate the vegetative compatibility and hyphal fusion of this fungus; and iii) to select endophytic bacteria able to inhibit the E. salmonicolor growth. RAPD analysis showed at least 6 distinct haplotypes (A, B, C, D, E, F), which did not have correlation with the isolation site and host plant. Also, vegetative compatibility tests showed that 84% of crosses resulted in hyphal fusion, but this compatibility was not related to the RAPD haplotypes. Eight endophytic bacteria were selected against E. salmonicolor, which could be used for biological control of this pathogen. However it was observed different types of interaction among endophytic bacteria and E. salmonicolor strains, since these bacteria inihibited differentially two fungi isolates. It reveals the genetic variability between these fungi isolates that belongs to different haplotypes These results show the importance of future studies concerning the sexual phase of E. salmonicolor, since the genetic variability seems to be high and this hyphal fusion, which precede the formation of heterokaryon (sexual and parassexual reproduction), could be responsible for the variability in this filamentous fungus.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera &#145;Cabernet Sauvignon&#146; e V. labrusca &#145;Niagara Rosada&#146;, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera &#145;Cabernet Sauvignon&#146; and V. labrusca &#145;Niagara Rosada&#146;, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera &#145;Cabernet Sauvignon&#146; e V. labrusca &#145;Niagara Rosada&#146;, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera &#145;Cabernet Sauvignon&#146; and V. labrusca &#145;Niagara Rosada&#146;, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.

Xylella fastidiosa é uma bactéria patogênica encontrada em várias plantas. Esta bactéria secreta proteases extracelulares detectadas em gel de eletroforese, sendo a gelatina usada como substrato co-polimerizado. Três principais bandas protéicas foram detectadas com massa molar (MM) de 122, 84 e 65 kDa produzidas pelo isolado de citros (X0) e duas bandas de aproximadamente 84 e 65 kDa de isolado de videira (9713). Estas bactérias produziram zonas de hidrólise em meio sólido contendo gelatina, caseína e hemoglobina. Os resultados usando a gelatina como substrato foram os melhores para a atividade das proteases. A atividade enzimática das proteases de X. fastidiosa de citros e videira foi completamente inibida por PMSF e parcialmente inibida por EDTA, podendo ser visualizado em gel de eletroforese nativo. A temperatura ótima de atividade protéica foi de 30oC e o pH ótimo de 7,0. Além das proteases secretadas por este fitopatógeno, quitinase e &#946;-1,3-glucanase foram também detectadas no sobrenadante das culturas. Os resultados sugeriram que estas proteases produzidas pela X. fastidiosa de citros e videira pertencem ao grupo das serina e metalo proteases. / Xylella fastidiosa is a pathogenic bacterium found in several plants. These bacteria secrete extracellular proteases into the culture broth as visualized in sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide activity gels containing gelatin as a co-polymerized substrate. Three major protein bands were produced by strain X0 (citrus) with molar masses (MM) of 122, 84 and 65 kDa. Grape strain 9713 produced two bands of approximately 84 and 64 kDa. These organisms produced zones of hydrolysis in agar plates amended with gelatin, casein and hemoglobin. Gelatin was the best substrate for these proteases. SDS-PAGE activity gel indicated that the protease activities of X. fastidiosa from citrus and grape were completely inhibited by PMSF and partially inhibited by EDTA. The optimal temperature for protease activity was 30oC with an optimal pH of 7.0. Among the proteolytic enzymes secreted by the phytopathogen, chitinase and &#946;-1,3-glucanase activities were also detected in cultures of X. fastidiosa (citrus). From these results, it is suggested that these proteases produced by strains of X. fastidiosa from citrus and grape, belong to the serine- and metallo-protease group.

As relações hídricas e fisiológicas em plantas de lima ácida ‘Tahiti’ sob estresse hídrico foram estudadas tendo-se como principais objetivos: (a) verificar a sazonalidade da evapotranspiração e o coeficiente de cultivo com o uso de lisímetro de pesagem baseado em célula de carga eletrônica, (b) determinar o limite crítico da água disponível em função da evapotranspiração, trocas gasosas e potencial de água na folha durante um período de estresse hídrico e (c) avaliar o efeito da supressão da irrigação durante diferentes períodos fenológicos sobre o desenvolvimento vegetativo, na produtividade e qualidade do fruto. Este experimento foi conduzido na Fazenda Areão do Departamento de Engenharia Rural da ESALQ/USP, em Piracicaba, SP, em um pomar de 1 hectare no espaçamento de 7 X 4 m com lima ácida ‘Tahiti’ (Citrus latifolia Tanaka) enxertadas em citrumelo ‘Swingle’ [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x C. paradisi Macf.] irrigadas por gotejamento. Para as medidas fisiológicas, foram utilizados equipamentos portáteis como a câmara de pressão e analisador de gases por infravermelho além de medidas do desenvolvimento vegetativo e produtivo. O monitoramento da água solo foi realizado por tensiômetros e sondas de TDR. A Evapotranspiração de Referência foi obtida com uma estação agrometeorológica automatizada presente na área. Verificou-se um efeito sazonal na evapotranspiração, com uma redução superior a 50% no período verãoinverno, possibilitando a economia da irrigação no período. A evapotranspiração, trocas gasosas e potencial da água na folha ao amanhecer foram diminuídos pelo esgotamento de 40% da água disponível do solo por ocasião do final do período de inverno. A supressão da irrigação no período de Setembro a Março diminuiu o potencial matricial do solo e promoveu um estresse leve nas plantas não-irrigadas, não se observando efeitos negativos no desenvolvimento vegetativo, produtivo e na qualidade dos frutos formados. Recomenda-se o potencial da água no folha ao amanhecer para manejo da irrigação, mantendo-o maior que -0,6 MPa, para evitar o estresse hídrico em plantas de limeira ácida ‘Tahiti’. / Water and physiologic relations in acid lime trees under water stress were studied with the following purposes: (a) to verify the seasonal effect of evapotranspiration and the crop coefficient in non-stressed trees by weighing lysimeter; (b) to determine the critical soil water depletion for evapotranspiration, gas exchange as well as the leaf water potential during a stage of growing of the trees and (c) to determine the effect of the irrigation suppression on growth, yield and fruit quality during different phenological periods. The experiment was carried out an experimental farm at College of Agriculture Luiz de Queiroz (ESALQ), in Piracicaba and performed from 2003 to 2005 in a 1 hectare orchard planted with ‘Tahiti’ (Citrus latifolia Tanaka) grafted on ‘Swingle’ [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x C. paradisi Macf. ] rootstock. The trees were spaced 7 x 4 m apart and drip-irrigated. For physiologic measurements were used portable equipments such as a pressure chamber and an infrared gas analyzer as well measurements of vegetative and productive growth. The soil water status was monitored by tensiometers and TDR probes. The reference evapotranspiration was obtained by an automatic weather station presented on the area. There was a seasonal effect on evapotranspiration with a reduction higher than 50% forward to summer-winter, being able to water savings in the period. The evapotranspiration, gas exchange and leaf water potential at predawn were decreased when the soil water available was depleted by 40% in the end of winter. The irrigation suppression from September and March decreased the soil matric potential and promoted a light stress level in non-irrigated trees, but without negative effects on vegetative, productive and fruit quality. We recommend the leaf water potential at predawn for irrigation scheduling, keeping higher than -0.6 MPa for avoid water stress in acid lime trees.

Agricultores e técnicos envolvidos na citricultura orgânica procuram desenvolver sistemas de produção com maior atividade microbiana no solo. Dessa maneira, esperam obter benefícios dos processos que ocorrem no solo, entre eles, o controle natural de pragas e doenças. Porém, são poucos os estudos sobre a influência desse tipo de manejo sobre a microbiota do solo, em especial sobre os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) e o patógeno Phytophthora parasitica. Os objetivos dessa tese foram: avaliar a colonização micorrízica e conhecer a diversidade de FMAs nos sistemas de produção convencional e orgânico de citros; avaliar a aplicação de benomyl e da radiação &#947; na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação de comunidade de FMAs nativos e P. parasitica; verificar a capacidade indutora de resistência local e sistêmica dos FMAs nativos a P. parasitica; estudar atividade da quitinase no sistema radicular de limão 'Cravo' colonizado por fungos micorrízicos nativos. Foram realizadas amostragens em dois sistemas de produção de citros em São Paulo, um convencional e um orgânico. A riqueza e a diversidade de espécies de FMAs foram maiores no manejo orgânico. No entanto, a porcentagem de colonização micorrízica nas plantas no campo não variou com o tipo de manejo. Em casa de vegetação, experimentos com plantas de limão 'Cravo' (Citrus limonia) mostraram que a radiação &#947; foi mais adequada que a aplicação de benomyl na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação P. parasitica- FMAs nativos de agroecossistemas de produção de laranja. Também em casa de vegetação, foi realizado um experimento com raiz dividida de plantas de limão 'Cravo'. Não foi possível avaliar a capacidade indutora de resistência dos fungos micorrízicos arbusculares nativos porque não houve desenvolvimento da podridão de raízes nas plantas de limão 'Cravo' após a infestação com P. parasitica. Discute-se a interação de patógenos de raiz do solo natural e os FMAs nativos porque o solo natural dos sistemas de produção convencional e orgânico promoveram diferentes respostas de crescimento local e sistêmico das raízes das plantas micorrizadas. A atividade de quitinase foi igual nas raízes de plantas micorrizadas e não micorrrizadas cultivadas em solos dos sistemas de produção convencional e orgânico. Porém, a associação micorrízica aumentou localmente a proteína total nas raízes das plantas. / Farmers and technicians involved with organic citriculture try to develop systems with high microbial activity in soil. In this way, they expect to obtain benefits from processes that occur in soil, as natural control of pests and diseases. However, there are few studies about the influence of this type of management on soil microbiota, specially on the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and the pathogen Phytophthora parasitica. The objectives of this thesis were: to evaluate mycorrhizal colonization and diversity of AMF in citrus conventional and organic farming; to evaluate benomyl application and &#947; radiation to obtain non-mycorrhizal controls for study of interaction between indigenous AMF and P. parasitica; to verify local and systemic capacity of indigenous AMF to induce resistance against P. parasitica; to study chitinase activity in roots of 'Rangpur' lime colonized by indigenous AMF. Samplings were carried out in two citrus systems in São Paulo, one conventional and one organic farming. The richness and the diversity of AMF species were higher in the organic farming. In greenhouse, experiments with 'Rangpur' lime (Citrus limonia) showed that &#947; radiation was better than benomyl to obtain non-mycorrhizal control for studies of interaction between P. parasitica-indigenous AMF from orange agroecosystems. In greenhouse also, a split root experiment with 'Rangpur' lime was carried out. It was not possible to evaluate the indigenous AMF capacity to induce resistance because no root rot developed in 'Rangpur' lime plants after inoculation with P. parasitica. We discuss the interaction between root pathogens in natural soil and indigenous AMF because natural soil from conventional e organic farming promoted different local and systemic root growth responses in mycorrhizal plants. Chitinase activity was similar in roots of mycorrhizal and non-mycorrhizal plants grown in conventional and organic farming soils. However, mycorhizal association increased local protein content in roots.

A polpa cítrica desidratada (PC) é um subproduto altamente energético e com potencial para substituir o milho em rações de cordeiros desmamados precocemente. Três experimentos foram realizados para avaliar os efeitos da substituição do milho por PC no desempenho, na digestibilidade das rações, nas carcacterísticas da carcaça e na qualidade da carne. Os cordeiros foram alimentados com uma ração contendo 90% de concentrado (milho moído e/ou PC, farelo de soja e minerais) e 10% de feno de "coastcross" (Cynodon spp). A PC foi adicionada em 23,7; 46,1 e 68,4% da MS substituindo o milho em 33, 67 e 100%, respectivamente. Os delineamentos usados foram blocos completos casualizados de acordo com peso vivo e idade. No Experimento 1, 64 cordeiros Santa Inês, com peso vivo inicial de 18 (±0,6) kg e 73 (±1) dias de idade foram utilizados para avaliar o ganho de peso médio diário (GMD), o consumo de matéria seca (CMS) e a conversão alimentar (CA). No experimento 2, 12 cordeiros foram mantidos em gaiolas para metabolismo para determinar a digestibilidade aparente das rações no trato digestório e o metabolismo de nitrogênio. No Experimento 3, 32 cordeiros do Experimento 1 com peso de abate de 33 (±0,42) kg foram utilizados para avaliar as características da carcaça (rendimento de carcaça quente e fria, quebra por resfriamento, espessura de gordura, área de olho de lombo, os rendimentos de cortes e a proporção de músculo, gordura e osso) e a qualidade da carne (capacidade de retenção de água, cor, perda de peso por cozimento, e pH). No Experimento 1, houve efeito quadrático para o GMD, CMS e CA (P<0,03). No Experimento 2, houve efeito linear (P<0,05) decrescente na digestibilidade da MS (P<0,03) e PB (P<0,10). Por outro lado, a digestibilidade da FDN aumentou linearmente com a adição da PC. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos na digestibilidade aparente da matéria orgânica e no balanço de nitrogênio. No Experimento 3, não foi observada diferença (P>0,05) entre os tratamentos, exceto para a proporção de músculo e gordura que apresentaram efeito quadrático com a inclusão de PC na ração. A inclusão de PC até 23,7% da MS na ração não altera o desempenho e a qualidade da carne de cordeiros desmamados precocemente e confinados. / Dried citrus pulp (DCP) is a high energy by-product and may be used to replace corn in early weaned lamb diets. Three trials were performed to evaluate the effects of replacing corn by dried citrus pulp on lamb performance, diet digestibility, carcass characteristics and meat quality. In all trials, lambs were fed a 90% concentrate (ground corn and/or DCP, soybean meal and minerals) and 10% coastcross hay (Cynodon spp) diet. DCP was added at 23.7, 46.1 and 68% (diet DM) replacing corn by 33, 67 and 100%, respectively. The experimental designs used were complete randomized block according to body weight and age at beginning of the trial. In Trial 1, 64 Santa Ines ram lambs (initial BW 18 ± 0.6 kg and 73 ± 1 d old) were used to evaluate average daily gain (ADG), dry matter intake (DMI) and feed conversion (FC). In Trial 2, 12 ram lambs were placed in metabolism crates to evaluate N metabolism and apparent digestibility of diets. In Trial 3, 32 ram lambs of Trial 1 (slaughter BW 33 ± 0.42 kg) were used to evaluate carcass characteristics (hot and chilled carcass yield, chilling losses, fat thickness, longissimus muscle area, lamb cuts and proportion of lean, fat and bone) and meat quality (cooking loss, colour, pH and water hold capacity). In Trial 1, ADG, DMI and FC showed a quadratic effect (P<0.03). In Trial 2, apparent digestibility of DM (P<0.03) and CP (P<0.10) showed a linear decrease. However, NDF digestibility increased linearly (P<0.04) with the addition of DCP. OM digestibility and N metabolism were similar among treatments. There were no treatment effects (P>0.05) in Experiment 3, except for proportion of lean and fat that showed a quadratic response. DCP can be included in high concentrate diets for feedlot lambs up to 23.7% of the diet dry matter, without affecting performance and meat quality.

O possível envolvimento de afídeos na transmissão de vírus associados à morte súbita dos citros (MSC) indica a necessidade de monitoramento desses insetos para melhor compreender sua dinâmica populacional e a epidemiologia da doença. Esta pesquisa teve como principal objetivo a determinação das principais espécies de afídeos que colonizam pomares de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] de um município afetado pela MSC, no Norte do Estado de São Paulo, bem como o estudo da dinâmica populacional destes insetos. Preliminarmente, padronizou-se uma metodologia de amostragem de afídeos, baseando-se em uma análise da distribuição espacial destes insetos na copa de árvores cítricas, em dois pomares de laranja doce, localizados em Comendador Gomes-MG e Santa Cruz do Rio Pardo-SP. Em cada pomar, delimitou-se um talhão com 960 plantas numeradas, no qual 100 plantas foram selecionadas ao acaso, para as avaliações. Cada árvore foi dividida em três estratos: i) inferior (0 - 1,0 m); ii) médio (1,0 - 1,8 m); e iii) superior (>1,8 m). Os estratos foram divididos em quadrantes (Leste, Oeste, Norte e Sul), amostrando-se uma brotação por quadrante, totalizando 12 brotações por planta. Através de análise de variância, observou-se efeito de planta e de estrato na densidade populacional dos afídeos, havendo menor número de afídeos no terço inferior em relação aos terços médio e superior da planta. Não houve efeito significativo de quadrantes nem da interação estrato x quadrante na estimativa populacional de afídeos. Definiu-se que a avaliação de uma brotação de cada quadrante do terço médio da copa, em 150 plantas, seria o procedimento mais adequado para o monitoramento de afídeos, visando-se ao estudo de dinâmica populacional. Utilizando-se este método de amostragem, iniciaram-se avaliações quinzenais de afídeos em dois talhões de laranja doce (‘Valência’ enxertada sobre limão ‘Cravo’) com idades diferentes (4 e 10 anos), no município de Nova Granada-SP, no período de abril/2003 a abril/2005. Simultaneamente, foram realizadas avaliações de brotações nas árvores cítricas, obtendo-se valores médios do número de brotações por m2 e do comprimento das brotações para cada talhão. Através de análises de regressão linear múltipla, os dados populacionais dos afídeos foram correlacionados com variáveis climáticas (temperaturas média, mínima e máxima; umidade relativa do ar e precipitação pluviométrica) registradas 30 dias antes da amostragem dos afídeos, e com variáveis fenológicas (comprimento das brotações e número de brotações/m²) registradas no dia da amostragem. Foram coletados afídeos das espécies Aphis gossypii Glover, A. spiraecola Patch e Toxoptera citricida Kirkaldy, com predominância de colônias de A. gossypii e A. spiraecola no pomar com 4 anos, e de colônias de T. citricida no pomar com 10 anos. A ocorrência desses afídeos em árvores cítricas coincide com períodos de brotações nos pomares, tanto em épocas de estiagem como em épocas de maior precipitação pluviométrica. O número de brotações cítricas/m², o comprimento das brotações e a temperatura são os fatores mais freqüentemente associados ao desenvolvimento das colônias de afídeos em árvores cítricas. A. gossypii, A. spiraecola e T. citricida mostram maiores picos de incidência de formas aladas em ramos cítricos nos meses de inverno (julho a setembro). As espécies T. citricida, A. gossypii e A. spiraecola diferem na capacidade de distorcer folhas e brotações cítricas, sendo que a última é a principal responsável por este tipo de dano direto. / Because aphids are possibly involved in the spread of viruses associated with a new and destructive disease, citrus sudden death (CSD), it is important to know their population dynamics in order to understand disease epidemiology. The goal of this research was to determine the main aphid species that colonize citrus groves [Citrus sinensis (L.) Osbeck] in CSD-affected areas of northern State of São Paulo, as well as to study their population dynamics. In order to establish procedures for sampling aphids that colonize citrus, a preliminary study of spatial distribution of these insects on the canopy of citrus trees was carried out in two sweet orange groves in Comendador Gomes-MG and Santa Cruz do Rio Pardo-SP. In each grove, 100 trees were randomly sampled in an experimental plot with 960 numbered plants. Each tree canopy was divided in three strata: i) lower (0 - 1,0 m); ii) medium (1,0 - 1,8 m); and iii) upper (>1,8 m). The canopy strata were subdivided in quadrants (E, W, N, S). Twelve young branches were sampled from each tree (1 per quadrant; 4 per stratum). By using analysis of variance, significant effects of plant and canopy stratum on aphid population were observed, with lower numbers of nymphs and adults found on the lower stratum than on the medium and upper strata. Aphid population was not influenced by quadrant or stratum x quadrant interaction. It was determined that sampling of 4 young branches (1 per quadrant) of the medium stratum from 150 citrus trees would be an adequate procedure for monitoring aphids on citrus trees, in order to obtain accurate population estimates for the population dynamics study. By using this sampling method, aphid surveys were carried out fortnightly in two sweet orange groves (‘Valência’ grafted on rangpur lime), 4 and 10 years old, in Nova Granada County, from April/2003 to April/2005. Simultaneous observations of mean number of young shoots/m2 of citrus canopy and mean shoot length were also conducted. By using multiple linear regression analysis, aphid numbers were correlated with local climatic variables (minimum, medium and maximum temperatures; relative humidity and rainfall) recorded 30 days before aphid sampling, as well as with phenological variables (mean number of young shoots/m2 and mean shoot length) recorded on the sampling date. Aphis gossypii Glover, A. spiraecola Patch, Toxoptera citricida Kirkaldy were the main aphid species sampled. A. gossypii and A. spiraecola were the prevalent species in the 4-year old grove, whereas T. citricida prevailed in the 10-year old grove. Aphid colonies were detected on citrus trees during periods of young shoot production, in different seasons, with either low (winter) or high (summer) rainfall. Mean number of young shoots/m2, mean shoot length and temperature were the main factors associated with aphid colony development on citrus trees. Peaks of A. gossypii, A. spiraecola and T. citricida alatae on citrus branches occurred during the winter months (July through September). A. spiraecola, A. gossypii and T. citricida differed in the ability to cause severe leaf deformation in the young shoots; this type of direct damage was mostly associated with colonies of the first species.