Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado que ao infectar seres humanos causa a doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas no mundo todo. As fumarato hidratases (FH), ou fumarases, são enzimas que catalisam a reação estéreo-específica reversível de hidratação do fumarato em S-malato, e foram recentemente consideradas essenciais para a viabilidade do parasito Trypanosoma brucei, sugerindo seu potencial como alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos tripanocidas. O presente trabalho visou à caracterização funcional, bioquímica, biofísica e estrutural das fumarases de T. cruzi (TcFHs) e humana (HsFH) de forma a avaliar o papel das TcFHs para o parasito Trypanosoma cruzi, mapear o mecanismo de ação e identificar as diferenças entre TcFHs e a enzima humana de forma a serem exploradas no planejamento de inibidores seletivos às fumarases do parasito. Análise das sequências mostrou que TcFHs pertencem à classe I das fumarases (enzimas diméricas dependentes de ferro) e não são homólogas à HsFH que pertence a classe II (tetraméricas independentes de ferro). Estudos de localização celular confirmaram a existência de duas fumarases em T. cruzi, uma citosólica (TcFHc) e uma mitocondrial (TcFHm), e experimentos de nocaute gênico sugeriram que essas enzimas são essências para o parasito. A caracterização cinética das enzimas TcFHc, TcFHm e HsFH mostrou que as fumarases de T. cruzi são sensíveis ao oxigênio enquanto a enzima humana se mantém ativa em condições aeróbicas. Estudos de ressonância eletrônica paramagnética mostraram a presença de um cluster de ferro-enxofre, sensível a oxidação por oxigênio, envolvido no mecanismo enzimático das enzimas TcFHs. Modelos estruturais das TcFHs, construídos por homologia à estrutura cristalográfica da fumarase de Leishmania major, foram comparados à estrutura cristalográfica obtida para a fumarase humana e as diferenças entre as duas estruturas foram utilizadas no planejamento de ligantes seletivos às fumarases do parasito. O ligante planejado inibiu a fumarase citosólica de T. cruzi na faixa de 1 ?M e não apresentou efeito na atividade da enzima humana. Testes in vivo demonstraram o efeito tripanocida do inibidor provavelmente por interferir na produção de ATP pela mitocôndria do T. cruzi. Os resultados obtidos com o desenvolvimento desse projeto apresentam uma proposta inovadora no desenvolvimento de novas terapias contra a doença de Chagas, o uso da enzima fumarase como alvo macromolecular, assim como apresenta um inibidor potente e seletivo para a enzima do parasito a ser utilizado como protótipo no desenvolvimento de fármacos contra Trypanosoma cruzi. A síntese de moléculas análogas ao inibidor de forma a melhorar suas propriedades farmacológicas encontra-se em andamento / Trypanosoma cruzi is a flagellate protozoan parasite that infects humans and causes Chagas disease, a tropical neglected disease that affects millions of people worldwide. Fumarate hydratases (FH), or fumarases, are enzymes responsible for the reversible stereo-specific hydration of fumarate into S-malate, and were recently considered to be essential to Trypanosoma brucei viability, suggesting, therefore, a potential role for FHs as macromolecular targets to the drug development against trypanosomatids. The present work focused on the functional, biochemical, biophysical and structural characterization of T. cruzi fumarases (TcFHs) and human fumarase (HsFH) to evaluate TcFHs role for T. cruzi, map the reaction mechanism and identify and exploit differences between the parasite and host enzymes in order to design selective inhibitors to the parasite enzyme. Sequence analysis revealed that TcFHs belong to class I fumarases (dimeric and iron-sulfur containing enzymes) and are not homologous to HsFH which belongs to class II fumarases (tetrameric iron independent enzymes). Cellular sub-localization studies confirmed the presence of a cytosolic and a mitochondrial fumarases in T. cruzi and gene knockout experiments suggested TcFHs are essential to the parasite. The kinetic characterization showed that TcFHs activity is highly sensitive to oxygen whereas HsFH activity remained stable in aerobic conditions. Electron paramagnetic experiments further revealed the presence of an iron-sulfur cluster highly sensitive to oxidation and involved in the catalytic mechanism in both TcFHm and TcFHc. TcFHs structural models, built by homology modeling using the Leishmania major fumarase crystal structure as template, were compared to the HsFH crystal structure and the differences were used to design a selective ligand to the parasite fumarases. The designed ligand showed to inhibit TcFHc with an IC50 of 1 ?M and showed no effect on the human fumarase activity. In vivo assays using T. cruzi epimastigotes demonstrated the trypanocidal effect of the designed inhibitor probably caused by stalling ATP production. The results obtained with the development of this project represent an innovative proposal on the development of new therapies against Chagas disease, the use of fumarase enzyme as a macromolecular target, as well as present a potent and selective inhibitor to the parasite enzyme to be further used as a prototype in the development of drugs against Chagas disease. The synthesis of inhibitor analogues with optimized pharmacological properties are currently in progress.

Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pelas Leishmanioses, classificadas como doenças negligenciadas, que causam um risco a 350 milhões de pessoas em todo o mundo. As fumarato hidratases (FHs) são enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato e estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, apontam essas enzimas como potenciais alvos para o planejamento de compostos com ação tripanossomicida e leishmanicida. O presente trabalho visou à caracterização funcional e estrutural das enzimas fumarato hidratase de Leishmania major através da determinação da estrutura por técnicas de difração de raios-X em monocristais, aliadas a técnicas espectroscópicas, de mutagênese sítio dirigida e simulação de dinâmica molecular. A susceptibilidade dessa classe de enzimas ao oxigênio devido a presença de um complexo do tipo [4Fe-4S] exigiu a utilização de técnicas modernas para a realização dos experimentos em condição de anaerobiose. A estrutura da isoforma citosólica da FH em L. major (LmFH-2) foi determinada por técnicas de difração de raios-X em monocristais e consiste na primeira estrutura de uma proteína da classe I das FHs a ser determinada. O enovelamento de LmFH-2 foi descrito como novo e consiste em uma proteína dimérica na qual cada monômero apresenta dois domínios denominados domínios N- e C- terminais, que possuem grande mobilidade entre si. A análise das estruturas cristalográficas de LmFH-2 em complexo com o substrato malato e os inibidores malonato e succinato, associada aos estudos de dinâmica molecular, nos permitiu propor que a mobilidade entre os domínios está associada à entrada do substrato no sítio ativo. Os dados estruturais corroborados pelos dados espectroscópicos e bioquímicos foram utilizados para mapear o sítio ativo e construirmos um modelo para descrever o mecanismo de ação enzimática adotado por essa classe de enzimas. Na tentativa de dar ínicio à validação do nosso modelo, o resíduo conservado Thr467, pertencente ao sítio ativo da LmFH-2 e identificado como importante na interação com o substrato, teve seu papel catalítico avaliado através da combinação de técnicas de mutação sítio-dirigida associada a estudos cinéticos e estruturais. A perda significativa na atividade da proteína mutante LmFH-2-T467A fortaleceu nossas hipóteses de que a Thr467 poderia atuar como ácido ou base no mecanismo RESUMO | II de ação das FHs da classe I. Os resultados obtidos nesse trabalho nos fornecerão as bases estruturais para o mapeamento acerca do mecanismo catalítico adotado pelas enzimas fumarato hidratase da classe I, assim como, para o planejamento de ligantes específicos como uma importante ferramenta na avaliação do potencial desta classe de enzimas como alvo para o desenvolvimento de novas terapias contra a Leishmaniose. / Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, classified as neglected tropical diseases, with 350 million people at risk of infection. Fumarate hydratases (FH) are enzymes that catalyze the stereospecific reversible hydratation of fumarate to S-malate and recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes are essential for the parasite survival and should be exploited as potential targets for the development of new therapies against trypanosomatid related diseases. The present work focused the functional and structural characterization of both fumarate hydratase enzymes from Leishmania major by a combination of crystallographic, spectroscopic, site-direct mutagenesis and molecular dynamics techniques. The susceptibility to oxygen observed for this class of proteins due to the presence of a [4Fe-4S] cluster required the use of state-of-art infrastructure to perform the experiments under anaerobic environment. The structure of LmFH-2 has been determined by X-ray diffraction techniques and consists of the first class I FH structure to be reported. LmFH-2 folding has been found to be unique and consists of a dimer with each monomer composed of two major domains named N- and C-terminal domains. The analysis of the crystallographic structure of LmFH-2 in complex with the substrate malate and with both inhibitors malonate and succinate has allowed us to propose that the movement observed between both N- and C-domains is associated to the entrance of the substrate into the active site. The structural data corroborated with biochemical and spectroscopic studies have been used to map the active site and to build a model to describe the mechanism of action adopted by this class of enzymes. As our first attempt to validate our model, the residue Thr467 that belongs to the active site and has been identified as important in the interaction with the substrate, had its catalytic role evaluated by site-direct mutagenesis in combination with kinetic and structural studies. The significant loss in activity observed for the mutant LmFH-2-T467A supports our hypothesis that Thr467 can act as either acid or base during catalysis. Our results have provided the structural basis for the complete mapping of the catalytic mechanism adopted by fumarate hydratase enzymes, as well as for the design of specific ligands as an important tool for evaluating FHs as drug targets in development of new therapies against Leishmaniasis.

Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pelas Leishmanioses, classificadas como doenças negligenciadas, que causam um risco a 350 milhões de pessoas em todo o mundo. As fumarato hidratases (FHs) são enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato e estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, apontam essas enzimas como potenciais alvos para o planejamento de compostos com ação tripanossomicida e leishmanicida. O presente trabalho visou à caracterização funcional e estrutural das enzimas fumarato hidratase de Leishmania major através da determinação da estrutura por técnicas de difração de raios-X em monocristais, aliadas a técnicas espectroscópicas, de mutagênese sítio dirigida e simulação de dinâmica molecular. A susceptibilidade dessa classe de enzimas ao oxigênio devido a presença de um complexo do tipo [4Fe-4S] exigiu a utilização de técnicas modernas para a realização dos experimentos em condição de anaerobiose. A estrutura da isoforma citosólica da FH em L. major (LmFH-2) foi determinada por técnicas de difração de raios-X em monocristais e consiste na primeira estrutura de uma proteína da classe I das FHs a ser determinada. O enovelamento de LmFH-2 foi descrito como novo e consiste em uma proteína dimérica na qual cada monômero apresenta dois domínios denominados domínios N- e C- terminais, que possuem grande mobilidade entre si. A análise das estruturas cristalográficas de LmFH-2 em complexo com o substrato malato e os inibidores malonato e succinato, associada aos estudos de dinâmica molecular, nos permitiu propor que a mobilidade entre os domínios está associada à entrada do substrato no sítio ativo. Os dados estruturais corroborados pelos dados espectroscópicos e bioquímicos foram utilizados para mapear o sítio ativo e construirmos um modelo para descrever o mecanismo de ação enzimática adotado por essa classe de enzimas. Na tentativa de dar ínicio à validação do nosso modelo, o resíduo conservado Thr467, pertencente ao sítio ativo da LmFH-2 e identificado como importante na interação com o substrato, teve seu papel catalítico avaliado através da combinação de técnicas de mutação sítio-dirigida associada a estudos cinéticos e estruturais. A perda significativa na atividade da proteína mutante LmFH-2-T467A fortaleceu nossas hipóteses de que a Thr467 poderia atuar como ácido ou base no mecanismo RESUMO | II de ação das FHs da classe I. Os resultados obtidos nesse trabalho nos fornecerão as bases estruturais para o mapeamento acerca do mecanismo catalítico adotado pelas enzimas fumarato hidratase da classe I, assim como, para o planejamento de ligantes específicos como uma importante ferramenta na avaliação do potencial desta classe de enzimas como alvo para o desenvolvimento de novas terapias contra a Leishmaniose. / Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, classified as neglected tropical diseases, with 350 million people at risk of infection. Fumarate hydratases (FH) are enzymes that catalyze the stereospecific reversible hydratation of fumarate to S-malate and recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes are essential for the parasite survival and should be exploited as potential targets for the development of new therapies against trypanosomatid related diseases. The present work focused the functional and structural characterization of both fumarate hydratase enzymes from Leishmania major by a combination of crystallographic, spectroscopic, site-direct mutagenesis and molecular dynamics techniques. The susceptibility to oxygen observed for this class of proteins due to the presence of a [4Fe-4S] cluster required the use of state-of-art infrastructure to perform the experiments under anaerobic environment. The structure of LmFH-2 has been determined by X-ray diffraction techniques and consists of the first class I FH structure to be reported. LmFH-2 folding has been found to be unique and consists of a dimer with each monomer composed of two major domains named N- and C-terminal domains. The analysis of the crystallographic structure of LmFH-2 in complex with the substrate malate and with both inhibitors malonate and succinate has allowed us to propose that the movement observed between both N- and C-domains is associated to the entrance of the substrate into the active site. The structural data corroborated with biochemical and spectroscopic studies have been used to map the active site and to build a model to describe the mechanism of action adopted by this class of enzymes. As our first attempt to validate our model, the residue Thr467 that belongs to the active site and has been identified as important in the interaction with the substrate, had its catalytic role evaluated by site-direct mutagenesis in combination with kinetic and structural studies. The significant loss in activity observed for the mutant LmFH-2-T467A supports our hypothesis that Thr467 can act as either acid or base during catalysis. Our results have provided the structural basis for the complete mapping of the catalytic mechanism adopted by fumarate hydratase enzymes, as well as for the design of specific ligands as an important tool for evaluating FHs as drug targets in development of new therapies against Leishmaniasis.

Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado que ao infectar seres humanos causa a doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas no mundo todo. As fumarato hidratases (FH), ou fumarases, são enzimas que catalisam a reação estéreo-específica reversível de hidratação do fumarato em S-malato, e foram recentemente consideradas essenciais para a viabilidade do parasito Trypanosoma brucei, sugerindo seu potencial como alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos tripanocidas. O presente trabalho visou à caracterização funcional, bioquímica, biofísica e estrutural das fumarases de T. cruzi (TcFHs) e humana (HsFH) de forma a avaliar o papel das TcFHs para o parasito Trypanosoma cruzi, mapear o mecanismo de ação e identificar as diferenças entre TcFHs e a enzima humana de forma a serem exploradas no planejamento de inibidores seletivos às fumarases do parasito. Análise das sequências mostrou que TcFHs pertencem à classe I das fumarases (enzimas diméricas dependentes de ferro) e não são homólogas à HsFH que pertence a classe II (tetraméricas independentes de ferro). Estudos de localização celular confirmaram a existência de duas fumarases em T. cruzi, uma citosólica (TcFHc) e uma mitocondrial (TcFHm), e experimentos de nocaute gênico sugeriram que essas enzimas são essências para o parasito. A caracterização cinética das enzimas TcFHc, TcFHm e HsFH mostrou que as fumarases de T. cruzi são sensíveis ao oxigênio enquanto a enzima humana se mantém ativa em condições aeróbicas. Estudos de ressonância eletrônica paramagnética mostraram a presença de um cluster de ferro-enxofre, sensível a oxidação por oxigênio, envolvido no mecanismo enzimático das enzimas TcFHs. Modelos estruturais das TcFHs, construídos por homologia à estrutura cristalográfica da fumarase de Leishmania major, foram comparados à estrutura cristalográfica obtida para a fumarase humana e as diferenças entre as duas estruturas foram utilizadas no planejamento de ligantes seletivos às fumarases do parasito. O ligante planejado inibiu a fumarase citosólica de T. cruzi na faixa de 1 ?M e não apresentou efeito na atividade da enzima humana. Testes in vivo demonstraram o efeito tripanocida do inibidor provavelmente por interferir na produção de ATP pela mitocôndria do T. cruzi. Os resultados obtidos com o desenvolvimento desse projeto apresentam uma proposta inovadora no desenvolvimento de novas terapias contra a doença de Chagas, o uso da enzima fumarase como alvo macromolecular, assim como apresenta um inibidor potente e seletivo para a enzima do parasito a ser utilizado como protótipo no desenvolvimento de fármacos contra Trypanosoma cruzi. A síntese de moléculas análogas ao inibidor de forma a melhorar suas propriedades farmacológicas encontra-se em andamento / Trypanosoma cruzi is a flagellate protozoan parasite that infects humans and causes Chagas disease, a tropical neglected disease that affects millions of people worldwide. Fumarate hydratases (FH), or fumarases, are enzymes responsible for the reversible stereo-specific hydration of fumarate into S-malate, and were recently considered to be essential to Trypanosoma brucei viability, suggesting, therefore, a potential role for FHs as macromolecular targets to the drug development against trypanosomatids. The present work focused on the functional, biochemical, biophysical and structural characterization of T. cruzi fumarases (TcFHs) and human fumarase (HsFH) to evaluate TcFHs role for T. cruzi, map the reaction mechanism and identify and exploit differences between the parasite and host enzymes in order to design selective inhibitors to the parasite enzyme. Sequence analysis revealed that TcFHs belong to class I fumarases (dimeric and iron-sulfur containing enzymes) and are not homologous to HsFH which belongs to class II fumarases (tetrameric iron independent enzymes). Cellular sub-localization studies confirmed the presence of a cytosolic and a mitochondrial fumarases in T. cruzi and gene knockout experiments suggested TcFHs are essential to the parasite. The kinetic characterization showed that TcFHs activity is highly sensitive to oxygen whereas HsFH activity remained stable in aerobic conditions. Electron paramagnetic experiments further revealed the presence of an iron-sulfur cluster highly sensitive to oxidation and involved in the catalytic mechanism in both TcFHm and TcFHc. TcFHs structural models, built by homology modeling using the Leishmania major fumarase crystal structure as template, were compared to the HsFH crystal structure and the differences were used to design a selective ligand to the parasite fumarases. The designed ligand showed to inhibit TcFHc with an IC50 of 1 ?M and showed no effect on the human fumarase activity. In vivo assays using T. cruzi epimastigotes demonstrated the trypanocidal effect of the designed inhibitor probably caused by stalling ATP production. The results obtained with the development of this project represent an innovative proposal on the development of new therapies against Chagas disease, the use of fumarase enzyme as a macromolecular target, as well as present a potent and selective inhibitor to the parasite enzyme to be further used as a prototype in the development of drugs against Chagas disease. The synthesis of inhibitor analogues with optimized pharmacological properties are currently in progress.

Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pela Leishmaniose, doença que afeta 88 países, distribuídos em 4 continentes, e que causa um risco a aproximadamente 350 milhões de pessoas. Estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, sugerem que as enzimas fumarato hidratase, enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato, são essenciais para sobrevivência de tripanossomatídeos. O presente projeto visou a clonagem, expressão, purificação e caracterização cinética e biofísica da enzima fumarato hidratase codificada pelo gene LmjF24.0320 de Leishmania major. A proteína foi expressa em bactéria e purificada por cromatografia de afinidade. Os ensaios de cinética enzimática mostram que a enzima segue o modelo de cinética de Michaelis-Menten com Km e Vmax de 2,7 ± 0,5 mM e 35,2 ± 5,8 micromol/min/mg para fumarato e 5,2 ± 0,4 mM e 11,8 ± 0,6 micromol/min/mg para S-malato, respectivamente. Para os estudos de localização celular foram produzidos e purificados anticorpos policlonais para as isoformas LmFH-1 e LmFH-2 de Leishmania major através de imunização de coelhos. A combinação de técnicas de imunofluorescência por microscopia confocal, western blotting e controle da atividade enzimática através fracionamento celular com digitonina nos permitiu concluir que a isoforma LmFH-1 se encontra localizada na mitocôndria do parasito, enquanto que a isoforma LmFH-2 possue dupla localização, sendo encontrada tanto no citosol quanto no glicossomo. A presença das isoformas LmFH-1 e LmFH-2 nos três compartimentos celulares: citosol, glicossomo e mitocôndria reforçam a importância da molécula de fumarato em diferentes processos celulares, e fortalecem a idéia de que a enzima fumarato hidratase pode ser considerada um potencial alvo para planejamento de fármacos anti-leishmaniose. / Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, a group of disease that affects 88 countries, distributed in four continents, with 350 million people at risk of infection. Recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes, which catalyze the stereospecific hydration of fumatare to malate, are essential for trypanosomatid survival. The present project focused the cloning, expression, purification and both kinetic and biophysical characterization of fumarate hydratase encoded by gene LmjF24.0320 of Leishmania major. The protein has been expressed in bacteria and purified by affinity chromatography. The kinetic experiments reveal that the enzyme follow the Michaelis-Menten classic model with Km and Vmax of 2,7 ± 0,5 mM and 35,2 ± 5,8 micromol/min/mg for fumarate and 5,2 ± 0,4 mM and 11,8 ± 0,6 micromol/min/mg for S-malate, respectively. For the subcellular localization studies, polyclonal antisera against both isoforms LmFH-1 e LmFH-2 of Leishmania major were obtained after immunization of rabbits. The combination of confocal microscopy, western blotting and enzymatic activity through cell fractionation by selective permeabilization of membranes with digitonin suggest that LmFH-1 isoform is localized to mitochondria, while the LmFH-2 isoform is found to both cytosol and glycossome. The presence of LmFH-1 and LmFH-2 isoforms at the three cell compartments: cytosol, glycosome and mitochondria strongly supports the premise that fumarate is important for many cell processes and suggests that fumarate hydratase enzyme can be considered an attractive target for the development of anti-leishmaniasis drugs.

Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pela Leishmaniose, doença que afeta 88 países, distribuídos em 4 continentes, e que causa um risco a aproximadamente 350 milhões de pessoas. Estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, sugerem que as enzimas fumarato hidratase, enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato, são essenciais para sobrevivência de tripanossomatídeos. O presente projeto visou a clonagem, expressão, purificação e caracterização cinética e biofísica da enzima fumarato hidratase codificada pelo gene LmjF24.0320 de Leishmania major. A proteína foi expressa em bactéria e purificada por cromatografia de afinidade. Os ensaios de cinética enzimática mostram que a enzima segue o modelo de cinética de Michaelis-Menten com Km e Vmax de 2,7 ± 0,5 mM e 35,2 ± 5,8 micromol/min/mg para fumarato e 5,2 ± 0,4 mM e 11,8 ± 0,6 micromol/min/mg para S-malato, respectivamente. Para os estudos de localização celular foram produzidos e purificados anticorpos policlonais para as isoformas LmFH-1 e LmFH-2 de Leishmania major através de imunização de coelhos. A combinação de técnicas de imunofluorescência por microscopia confocal, western blotting e controle da atividade enzimática através fracionamento celular com digitonina nos permitiu concluir que a isoforma LmFH-1 se encontra localizada na mitocôndria do parasito, enquanto que a isoforma LmFH-2 possue dupla localização, sendo encontrada tanto no citosol quanto no glicossomo. A presença das isoformas LmFH-1 e LmFH-2 nos três compartimentos celulares: citosol, glicossomo e mitocôndria reforçam a importância da molécula de fumarato em diferentes processos celulares, e fortalecem a idéia de que a enzima fumarato hidratase pode ser considerada um potencial alvo para planejamento de fármacos anti-leishmaniose. / Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, a group of disease that affects 88 countries, distributed in four continents, with 350 million people at risk of infection. Recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes, which catalyze the stereospecific hydration of fumatare to malate, are essential for trypanosomatid survival. The present project focused the cloning, expression, purification and both kinetic and biophysical characterization of fumarate hydratase encoded by gene LmjF24.0320 of Leishmania major. The protein has been expressed in bacteria and purified by affinity chromatography. The kinetic experiments reveal that the enzyme follow the Michaelis-Menten classic model with Km and Vmax of 2,7 ± 0,5 mM and 35,2 ± 5,8 micromol/min/mg for fumarate and 5,2 ± 0,4 mM and 11,8 ± 0,6 micromol/min/mg for S-malate, respectively. For the subcellular localization studies, polyclonal antisera against both isoforms LmFH-1 e LmFH-2 of Leishmania major were obtained after immunization of rabbits. The combination of confocal microscopy, western blotting and enzymatic activity through cell fractionation by selective permeabilization of membranes with digitonin suggest that LmFH-1 isoform is localized to mitochondria, while the LmFH-2 isoform is found to both cytosol and glycossome. The presence of LmFH-1 and LmFH-2 isoforms at the three cell compartments: cytosol, glycosome and mitochondria strongly supports the premise that fumarate is important for many cell processes and suggests that fumarate hydratase enzyme can be considered an attractive target for the development of anti-leishmaniasis drugs.

Le cancer du rein papillaire de type 2 (PRCC2) est un cancer très agressif avec un potentiel métastatique élevé et pour lequel il n’y a pas de traitement efficace. La forme héréditaire de PRCC2 est associée au syndrome rare de la léiomyomatose cutanéo-utérine héréditaire (HLRCC). HLRCC est due à une mutation germinale hétérozygote du gène Fumarate Hydratase (FH) qui code l'enzyme du cycle de Krebs, la Fumarase. Le déficit en fumarase induit l’accumulation de fumarate et active les voies de signalisation du facteur de transcription inductible par l’hypoxie (HIF) et des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Néanmoins, aucune mutation du gène FH n’a été rapportée dans les cas de PRCC2 sporadiques. Le projet de recherche porte sur la caractérisation moléculaire des PRCC2 héréditaires et sporadiques. Notre analyse du transcriptome a identifié des différences entre les signatures moléculaires des PRCC2 héréditaires et sporadiques. Cependant, l’étude d’immunohistochimie n'a pas révélé de biomarqueurs potentiels. Les analyses bio-informatiques de profils d’expression génique ont révélé que les tumeurs PRCC2 héréditaires et sporadiques partagent une dérégulation de la voie principale NRF2/KEAP1. Il a été montré que la surexpression de AKR1B10 (Aldo-Keto Reductase Family 1 Membre B10) est la conséquence directe de l’activation de l'élément de réponse antioxydant (ARE). Finalement, nous avons établi un nouveau modèle in vitro de lignée cellulaire, NCCFH1 (FH-/-), issue d’un patient HLRCC. NCCFH1 représente une plateforme idéale pour les études fonctionnelles, métaboliques et thérapeutiques. Bortézomib pourrait être la meilleure alternative thérapeutique pour les patients avec PRCC2. / Papillary Renal Cell Carcinoma type 2 (PRCC2) is known to be a very aggressive type of kidney cancer with a high metastatic potential, poor outcome and absence of effective therapy. Hereditary form of PRCC2 is associated with rare hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma (HLRCC). HLRCC is characterized by germline heterozygous mutations in the Fumarate Hydratase (FH) gene that encodes an enzyme of the Krebs cycle, Fumarase. It has been shown that the accumulation of fumarate induces activation of Hypoxia Inducible Factor (HIF) and ROS (Reactive Oxygen Species) pathways. Nevertheless, no FH gene mutation has been reported in sporadic PRCC2 tumors. The goal of this study is to better characterize hereditary and sporadic PRCC2. Our transcriptome analysis identified the set of genes that are differentially expressed between the two types of PRCC2. Subsequent immunohistochemistry screening did not reveal any potential diagnostics biomarkers. Further, the comprehensive computational analysis of gene profiling data revealed that hereditary and sporadic PRCC2 share the similar molecular signature with NRF2-KEAP1 axis deregulation as one of the major pathway in both forms. We demonstrated that over expression of Aldo-keto reductase family 1 member B10 (AKR1B10) is the direct consequence of the antioxidant response element (ARE) activation shared in hereditary and sporadic tumors. Finally, we have established FH-deficient cell line (NCCFH1) a new preclinical model of hereditary PRCC2. It presents the perfect platform for studying the metabolic features and testing new therapies for hereditary PRCC2, while bortezomib appears to be a potential efficient therapeutic option.

La protéine kinase activée par AMP (AMPK) est un senseur et régulateur central de l'état énergétique cellulaire, mais ces voies de signalisation ne sont pour le moment que partiellement comprises. Deux criblages non-biaisés pour la recherche de partenaires d'interaction et de substrats d'AMPK ont précédemment été réalisés dans le laboratoire. Ces derniers ont permis l'identification de plusieurs candidats (protéines), mais leur rôle fonctionnel et physiologique n'était pas encore établi. Ici nous avons caractérisé la fonction de la relation entre AMPK et quatre partenaires d'interaction : gluthation S-transferases (GSTP1 and GSTM1), fumarate hydratase (FH), l'E3 ubiquitine-ligase (NRDP1), et les protéines associées à la membrane (VAMP2 and VAMP3). Chacune de ces interactions parait avoir un rôle différent dans la signalisation AMPK, agissant en amont ou en aval de la protéine AMPK. GSTP1 et GSTM1 contribueraient à l'activation d'AMPK en facilitant la S-glutathionylation d'AMPK en conditions oxydatives moyennes. Cette régulation non-canonique suggère que l'AMPK peut être un senseur de l'état redox cellulaire. FH mitochondrial est l'unique substrat AMPK clairement identifié. Etonnamment le site de phosphorylation se trouve dans le peptide signal mitochondrial, ce qui pourrait affecter l'import mitochondrial. NRDP1, protéine pour laquelle nous avons pour la première fois développé un protocole de production de la protéine soluble, est faiblement phosphorylée par l'AMPK. L'interaction ne sert pas à l'ubiquitination d'AMPK, mais affecte le renouvellement de NRDP1. Finalement, l'interaction de VAMP2/3 avec AMPK n'implique pas d'évènement de phosphorylation ou d'activation d'un des partenaires. Nous proposons un mécanisme de recrutement d'AMPK par VAMP2/3 (" scaffold ") au niveau des vésicules en exocytose. Ce recrutement favoriserait la phosphorylation de substrats de l'AMPK à la surface des vésicules en exocytoses. Une fois mis en commun, nos résultats enrichissent les connaissances sur les voies de signalisation AMPK, et suggèrent une grande complexité de ces dernières. Plus que les kinases en amont et des substrats en aval, la régulation de la signalisation d'AMPK se fait via des modifications secondaires autres que la phosphorylation, via des effets sur le renouvellement de protéines, et probablement via un recrutement spécifique de l'AMPK dans certains compartiments cellulaires.

This thesis focuses on gynecopathology. It consists of a collection of seven papers published in pathology journals with impact factor. Introduction section contains selection of examples showing scientific application of molecular genetic methods. Further on the aims of individual research projects are described. The first project comprises histomophologic study of skin endometriosis addressing "mullerian" differentiation. A case report of a rare tumor namely borderline papillary serous tumor of the fimbriated end of the fallopian tube follows with molecular genetic analysis of KRAS, BRAF and p53 gene mutation status. Prospective longitudinal study on high grade squamous dysplasia (HSIL) of the cervix in HPV vaccinated women, so called DAV (dysplasia after vaccination), aims to elucidate pathogenesis of this phenomenon. Two other studies focus on incidence of fumarate hydratase deficient leiomyomas of the uterus and hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma syndrome (HLRCC). The aim of those studies is to improve our diagnostic capability and increase detection rate of the patients with HLRCC syndrome. Finally a new subtype of HSIL namely bizarre cell dysplasia is described in two separate studies. Conclusion remarks contemplate the role of molecular genetics in surgical pathology.

This thesis focuses on gynecopathology. It consists of a collection of seven papers published in pathology journals with impact factor. Introduction section contains selection of examples showing scientific application of molecular genetic methods. Further on the aims of individual research projects are described. The first project comprises histomophologic study of skin endometriosis addressing "mullerian" differentiation. A case report of a rare tumor namely borderline papillary serous tumor of the fimbriated end of the fallopian tube follows with molecular genetic analysis of KRAS, BRAF and p53 gene mutation status. Prospective longitudinal study on high grade squamous dysplasia (HSIL) of the cervix in HPV vaccinated women, so called DAV (dysplasia after vaccination), aims to elucidate pathogenesis of this phenomenon. Two other studies focus on incidence of fumarate hydratase deficient leiomyomas of the uterus and hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma syndrome (HLRCC). The aim of those studies is to improve our diagnostic capability and increase detection rate of the patients with HLRCC syndrome. Finally a new subtype of HSIL namely bizarre cell dysplasia is described in two separate studies. Conclusion remarks contemplate the role of molecular genetics in surgical pathology.