Würzburg, Univ., Diss., 2003. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2002. Computerdatei im Fernzugriff.

Würzburg, Univ., Diss., 2003. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2002. Computerdatei im Fernzugriff.

Im Rahmen der Arbeit werden Ergebnisse zu Untersuchungen an Fumonisinen, einer erts seit 1988 bekannten Gruppe von kanzerogenen Fusarium-Mykotoxinen, vorgestellt. Die Schwerpunkte liegen auf den Aspekten: 1)Qualitative und quantitative Erfassung von NCM-FB1, einem rektionsprodukt von FB1, in maishaltigen Lebensmitteln. 2)Charakterisierung weiterer Reaktionsprodukte der Fumonisine 3)Vorkommen von Fumonisisnen in Gemüse 4)Zellkuturstudien zur biologischen Aktivität der Fumonisine 5)Modellstudien zum Metabolismus von FB1 beim Menschen / The work presents results of investigations on fumonisins, a class presents results of investigations on fumonisins, a class of carcinogenic Fusarium mycotoxins discovered in 1988. Studies focused on following aspects: 1) Qualitative und quantitative determination of N-(Carboxymethyl) fumonisin B1, a reaction product of fumonisin B1, in corn products 2) Characterisation of further fumonisin reaction products 3) Occurrence of fumonisins in vegetables 4) Cell culture studies on the biological activity of fumonisins 5) Model experiments on the metabolism of fumonisin B1 in humans

Fumonisin B1 (FB1) is a mycotoxin produced by various Fusarium species and constitutes a major contaminant of maize worldwide. A 2-year carcinogenicity study of the National Toxicology Program (NTP) in Fischer N344 rats showed that male rats were most susceptible to FB1-induced tumor formation in the kidney. Histopathologically, a rare and highly malignant tumor type originating from the proximal tubules of rat kidney with increased potential for invasion and metastasis was identified. However, mechanisms underlying the FB1-induced carcinogenesis in kidneys of male rats are still not clear. Previous studies have shown that FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism via inhibition of ceramide synthase is a primary key event in FB1 toxicity. The disruption of sphingolipid metabolism may cause time- and dose-related changes in the relative balance of various bioactive intermediates. Furthermore, the ability of FB1 to induce renal cell death and subsequent compensatory cell proliferation is well known, but it does not completely explain the invasive growth characteristics and exceptionally high metastatic potential of FB1-induced tumors. Considering the complexity of sphingolipid metabolism and the fact that various sphingolipids (e.g. ceramide, sphingoid bases and their respective 1-phosphates) act on opposing signaling pathways, it is hypothesized that the balance between individual sphingolipids and thus the overall cellular response to FB1 may shift with time and by continuing FB1 exposure, resulting in the disruption of specific cell signaling pathways, which may promote tumor formation in kidney. To identify early FB1-induced gene expression patterns in the kidney, which may be associated with sphingolipid-mediated signaling pathways in cancer, a short-term i.p. study on FB1 in male Sprague Dawley rats was performed and changes in gene expression were analyzed using a qRT-PCR array that comprises 84 relevant genes of 6 pathways pivotally involved in the formation of cancer. Furthermore, apoptosis and cell proliferation as well as changes in specific sphingolipids were investigated in FB1-treated kidneys. As shown by classical histopathology (H&E) and (immuno)-histochemical staining (TUNEL and BrdU), FB1 caused a time- and dose-dependent increase in tubular apoptosis in the cortex and OSOM of the kidney, which was compensated by the induction of proliferation in the affected areas. HPLC-MS/MS analysis of bioactive sphingolipids demonstrated that FB1 induced a marked elevation of the pro-apoptotic sphingoid bases sphinganine and sphingosine, which paralleled the time- and dose-dependent increase in renal tubular apoptosis. With prolonged exposure to FB1, increased metabolic conversion of the accumulated sphinganine to the sphinganine-1-phosphate, a second messenger with anti-apoptotic and proliferative properties, was observed in kidney. This finding was compliant with the increased regenerative cell proliferation in the cortex and OSOM. In addition to effects on sphingoid bases and their 1-phosphate metabolites, this study, for the first time, demonstrated reduced levels of specific ceramides in rat kidney after FB1 exposure. In particular, C16-ceramide, which is a widespread constituent of membrane-bound complex sphingolipids involved in cell adhesion, was time- and dose-dependently decreased after treatment with FB1. Besides its role as component of the cell membrane, C16-ceramide functions as a signaling molecule for the initiation of apoptosis in response to various stress stimuli. Under conditions of chronic FB1 exposure, a significant reduction in pro-apoptotic C16-ceramide together with markedly increased levels of anti-apoptotic and proliferation-promoting sphingoid base 1-phosphates may thus favor resistance to stress-induced apoptosis and facilitate the survival of abnormal cells with potential to initiate tumor formation. Our study also revealed that early exposure to FB1 resulted in increased expression of a plethora of genes involved in tumor initiation as well as tumor progression. While single FB1 exposure was demonstrated to predominately induce gene expression of proto-oncogenic transcription factors (e.g. Fos, Jun, Myc) and apoptotis-related genes (e.g. members of the tumor-necrosis factor family), repeated exposure resulted in marked upregulation of genes mediating cell survival and cell proliferation (e.g. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 and Egfr). Moreover, continued exposure to FB1 initiated increased expression of genes critically involved in tumor migration, adhesion, invasion and metastasis. A close correlation was established between gene expression changes in response to FB1 and known signaling pathways mediated by extracellular or intracellular action of sphingoid base 1-phosphates - bioactive lipids that were markedly increased after FB1 treatment. In particular, genes encoding components of the plasminogen activator system were abundantly upregulated. These mediate invasion and metastasis in response to So1P, and may hence particularly promote the formation of highly aggressive and invasive tumors in kidney as observed after chronic exposure to FB1. Thus, it is conceivable that upregulation of a majority of genes in response to FB1 may be a direct or indirect consequence of increased So1P signaling. Another aim of this study was to identify differences in the organ-specific susceptibility for tumor formation by comparing FB1-mediated effects on apoptosis, cell proliferation, sphingolipids, and selected cancer-related genes in kidney and liver. Collectively, the present results revealed that kidney and liver showed marked differences in several endpoints of FB1 toxicity, which seemed to be primarily associated with their different susceptibility to FB1-mediated alterations in sphingolipid metabolism. The strong correlation between histopathological lesions and alterations in sphingolipid metabolism as well as sphingoid base 1-phosphate accumulation and concomitant S1P receptor expression suggested that tumor formation and progression to highly malignant carcinomas seems to be rather favored in kidney compared to liver. However, genes mostly deregulated by FB1 treatment in kidney (PAI-1, Thbs1 and Itga2) were also found to be induced in liver. To verify FB1-induced gene expression in kidney, normal rat tubular epithelial (NRK-52E) cells were analyzed for FB1-induced expression changes of the same cancer-related genes as in vivo. The results of qRT-PCR analysis revealed that gene expression changes in NRK-52E cells after FB1 treatment strongly correlated with those found in rat kidney and paralleled the marked alterations in sphingolipid metabolism. Furthermore, a good correlation between FB1-induced expression changes of cancer-related genes obtained in vivo and in vitro and those known to be mediated by bioactive sphingoid base 1-phosphates in cancer was established. Moreover, experiments modeling the invasive behavior of NRK-52E cells showed that FB1 may enhance cell invasion, which also correlated with both the increase in invasion- and metastasis-associated genes and bioactive sphingoid base 1-phophates. Importantly, NRK-52E cells basally expressed the S1P receptors S1P2 and S1P3, which are known to be involved in tumor migration and invasion. Since these receptors were also identified as most abundant S1PRs in kidneys of male Sprague Dawley rats, they may present important mediators of gene expression and invasion in response to FB1 in vivo. In summary, FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism and subsequent time- and dose-related increase in intermediates, such as bioactive sphingoid base 1-phosphates, correlate with early changes in genes and signaling pathways that may mediate loss of growth control, replication, evasion of apoptosis, cell motility and invasion, and thus favor renal tumor formation in response to FB1. However, to clarify whether the obtained gene expression changes in cancer-related genes in kidney are specific to the biological action of sphingoid base 1-phosphates and their respective receptors, further mechanistic studies are necessary. / Fumonisin B1 ist ein Mykotoxin, das von verschiedenen Spezies der Gattung Fusarium produziert wird, und weltweit wesentlich zur Kontamination von Mais beiträgt. Eine zweijährige Kanzerogenitätsstudie des National Toxicology Programs (NTP) zeigte, dass männliche Ratten nach Verabreichung von FB1 am anfälligsten für die Bildung von Nierentumoren waren. Aus histopathologischer Sicht handelte es sich dabei um sehr seltene und hoch maligne Formen von Tumoren des proximalen Tubulus der Niere, die eine verstärkte Neigung zur Invasion und Metastasierung aufwiesen. Jedoch sind bis heute die genauen Mechanismen nicht hinreichend geklärt, die zu einer FB1-induzierten Kanzerogenese in der Rattenniere führen können. Frühere Studien berichteten, dass die durch FB1 vermittelte Störung des Sphingolipidmetabolismus mittels Inhibierung der Ceramidesynthase ein initiales Ereignis in der Toxizität darstellt und zu zeit- und dosisabhängigen Veränderungen im relativen Gleichgewicht verschiedener bioaktiver Zwischenprodukte des Sphingolipidmetabolismus führen kann. Des Weiteren ist bekannt, dass FB1 dazu in der Lage ist, in der Niere Zelltod gefolgt von regenerativer Zellproliferation zu induzieren. Dies erklärt jedoch nicht vollständig, wie die durch FB1 verursachten Tumore ein invasives Wachstum und außergewöhnlich hohes Metastasierungspotential erlangen. Die Komplexität des Sphingolipidmetabolismus und die Tatsache, dass verschiedene Sphingolipide (z.B. Ceramide, Sphingoidbasen und ihre entsprechenden 1-Phosphate) einen Einfluss auf gegensätzliche Signalwege in der Zelle ausüben können, deuten darauf hin, dass das Gleichgewicht zwischen den einzelnen Sphingolipiden und somit die gesamten zellulären Effekte von FB1 über die Zeit und mit zunehmender Exposition gegenüber FB1 zu Störungen spezifischer Signalwegen führen können, die eine Tumorentstehung in der Niere begünstigen. Um frühere Effekte von FB1 auf das Expressionsmuster von Genen in der Niere zu ermitteln, die möglicherweise mit den durch Sphingolipide vermittelten Signalwegen und Krebs verbunden sind, wurde eine Kurzzeitstudie mit FB1 in männlichen Sprague Dawley-Ratten durchgeführt und die Veränderungen der Genexpression von 84 Genen der 6 wichtigsten, krebsrelevanten Signalwege mittels qRT-PCR untersucht. In diesem Zusammenhang wurden in Nieren der FB1-behandelten Tiere auch Untersuchungen zu Apoptose, Zellproliferation sowie zu Veränderungen der spezifischen Sphingolipide durchgeführt. Anhand klassischer histopatholgischer sowie (immun)-histologischer Färbungen konnte gezeigt werden, dass FB1 zu einem zeit- und dosisabhängigen Anstieg von Apoptose in Cortex und OSOM der Niere führte, dem gleichzeitig eine gesteigerte Proliferation in den entsprechenden Bereichen folgte. Die HPLC-MS/MS-Analyse bioaktiver Sphingolipide in der Niere zeigte, dass die Behandlung mit FB1 zeitgleich zu einem Anstieg der pro-apoptotischen Sphingoidbasen Sphinganin und Sphingosin und verstärkter tubulärer Apoptose führte. Mit anhaltender Exposition gegenüber FB1 konnte in der Niere eine Zunahme der metabolischen Umwandlung von Sphinganin in Sphinganine-1-Phosphat, einem sekundären Botenstoff mit anti-apoptotischen und wachstumsfördernden Eigenschaften, beobachtet werden. Diese Beobachtung stimmte auch mit der verstärkten regenerativen Zellproliferation in Cortex und OSOM der Niere überein. Weiterhin konnte mittels Sphingolipidanalyse erstmals gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber FB1 zu einer Verminderung spezifischer Zellceramide führte. Insbesondere der Gehalt an C16-Ceramid wurden durch die Behandlung mit FB1 zeit- und dosishängig in der Niere reduziert. Neben seiner Funktion als Bestandteil der Zellmembran spielt C16-Ceramide eine wichtige Rolle als Grundbaustein von komplexen, Zelladhäsion fördernden Sphingolipiden und ist in Gegenwart verschiedener Stressfaktoren auch ein wichtiges Signalmolekül in der Initiierung von Apoptose. Im Fall einer chronischen Exposition gegenüber FB1 könnten demnach stark verminderte Gehalte an pro-apoptotischen C16-Ceramid, verbunden mit drastisch erhöhten Gehalten an anti-apoptotischen und wachstumsfördernden Sphingoidbasen-1-Phosphaten, zu einer Resistenz gegenüber stressbedingter Apoptose führen, die das Überleben initiierter Zellen und damit die Tumorentstehung begünstigen. Weiterhin zeigte unsere Studie, dass bereits eine frühe Exposition gegenüber FB1 die Expression einer Reihe von Genen in der Niere erhöht, die in der Tumorentstehung- sowie Progression eine Rolle spielen. Während die einmalige Verabreichung von FB1 hauptsächlich zu einem Anstieg der Expression von Transkriptionsfaktoren (z.B. Protoonkogene wie Fos, Jun und Myc) und apoptotischen Gene (z.B. Mitglieder der Familie der Tumornekrosefaktorrezeptoren) führte, wurde nach mehrmaliger Exposition eine deutliche Heraufregulierung von Genen beobachtet, die das Wachstum und Überleben von Zellen (z.B. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 und Egfr) vermitteln. Des Weiteren führte die längere Exposition zu einem Anstieg der Expression von Genen, die entscheidend an Migration, Adhäsion, Invasion und Metastasierung von Tumoren beteiligt sind. Dabei konnte ein enger Zusammenhang zwischen den FB1-induzierten Genexpressionsveränderungen und bereits bekannten extrazellulären und intrazellulären Signalwegen von bioaktiven Sphingoidbasen-1-Phosphaten hergestellt werden. Dazu zählte vor allem die Erhöhung von Genen, die wichtige Komponenten des ‚Plasminogen-Aktivator‘-Systems kodieren, und in Gegenwart von Sphingosine-1-Phosphat zu einer Erhöhung der Invasivität und Metastasierung, und somit möglicherweise auch zu einer begünstigten Bildung hochaggressiver und invasiver Tumoren in der Niere nach chronischer Exposition gegenüber FB1 beitragen können. Ein weiteres Ziel der Studie war es, mögliche Unterschiede in der organspezifischen Disposition für die Entstehung von Tumoren zu ermitteln, indem die FB1-vermittelten Effekte auf Apoptose, Zellproliferation, Sphingolipide, und ausgewählte krebsrelevante Gene zwischen Niere und Leber verglichen wurden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass zwischen Niere und Leber deutliche Unterschiede in den verschiedenen Endpunkten der FB1-vermittelten Toxizität existieren, welche hauptsächlich mit der unterschiedlichen Anfälligkeit gegenüber den FB1-induzierten Veränderungen des Sphingolipidmetabolismus in Zusammenhang gebracht werden. Anhand der starken Korrelation zwischen den beobachteten histopathologischen Läsionen und gleichzeitig starken Veränderungen im Sphingolipidmetabolismus, sowie der Akkumulation von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und entsprechender Expression der Sphingosine-1-Phosphatrezeptoren in der Niere, lässt sich vermuten, dass die Tumorentstehung- und Progression zu hoch malignen Karzinomen eher in der Niere als in der Leber begünstigt ist. Die durch die FB1-Behandlung am stärksten deregulierten Gene (PAI-1, Thbs1 und Itga2) in der Niere, wurden jedoch auch in der Leber durch FB1 induziert. Um die Genexpressionsveränderungen in der Niere zu verifizieren, wurden Ratten-tubulusepithelzellen (NRK-52E-Zellen) mit FB1 behandelt und Veränderungen in der Expression der gleichen krebsrelevanter Gene, die zuvor in vivo untersucht wurden, analysiert. Die Ergebnisse der qRT-PCR-Analyse zeigten, dass die Genexpressionsveränderungen in NRK-52E-Zellen nach Behandlung mit FB1 sowie die damit verbundenen Veränderungen im Sphingolipidmetabolismus stark mit denen in der Rattenniere korrelierten. Es konnte zudem sowohl in vivo als auch in vitro eine gute Übereinstimmung der FB1-induzierten Veränderungen in der Expression krebsrelevanter Gene gefunden werden, die auch in Signalwegen von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und der damit verbundenen Krebsentstehung eine Rolle spielen. Darüber hinaus zeigten Experimente zur Untersuchung der Invasivität von NRK-52E-Zellen, dass diese nach Behandlung mit FB1 ein höheres Invasionspotential aufweisen. Dies korrelierte sowohl mit der Beobachtung von Expressionserhöhungen von invasions- und metastasierungsfördernden Genen als auch dem Anstieg bioaktiver Sphingoidbasen-1-Phosphate. Interessanterweise konnte in der vorliegenden Studie festgestellt werden, dass NRK-52E-Zellen die Sphingosine-1-Phosphatrezeptoren S1P2 und S1P3 expremieren und über diese Rezeptoren möglicherweise Signalwege zur Migration und Invasion anregen können. Da S1P2 und S1P3 auch als Hauptsphingosine-1-Phosphatrezeptoren in der Rattenniere identifiziert wurden, lässt sich vermuten, dass diese nach FB1-Behandlung in vivo wesentlich zur Expression von Genen, die die Invasivität von Zellen erhöhen, beitragen können. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die FB1-vermittelte Störung im Sphingolipidmetabolismus und der damit verbundene zeit- und dosisabhängige Anstieg bioaktiver Intermediate wie den Sphingoidbasen-1-Phosphaten, zu frühen Veränderungen in Genen und Signalwegen führen kann. Diese können Zellwachstum, Inhibierung von Apoptose, Migration und Invasion und somit die Bildung von Nierentumoren nach Exposition gegenüber FB1 fördern. Um jedoch zu klären, ob die ermittelten Genexpressionsveränderungen der untersuchten krebsrelevanten Genen in der Niere spezifisch mit der Wirkung von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und deren Rezeptoren zusammenhängen, sind weiterführende mechanistische Studien notwendig.

Universiẗat, Diss., 2003--Würzburg. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2002.

Les mycotoxines telles que la fumonisine B1 (FB1) produites par les champignons du genre Fusarium sont particulièrement préoccupantes pour la filière maïsicole. L’ensilage de maïs est un processus de fermentation naturel susceptible de favoriser l’évolution des teneurs en FB1. La maîtrise du risque de contamination par la FB1 et la recherche de moyens permettant la décontamination des ensilages est donc nécessaire. L’objectif de ce travail est de caractériser le devenir de la FB1 dans les ensilages de maïs grain et de mettre en évidence l’existence d’agents microbiens capables de dégrader cette toxine. Pour cela, des mini-silos contenant du maïs grain naturellement contaminé en FB1 provenant de différents parcelles et issus des deux années de récolte ont été préparés. La stratégie analytique basée sur le dosage de la FB1 libre et la FB1 complexée par HPLC-MS/MS a révélé une diminution significative de la teneur en FB1 totale qui ne peut être attribuée à un mécanisme de complexation et résulte d’un mécanisme de dégradation. La recherche du microbiote associé à la dégradation de la FB1 a été réalisée par deux approches complémentaires : Une analyse métagénomique combinant l’extraction sélective de l’ADN microbien et le séquençage haut débit «shotgun» afin de comparer la diversité taxonomique et fonctionnelle d’un ensilage dégradant la FB1 et d’un ensilage moins dégradant. En parallèle, un criblage de microorganismes cultivables capables de métaboliser la FB1 a été conduit et a permis de confirmer les résultats de l’analyse globale. Ce travail apporte une première image du microbiote potentiellement associé à la dégradation de la FB1, ainsi que des activités microbiennes responsables. / Fungi of the genus Fusarium are one of the major contaminants of maize that can produce mycotoxins, such as the fumonisin B1 (FB1). Maize silage which is based on the fermentation of whole crop plant or grains is considered the main source of monogastrics and cattle feeding in Europe. The ensiling process could favor changes in FB1 content; however this has scarcely been documented. This led to questioning regarding the possibility of managing the microbiota during ensiling in order to reduce the level of mycotoxins exposure and improve feed quality. The aim of this work is to study the fate of FB1 during ensiling process of high moisture maize grain and to identify an endemic microbiota capable of degrading FB1. Laboratory scale silages were prepared with naturally contaminated FB1 grains from two cropping years. An analytical procedure allowed assessing both free and matrix associated FB1 forms and showed a significant decrease in total FB1 content that are not linked to the presence of bound FB1. Additionally, our data showed that the FB1 content decrease was mainly due to a degradation process. Identification of a potential microbiota responsible for FB1 degradation was conducted. A metagenomics approach combining a selective microbial DNA extraction and high-throughput shotgun sequencing showed microbial specific patterns between FB1 degrading and weakly degrading silage. These results were also supported by the isolation of microbial strains able to metabolize FB1. Ultimately, this work evidenced a microbiota associated to FB1 degradation and the functional diversity involved in this activity. Bacteria and yeasts have been obtained for further studies on degradation activities and their usage as silage starter.

Le métabolisme des monocarbones relie le métabolisme cellulaire à la machinerie épigénétique à travers une molécule commune, la S-adénosylméthionine (SAM). Les changements dans le potentiel de méthylation cellulaire (ratio SAM/SAH) sont impliqués dans plusieurs maladies, notamment l'hépatocarcinome et les défauts de fermeture du tube neural (NTD). La perturbation du ratio SAM/SAH peut être liée à des déficits enzymatiques ou à une exposition à un facteur environnemental. La reméthylation de l'homocystéine (HCY) en méthionine est catalysée par la méthionine synthase (MTR) ou la bétaïne homocystéine méthyltransférase (BHMT) dans le foie. En comparant le tissu tumoral au tissu sain environnant dans le foie, les transcrits de BHMT étaient fortement diminués dans les échantillons mais pas les transcrits de MTR. La protéine BHMT n'a pas été détectée dans les cellules HepG2 et dans 5 des 6 échantillons tumoraux analysés. L'absence d'expression de BHMT était due à un variant génétique conduisant un codon stop prématuré. Une déficience pré-natale en donneurs de méthyle aggrave la susceptibilité face à certaines maladies. La fumonisine B1 (FB1) est une mycotoxine qui contamine les céréales et a été identifiée comme étant un facteur de risque de survenue de tumeur et des NTD. Nous avons étudié les récepteurs des folates et 4 marques de l'hétérochromatine dans le foie des foetus de rat issus de mères exposées à un régime déficient en donneurs de méthyle et/ou à la FB1 à une dose deux fois supérieure à la dose journalière admissible. Le régime carencé et la FB1 diminuent le ratio SAM/SAH. La FB1 inverse le mécanisme d'adaptation consistant en une régulation positive de l'expression des récepteurs des folates lors d'une carence seule. Le régime carencé diminue H4K20me3 mais une combinaison carence/FB1 diminue encore d'avantage H4K20me3 et augmente H3K9me3. Cette augmentation de H3K9me3 peut être vu comme un mécanisme de défense incitant la cellule à résister à la désorganisation de l'hétérochromatine. H3R2me2 et H4K16ac varient également selon ce mécanisme. Cette étude est pertinente car elle suggère que de faibles doses de FB1 interagissent avec la carence en donneurs de méthyle pour perturber le profil épigénétique / Folate-mediated 1-carbon metabolism is a conduit that links cellular metabolism to the epigenetic machinery through the common molecule, AdoMet. There is strong evidence that changes in the cellular methylation potential (AdoMet/AdoHcy ratio) is involved in several types of disease notably tumor proliferation like hepatocarcinoma and developmental disease like neural tube defects. Perturbation of AdoMet/AdoHcy ratio may be related to a cellular cause like enzyme defect or to exposure to an environmental factor. The remethylation of homocysteine to methionine is catalyzed either by methionine synthase (MTR) or by betaine-homocysteine methyltrnasferase (BHMT) in the liver. By comparing tumor tissue to surrounding healthy tissue in the liver we have found that BHMT transcripts, but not MTR, are strongly decreased in tumor samples. Consistently, BHMT protein was not detected in HepG2 cells and in 5/6 tumors investigated. Abolition of BHMT expression was due to a genetic variant producing a premature termination codon. Prenatal methyl deficient diet (MDD) enhances susceptibility to disease. Fumonisin FB1 is a corn contaminating mycotoxin identified as a risk factor for tumor occurrence and neural tube defects. We have investigated folate receptors and 4 heterochromatin markers in rat foetuses liver derived from dams exposed to MDD and/or FB1 administered at a dose twice higher than the Provisional Maximum Tolerable Daily Intake. We found that MDD and even FB1 by itself decrease the AdoMet/AdoHcy ratio. FB1 reverses the adaptation mechanism consisting in upregulating folate receptors in case of folate depletion. MDD decreased H4K20me3 but combined MDD/FB1 decreased H4K20me3 even more and increased H3K9me3. The elevated H3K9me3 can be viewed as a defence mechanism inciting the cell to resist heterochromatin disorganisation. H3R2me2 and H4K16Ac varied according to this mechanism. This study is relevant because it suggests that low doses of FB1 interact with methyl depletion to disrupt the epigenetic landscape

In questa tesi di dottorato sono stati indagati i punti critici del ciclo vitale del fungo Fusarium verticillioides, produttore di fumonisine in mais. Le fumonisine sono metaboliti secondari prodotte da funghi appartenenti tutti al genere fusarium e sono state classificate come sostanze cancerogene per l'uomo e per gli animali. Gli argomenti trattati nei vari capitoli sono stati: contaminazione da fumonisine nel mais coltivato nel nord Italia ed effetto delle diverse tecniche colturali, produzione di spore, dispersione di spore, infezione, parametri ecologici che condizionano la crescita e l'accumulo di fumonisina ed il controllo con mezzi chimici in campo su F. verticillioides e Ostrinia nubilalis, un lepidottero che aumenta la contaminazione. / Aim of this work was to collect missing information about critical point of the disease life cycle, to develop a conceptual model for the dynamic simulation of the life cycle of Fusarium verticillioides in maize and the consequent production of fumonisin B1 in kernels. Fumonisin is a secondary metabolite reported as toxigenic in humans and animals. Issues treated are: Fumonisin contamination in maize in Italy and effect of field managements, spore production, spore dispersal, variables influencing growth and toxin accumulation and chemical control of the disease in field.

Les sphingolipides et plus particulièrement les bases à longue chaîne (LCBs) jouent un rôle crucial dans l'induction de la mort cellulaire programmée. Chez les végétaux, la fumonisine B1 (FB1), une mycotoxine produite par le champignon nécrotrophe Fusarium moniliforme, perturbe la voie de biosynthèse des sphingolipides ce qui conduit à l'accumulation des deux LCBs majoritaires chez Arabidopsis thaliana, à savoir la phytosphingosine (PHS) et la dihydrosphingosine (DHS). Néanmoins, la voie de signalisation induite par la FB1 demeure largement inconnue à ce jour. En utilisant A. thaliana, l'équipe a récemment montré qu'en réponse aux LCBs ou à la FB1, les protéines 14-3-3 sont phosphorylées par la protéine kinase dépendante du calcium CPK3, à laquelle elles sont associées de manière constitutive. Cette phosphorylation conduit à la dissociation du complexe CPK3/14-3-3s et au clivage de la protéine kinase qui a été identifiée comme étant un régulateur majeur de cette voie de signalisation. L'objectif de mon travail de thèse s'est inscrit dans la continuité de ces travaux et a consisté, de manière générale, à une meilleure compréhension des processus impliquant la protéine kinase CPK3, notamment sa régulation par les 14-3-3s et son devenir après la dissociation du complexe en réponse aux LCBs. A travers mes travaux de thèse, j'ai pu montrer que CPK3 interagit préférentiellement avec les isoformes de 14-3-3s appartenant au groupe non-epsilon de manière phospho- et calcium-dépendante en condition contrôle. Suite à sa perte d'interaction avec les 14-3-3s, j'ai montré que le domaine variable N-terminal de CPK3 est clivé de manière LCB-dépendante. Ce clivage est à corréler avec l'activation, dépendante de la PHS et de la FB1, de la protéase à cystéine de type papaïne, RD21 (responsive-to-dessication 21). De manière intéressante, alors que la forme pleine longueur de CPK3 est principalement associée aux membranes en condition contrôle, la forme clivée de cette protéine kinase est retrouvée exclusivement au niveau de la fraction soluble. Une approche génétique associée à des analyses phénotypiques indique que RD21 agit en tant que régulateur négatif de la PCD induite par la FB1 chez A. thaliana. / The sphingolipids and more particularly the long chain bases (LCBs) play a crucial role in the induction of programmed cell death. In plants, the mycotoxin fumonisin B1 (FB1) produced by the necrotrophic fungus Fusarium moniliforme disrupts sphingolipid biosynthesis, leading to the accumulation of the two major LCBs in Arabidopsis thaliana, i.e. phytosphingosine (PHS) and dihydrosphingosine (DHS). However, the FB1-induced signaling pathway remains largely unknown. By using A. thaliana as a plant model, the team has recently shown that, upon LCB or FB1 treatment, 14-3-3 proteins are phosphorylated by the calcium-dependent protein kinase, CPK3, with which 14-3-3s are constitutively associated. This phosphorylation event leads to the dissociation of the CPK3/14-3-3 complex and to CPK3 cleavage, which was identified as a crucial regulator of this signaling pathway. In this context, the objectives of my thesis were to get a deep further in the knowledge of this signaling pathway involving the protein kinase CPK3, including its regulation by 14-3-3s and its becoming after complex dissociation in response to LCBs. Thus, I have shown that CPK3 preferentially binds to the non-epsilon 14-3-3 isoforms in a phospho- and calcium-dependent manner in control condition. After the CPK3/14-3-3 complex dissociation, I have demonstrated that the N-terminal variable domain of CPK3 is cleaved in a LCB-dependent manner. This cleavage can be correlated with the PHS/FB1-induced activation of the papain-like cysteine protease, RD21 (responsive-to-dessication 21). Interestingly, while full-length CPK3 is mainly associated to membranes in control condition, its FB1-induced cleaved form becomes soluble. A genetic approach associated to phenotype analyses indicates that RD21 acts as a negative regulator of FB1-induced cell death in A. thaliana.

Scopo di questa tesi di dottorato è stato quello di monitorare la presenza di micotossine lungo la filiera produttiva del mais. Inizialmente è stata valutata la contaminazione da micotossine della granella di mais, proveniente da due regioni italiane. Le micotossine, la cui presenza era più estesa e rilevante, erano le fumonisine. Sono state indagate le condizioni di umidità e temperatura più favorevoli alla produzione di AFB1 da parte di un ceppo di Aspergillus flavus. L'ibrido DKC5353 ha presentato le minori contaminazioni, in tutte le località in cui è stato coltivato, per quanto riguarda la contaminazione da fumonisine. Tra i vari trattamenti insetticidi e fungicidi testati per l'efficacia nella riduzione della contaminazione da fumonisine, solo uno ha dato riscontro positivo. È stata valutata la ripartizione delle fumonisine nelle frazioni di molitura e nei sottoprodotti della lavorazione dell'olio di mais. Entrambi i processi si sono dimostrati efficaci metodi di decontaminazione. Dalle analisi sulle farine di mais per polenta emerge la necessità di intensificare i controlli e sorvegliare i punti critici del processo di molitura. / The aim of this study was to monitor the occurrence of mycotoxins over productive cycle of maize. Samples of maize kernels, coming from two Italian regions, were analysed to quantify mycotoxins contamination: the mycotoxins, that showed the most widespread and significant occurrence, were fumonisins. The conditions of humidity and temperature, in which an Aspergillus flavus strain produced the greatest quantity of AFB1, were investigated. Considering fumonisins content, hybrid DKC5353 showed the least contaminations, in all places it was grown. Only one of the various insecticide and fungicide treatments tested was effective. The distribution of fumonisins in several milling fractions and by-products of corn oil manufacture: both processes proved successful methods of decontamination. The necessity of increase controls and monitor the critical points of milling process emerged from the analyses on polenta maize flour.