Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-10-30T16:15:01Z No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2017-11-12T14:08:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-12T14:08:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) Previous issue date: 2017-11-12 / A criptococose é uma doença com mais de 223 mil novos casos por ano, acarretando a morte de aproximadamente 181 mil pessoas, principalmente indivíduos HIV positivos. Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies causadora da meningoencefalite criptocócica, dentre outras complicações. Os tratamentos utilizados atualmente são antifúngicos como anfotericina B, flucitosina e fluconazol. Contudo, essas drogas possuem limitações como toxicidade, custo e o surgimento de resistência em algumas linhagens. Dessa forma, terapias alternativas como uso de citocinas e anticorpos monoclonais vem sendo criados no intuito de desenvolver novas ferrramentas para o tratamento e diagnóstico desta doença. Alguns estudos mostram que mAbs (IgGs) contra glicuronoxilomanana (GXM) da cápsula de C. neoformans podem proteger contra a infecção em camundongos, mas que variantes isotípicas IgG3 podem na verdade agravar a doença, diminuindo assim a sobrevida desses animais. Além disso, já foi descrito que diferenças na região constante de IgGs com paratopos idênticos podem levar a alterações no padrão de ligação ao antígeno, o que contrasta com a definição já consolidada de que a região variável é a única responsável pela afinidade ao antígeno. O mecanismo molecular da diversidade de ligação aos antígenos da cápsula de C. neoformans por esses anticorpos de diferentes isotipos ainda é desconhecido e seu estudo possui grande importância, já que parece promover alteração na resposta imunitária, tendo assim um grande potencial para terapia da doença. No intuito de produzir variantes de anticorpos recombinantes para elucidar quais regiões são responsáveis pela mudança no padrão de ligação à cápsula de C. neoformans, foram desenvolvidos, construídos e sintetizados quatorze vetores que codificam híbridos entre isotipos IgG1 e IgG3, sendo 7 derivados do anticorpo 2H1 (um hibridoma secretor de IgG contra GXM) e sete dos anticorpos 3E5 (outro hibridoma secretor de anticorpo contra GXM). Sua produção foi realizada por meio de expressão heteróloga em células CHO DHFR-/- e HEK 293F. Por fim, foram realizados ensaios de imunofluorescência indireta para observar seu padrão de ligação à cápsula de C. neoformans. Neste foi observado que os anticorpos recombinantes 2H1 produzidos são funcionais e que as alterações realizadas em 2H1 CH1, geraram padrões de ligação de puntiforme (IgG3) e anular (IgG1), como esperado. Porém, quando a dobradiça do anticorpo 2H1 IgG3 foi substituída pela dobradiça de IgG1, o padrão de ligação à cápsula parece mudar de puntiforme para anular. Quando o inverso é feito, substituindo em um anticorpo IgG1 a dobradiça de IgG3, o padrão continua anular. Estes resultados indicam que a dobradiça é uma região necessária, mas não suficiente para determinar o padrão de ligação de um anticorpo à cápsula do fungo. / Cryptococcosis is a disease with more than 223 thousand new cases per year, resulting in the death of approximately 181 thousand people, mainly HIV positive individuals. Cryptococcus neoformans and C. gattii are the main species responsible for cryptococcal meningoencephalitis, among other complications. The treatments currently used for this desease involves the antifungals amphotericin B, flucytosine and fluconazole. However, these drugs have limitations such as toxicity, cost and the emergence of resistance in some strains. Thus, alternative therapies such as the use of cytokines and monoclonal antibodies have been created in order to develop new tools for the treatment and diagnosis of this disease. Some studies show that mAbs (IgGs) against C. neoformans capsule glucuronoxylomannan (GXM) may protect against infection in mice, but that IgG3 isotypic variants may actually enhance the disease, thereby decreasing the survival of these animals. In addition, it has been described that differences in the constant region of IgGs with identical paratopes may lead to changes in the antigen binding pattern, which contrasts with the already established definition that the variable region is the only one responsible for the antigen affinity. The molecular mechanism of C. neoformans capsule antigen-binding diversity by these antibodies of different isotypes is still unknown and its study is of great importance, since it seems to affect the immune response and thus have therapeutic potential. In order to produce recombinant antibody variants to elucidate which regions are responsible for the change in C. neoformans capsule binding pattern, fourteen vectors encoding hybrids between IgG1 and IgG3 isotypes were developed, constructed and synthesized, 7 of which were derived from 2H1 antibody (IgG secreting hybridoma against GXM) and seven of the 3E5 antibodies (another GXM antibody secreting hybridoma). The antibodies were produced by heterologous expression in CHO DHFR -/- and HEK 293F cells. Finally, indirect immunofluorescence assays were performed to observe their binding patterns to the C. neoformans capsule. We observed that the 2H1 recombinant antibodies are functional and that the changes made in 2H1 CH1 have generated punctate (IgG3) and annular (IgG1) binding patterns, as expected. However, when we replaced the hinge of the 2H1 IgG3 antibody with its IgG1 counterpart, the capsule binding pattern appeared to change from punctate to annular. When the reverse is done by substituting the hinge in an IgG1 antibody for its IgG3 counterpart, the pattern remained annular. These results indicate that the hinge is necessary but not sufficient to determine the pattern by which an antibody binds to the C. neoformans capsule.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-08-01T12:51:42Z No. of bitstreams: 2 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-08-02T19:47:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T19:47:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) / A cromoblastomicose (CBM) é uma micose subcutânea, crônica, de distribuição cosmopolita, causada por vários fungos demáceos, pigmentados e dimórficos. Pacientes com a doença ainda são tidos como desafio terapêutico, principalmente devido à sua natureza recalcitrante. Tendo em vista a persistência do fungo no tecido e a cronicidade das lesões, a ativação do sistema imunológico do hospedeiro apresenta grande relevância nessa micose. Após infecção com diferentes formas do fungo Fonsecaea pedrosoi (conídios, hifas e células muriformes) isoladamente foi observado manifestações distintas da CBM murina experimental de modo que infecção com células muriformes promoveu o estabelecimento de doença mais duradoura em comparação à infecção com as demais formas do fungo. Ademais, foi visto que a presença de hifas e, principalmente, de células muriformes na lesão, mas não de conídios, está relacionada com alta produção de citocinas pro-inflamatórias durante o estabelecimento da CBM experimental. Sequenciamento de alto desempenho do RNA (RNA-seq) de macrófagos recém-migrados para o peritônio em co-cultivo com conídios ou células muriformes do fungo mostraram que a interação com células muriformes, mas não com conídios, acarreta em intensa regulação positiva de genes relacionados com a resposta inflamatória do hospedeiro repercutindo em alta produção de citocinas pró-inflamatórias, de modo que o estabelecimento de inflamação exacerbada foi correlacionado com a persistência do fungo na lesão. Mecanismos efetores e a expressão de genes importantes na ativação da resposta imune adaptativa estão inibidos na interação com as formas do fungo. Análise das subpopulações de linfócitos T no linfonodo drenante e no sítio de infecção no curso da CBM murina experimental por citometria de fluxo mostraram polarização de linfócitos T com perfil regulatório no linfonodo poplíteo ao passo que no coxim plantar foi observada a predominância de Th17 nos estágios iniciais da doença, sendo sucedida por uma polarização Th1 nos estágios mais tardios, relacionados com a remissão da doença. Ensaios in vivo de neutralização de IL-17A e IFN-γ obstaram o processo de eliminação do fungo no curso da doença. De modo semelhante, animais dectina-2 KO, os quais apresentaram redução na população de Th17 no curso da doença, mostrou redução da carga fúngica prejudicada nos primeiros 15 dias de infecção sem, contudo, afetar a resolução da doença. Por fim, depleção in vivo de células CD25+, a qual leva à redução de células Treg presentes no linfodo drenante, repercutiu em maior redução da carga fúngica nos primeiros 15 dias de infecção, todavia se opos ao processo de remissão da doença observada no modelo experimental murino. Assim, de modo geral, o presente trabalho traz novos elementos na compreensão da imunopatologia da doença, de forma que trabalhos futuros envolvendo a imunomodulação da resposta do hospedeiro para aquela mais efetiva pode representar uma estratégia promissora no tratamento, não só da CBM, como das demais micoses. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chromoblastomycosis (CBM) is a chronic worldwide subcutaneous mycosis, caused by several dimorphic, pigmented dematiaceous fungi. Patients with the disease are still considered as therapeutic challenge, mainly because of its recalcitrant nature. Due to fungal persistence in the tissue and lesions chronicity, the immune system activation in the host is highly relevant in this mycosis. After infection with different Fonsecaea pedrosoi fungal forms alone (conidia, hyphae and muriform cells), it was observed distinct manifestations of experimental murine CBM so that infection with muriformes cells promoted the establishment of longer lasting disease compared to infection with other fungal forms. Moreover, the presence of hyphae and especially muriformes cells in skin lesions, but no conidia, is related with high production of pro-inflammatory cytokines during the establishment of experimental CBM. High throughput RNA sequencing (RNA-seq) of Thioglycollate-elicited peritoneal macrophages co-cultivated with conidia or muriformes fungal cells showed that the interaction with muriformes cells, but not with conidia, results in strong upregulation of genes related to inflammatory response leading to a high production of proinflammatory cytokines, while exacerbated inflammation was correlated with the persistence of the fungus on the lesion. Effector mechanisms and the expression of genes important to adaptive immune response activation are inhibited in the interaction with the fungal cells. Analysis of T lymphocyte subpopulations in draining lymph node and in the site of infection during the course of experimental CBM by flow cytometry showed polarization of T lymphocytes with regulatory status in the popliteal lymph node while in the footpad was observed predominance of Th17 in the early stages of disease, being succeeded by Th1 popularization in the later stages, which is associated with disease remission. In vivo analysis with IL-17A and IFN-γ neutralization hindered fungal cell elimination in the course of the disease. Similarly, dectin-2 KO animals, Th17 contraction in the course of the disease showed fungal burden impairment in the first 15 days of infection, but did not affected the disease resolution. Finally, in vivo depletion of CD25+ cells, which leads to reduction of Treg cells in the draining lymph node, reflected in greater reduction in fungal burden in the first 15 days of infection, however it opposes to disease remission observed in the experimental CBM. Thus, in general, this study brings new elements in the understanding of the immunopathology of CBM, so that future work involving immunomodulation of the host response to a more effective pattern can represent a promising strategy for the treatment, not only of CBM, but to other mycoses as well.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-08-14T11:27:23Z No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-08-14T11:58:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-14T11:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / As infecções fúngicas invasivas configuram um problema grave de saúde pública, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Mais de 90% de todas as mortes relacionadas com fungos procedem de espécies que pertencem aos gêneros: Cryptococcus, Candida, Aspergillus e Pneumocystis. A Criptococose é causada pelo fungo encapsulado Cryptococcus neoformans, que causa doença pulmonar e pode-se espalhar amplamente no cérebro e pele; afeta cerca de um milhão de pessoas anualmente e mata cerca de 650.000. A virulência desse fungo é mediada por vários fatores, como a presença de uma cápsula polissacarídica anti-fagocítica e a indução de enzimas antioxidantes tais como peroxidases e catalases. Estes mecanismos antioxidantes de defesa se mostram importantes, não só para a resistência às espécies reativas, mas também para a sobrevivência em hospedeiros mamíferos. Estas enzimas antioxidantes, importantes para a virulência, podem servir como alvos excelentes para a terapia antifúngica. O gene TRR1 é essencial em C. neoformans e, codifica para a enzima citoplasmática tioredoxina redutase. Esta proteína tem um papel importante na manutenção redox da célula e é parte do complexo chamado sistema tioredoxina, no qual participam a tioredoxina (Trx), tioredoxina redutase (Trr) e NADPH, protegendo as células contra o estresse oxidativo e nitrosativo. Algumas drogas estão disponíveis para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas ou superficiais, contudo, existe apenas um número limitado de agentes antifúngicos eficazes (anfotericina B e o fluconazol para tratar a criptococose), muitos deles com efeitos secundários tóxicos e indesejáveis. Além disso, a resistência aos antifúngicos representa uma limitação nas atuais terapias utilizadas, demonstrando uma necessidade urgente de uma nova geração de agentes antifúngicos. No presente trabalho, a expressão heteróloga, purificação e caracterização enzimática de Trr1 e seu substrato Trx1 do fungo patogênico C. neoformans foram realizados. Os genes TRR1 e TRX1 de C. neoformans (H99) foram expressos em Escherichia coli via estratégia recombinante. Os fragmentos gênicos foram obtidos por meio da montagem de genes sintéticos inseridos no vetor pET21a para a produção como proteínas de fusão na forma solúvel. Os produtos expressos foram purificados por cromatografia de afinidade em coluna de níquel e detecção por western-blot e foi possível identificar uma banda de ̴ 39 kDa e outra de ̴ 12 kDa, correspondentes às proteínas recombinantes Trr1 e Trx1. A análise de atividade enzimática da proteína Trr1 recombinante foi realizada por ensaios de cinética enzimática. Os parâmetros cinéticos Vmáx e Km foram determinados variando a concentração de Trx1 de 0.25 μM até 15 μM. Como resultado a velocidade de reação foi aumentando gradualmente à medida que a concentração xiv de substrato crescia, mostrando assim a capacidade da Trr1 em reduzir Trx1. Este trabalho possibilitou a produção das proteínas recombinantes com atividades biológicas esperadas, proporcionando quantidades necessárias para a realização de estudos estruturais tridimensionais (3D). Como resultado preliminar foi identificado o crescimento dos cristais para a proteína recombinante Trx1 de C. neoformans, em presencia do agente precipitante sulfato de amônio 2 M pelo método de difusão de vapor em gota sentada. A partir do refinamento das condições será possível encontrar uma solução ideal para a difração dos cristais de cada proteína. Diante dos resultados obtidos pelo nosso grupo, na proposta maior do projeto principal: “Pós-genoma de fungos patogênicos humanos visando o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas”, este trabalho encontra-se inserido nesta linha de pesquisa para a obtenção de novas moléculas candidatas que inibam a atividade da proteína tioredoxina redutase, especificamente na viabilidade do fungo patogênico C. neoformans. Embora estas moléculas tenham sido selecionadas por varredura virtual de quimiotecas, uma metodologia in silico, os resultados in vitro feitos previamente em nosso grupo já apontaram o potencial destas moléculas como antifúngicos para o gênero Paracoccidioides spp. Em parceria com pesquisadores da França foi predita a estrutura da proteína Trr1 de C. neoformans por modelagem molecular por homologia. A partir da varredura virtual de quimiotecas foram selecionadas 4 moléculas inibitórias do banco Life Chemicals que interagem com os modelos de Trr1 obtidos para C. neoformans (Anexo). Os testes in vitro para validar tais inibidores potenciais estão sendo realizados em nosso laboratório, com intuito de desenvolver novas drogas para o tratamento de infecções fúngicas de relevância mundial, e gerar informações básicas da estrutura e função desta proteína. / Invasive fungal infections constitute a major public health problem, especially in immunocompromised patients. Over 90% of all deaths related to fungi come from species belonging to the genera Cryptococcus, Candida, Aspergillus and Pneumocystis. Cryptococcosis is caused by Cryptococcus neoformans, an encapsulated fungus that causes lung disease and can spread widely in the brain and skin, affects about one million people each year and kills about 650,000. The virulence of this fungus is mediated by several factors such as the presence of an anti-phagocytic polysaccharide capsule, and the induction of antioxidant enzymes such as peroxidases and catalases. These antioxidant defense mechanisms have been shown to be important not only for resistance to reactive species but also for survival in the mammalian host. These antioxidant enzymes important for virulence may serve as excellent targets for antifungal therapy. The TRR1 gene is essential and encodes the cytoplasmic thioredoxin reductase enzyme. This protein has a role in maintaining the redox balance of the cell and forms part of a complex called thioredoxin system, which contains thioredoxin (Trx), thioredoxin reductase (Trr) and NADPH, protecting cells against oxidative and nitrosative stress. Some drugs to treat systemic and superficial fungal infections are available; however, there is only a limited number of effective antifungal agents (amphotericin B and fluconazole to treat cryptococcosis) many of them are toxic and present undesirable secondary effects. Furthermore, drug resistance is a limitation on current therapy used, demonstrating an urgent need for a new generation of antifungal agents. In this study, heterologous expression, purification and enzymatic characterization of Trr1 and its substrate Trx1 of the fungal pathogen C. neoformans were performed. The TRX1 and TRR1 genes of C. neoformans (H99) were expressed in Escherichia coli using recombinant strategy. The gene fragments were obtained by assembling synthetic genes and these were inserted into pET21a vector for production as fusion proteins in soluble form. The expressed products were purified by affinity chromatography on nickel column and detected by western blot. It was possible to identify a band of ̴ 39 kDa and another of ̴ 12 kDa corresponding recombinant proteins Trr1 and Trx1. The enzymatic activity of the recombinant protein Trr1 was confirmed by assays of enzyme kinetics. The kinetic parameters Km and Vmáx were determined by varying the Trx1 concentration of 0.25 μM to 15 μM. As a result the reaction rate was gradually increased as the substrate concentration, showing the ability of Trr1 to reduce Trx1. In conclusion, this work shows a viable system for the production of recombinant proteins providing amount necessary to perform three-dimensional structural studies (3D). As a preliminary result crystal xvi growth for recombinant protein, Trx1 of C. neoformans was identified in the presence of sulfate 2M as the precipitant agent. From the refinement of the conditions will be possible to find an ideal solution for diffraction of crystals of each protein. Considering the results obtained by our group, most of the main project proposal: "Post-genome of human pathogenic fungi aiming the development of new antifungal drugs," this work is inserted in this line of research for obtaining new candidate molecules that inhibit the activity of thioredoxin reductase protein, specifically on the viability of the pathogenic fungus C. neoformans. Although these molecules have been selected for virtual screening library, a methodology in silico, in vitro results previously made in our group have pointed out the potential of these molecules as antifungal in the Paracoccidioides genus. In collaboration with researchers from France, the structure of the protein Trr1 of C. neoformans was predicted by molecular homology modeling. From the virtual screening library, four inhibitory molecules that interact with the Trr1 models obtained for C. neoformans were selected from Life Chemicals database (Appendix). Currently in vitro tests to validate these potential inhibitors are being carried out in our laboratory, aiming at developing new drugs for the treatment of fungal infections of global significance, and generating basic information on the structure and function of this protein.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-03-09T17:23:42Z No. of bitstreams: 1 2014_TaynáCristinadosSantos_Parcial.pdf: 1534538 bytes, checksum: f7c389f5eed641be4941edcc4bfa3c82 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-03-13T20:11:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_TaynáCristinadosSantos_Parcial.pdf: 1534538 bytes, checksum: f7c389f5eed641be4941edcc4bfa3c82 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T20:11:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_TaynáCristinadosSantos_Parcial.pdf: 1534538 bytes, checksum: f7c389f5eed641be4941edcc4bfa3c82 (MD5) / O fungo basidiomiceto Cryptococcus neoformans se trata de um patógeno oportunista, que geralmente acomete pacientes imunodeprimidos ou imunossuprimidos, causando a criptocococose. Esta doença é cosmopolita e pode ser fatal se não tratada. Os genes velvet VEA e VELC codificam uma família de proteínas conservadas em ascomicetos e basidiomicietos, tais proteínas foram descobertas em meados de 1960 em Aspergillus nidulans, onde foi descoberto o primeiro gene velvet, VEA. Os fenótipos apresentados por mutantes de VEA são os mais diversos nos fungos filamentosos nos quais esse gene foi estudado, sendo que os principais observados foram defeitos na parede celular e no desenvolvimento sexual, redução da produção de micotoxinas e da virulência. Assim, VEA é um fator transcricional conservado que regula diferentes respostas aos estímulos ambientais. Mais recentemente, foi descoberto o gene VELC e o mesmo foi recentemente caracterizado em Aspergillus nidulans, A. fumigatus e Fusarium oxysporum. Os fenótipos resultantes da deleção de VELC são sutis e indicam que o mesmo é um regulador positivo do desenvolvimento sexual. A análise in silico de VEA e VELC de C. neoformans revela que esses genes são conservados. Foi realizada a construção dos cassetes de deleção para cada um dos genes, que foram transformados separadamente em células haploides de KN99a/α por meio de biobalística para a obtenção dos mutantes veAΔ e velCΔ de C. neoformans. Os genes foram reconstituídos para a confirmação do fenótipo observado. Não foram observadas diferenças de veAαΔ e velCαΔ sobre os fatores de virulência clássicos de C. neoformans quando comparados com a cepa selvagem (KN99α), porém os mutantes veAΔ apresentaram o fenótipo de hiperfilamentação quando submetidos ao acasalamento e insensibilidade à luz branca nas mesmas condições. Entretanto, os mutantes velCΔ não apresentaram alteração no acasalamento, exceto, uma leve insensibilidade à luz branca nesta condição. A fim de verificar as interações entre as proteínas velvets de C. neoformans, experimentos de duplo-híbrido estão sendo conduzidos em Saccharomyces cerevisiae a fim de verificar as interações entre os velvets de C. neoformans. Os resultados obtidos indicam que VEA e VELC agem como reguladores negativos do desenvolvimento sexual em C. neoformans não afetando os principais fatores de virulência deste patógeno. Os dados deste trabalho são o início para o esclarecimento dos papéis de VEA e VELC na biologia de C. neoformans. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The basidiomycete fungus Cryptococcus neoformans is an opportunistic organism which commonly infects immunocompromised patients causing cryptococcosis. This is a comospolite disease and can be fatal if untreated. VEA and VELC genes codifies the conserved family of velvet proteins and this family is conserved in ascomycetes and basidiomycetes, such proteins were characterized in the mid 1960’s in Aspergillus nidulans, when VEA was discovered. VEA null mutants phenotypes display defects in sexual development and decreased production of mycotoxins in the filamentous fungi in which this gene was studied. VEA null mutants show cell wall defects and reduced virulence, indicating that VEA is a conserved transcriptional factor that regulates many responses to environmental cues. More recently, VELC was characterized in Aspergillus nidulans, A. fumigatus and Fusarium oxysporum. The phenotypes of the VELC null mutants are subtle and indicate that this gene is a positive regulator of sexual development. In silico analysis shows that both genes are conserved in C. neoformans. Deletion cassettes were constructed for each gene and separately transformed in KN99a/α haploid yeasts to obtain veAΔ and velCΔ strains. Then, the strains were complemented with the wild-type gene to confirm the phenotype. No differences were found in veAαΔ and velCαΔ on classical virulence factors of C. neoformans when compared to the wild-type strain (KN99α), but the veAΔ mutants showed hiperfilamentation when mating was performed in the dark and insensibility to white light when crossed. However, velCΔ crosses showed a slight insensitivity to white light. In order to identify the interactions among the velvets of C. neoformans, yeast two-hybrid assays are being conducted in Saccharomyces cerevisiae due to verify the protein-protein interactions between C. neeoformans velvet proteins. The results indicate that VEA and VELC act as negative regulators of sexual development in C. neoformans not affecting the main virulence traits of this pathogen. Data from this work are beginning to clarify the roles of VEA and VELC on the biology of C. neoformans.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-29T14:35:46Z No. of bitstreams: 1 2015_AnaCarolinadeOliveiraRamalho_Parcial.pdf: 8063331 bytes, checksum: c003ccb92b9e67879823f53d6b4c2b0e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-06-29T15:49:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AnaCarolinadeOliveiraRamalho_Parcial.pdf: 8063331 bytes, checksum: c003ccb92b9e67879823f53d6b4c2b0e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-29T15:49:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AnaCarolinadeOliveiraRamalho_Parcial.pdf: 8063331 bytes, checksum: c003ccb92b9e67879823f53d6b4c2b0e (MD5) / Quitridiomicose é uma doença infecciosa emergente causada pelo fungo quitrídeo Batrachochytrium dendrobatidis e é responsável por declínios em populações de anfíbios em diversos lugares do mundo. O presente trabalho reporta o primeiro registro do fungo B. dendrobatidis em anfíbios de vida livre do Cerrado do Brasil Central e investiga a influência das características ecológicas das espécies e suas relações de parentesco nos parâmetros de infecção, em uma comunidade de anuros do Cerrado. Uma hipótese filogenética foi usada para testar a presença de sinal filogenético nesses parâmetros. Não foi detectada influência das distâncias filogenéticas sobre os parâmetros de infecção. Por outro lado, o tamanho e o peso corporal, o local de desova, o tipo de ninho, o modo reprodutivo e o índice aquático foram importantes preditores na prevalência e intensidade da quitridiomicose. A proximidade com a água parece ser um ponto chave na susceptibilidade dos anfíbios à infecção e as altas temperaturas do Cerrado e o período de baixa precipitação podem atuar como fatores limitantes ao desenvolvimento do fungo. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chytridiomycosis is an emergent infectious disease caused by the chyrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis and is responsible for worldwide declines of amphibian populations. The current work reports the first record of B. dendrobatidis in free-living amphibians from Brazilian Cerrado and investigates the role of species traits and their phylogenetic relationships on infection parameters, in an anuran community in the Cerrado. An ensemble phylogenetic hypothesis was used to test for phylogenetic signal in these parameters. We found no influence of phylogenetic distances upon infection parameters. Conversely, body size and weight, spawning site, type of nest, reproductive mode and the aquatic index were important predictors of the prevalence and intensity of chytridiomycosis. The association with water seems to be a key point in the susceptibility of amphibians to infection and the high temperatures of the Cerrado and the period of low rainfall can act as limiting factors to the development of the fungus.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-07T12:19:44Z No. of bitstreams: 1 2017_MarceloHenriqueLisboaRennó.pdf: 483930 bytes, checksum: f71ab1a98d720224cd9ea980b3bfce6c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-12T19:02:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MarceloHenriqueLisboaRennó.pdf: 483930 bytes, checksum: f71ab1a98d720224cd9ea980b3bfce6c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-12T19:02:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MarceloHenriqueLisboaRennó.pdf: 483930 bytes, checksum: f71ab1a98d720224cd9ea980b3bfce6c (MD5) Previous issue date: 2017-09-12 / A incidência de doenças na cultura do algodoeiro tem restringido o aumento em produtividade em todas as regiões produtoras no Brasil. Dentre elas a Mancha de ramulária é a principal doença foliar do algodoeiro do Brasil. Com a expansão das áreas cultivadas para o Cerrado, a doença passou a se manifestar mais cedo provocando desfolha prematura, e consequentemente, a redução do potencial produtivo. O agente causal é tradicionalmente identificado como Ramularia areola, mas trabalhos recentes, com pouca representação de isolados nacionais transferiram o agente causal para Ramulariopsis pseudoglycines. Entretanto, uma amostragem representativa das populações brasileiras de R. areola ainda não foi estudada frente a esta classificação, para confirmar a identidade do agente causal no país. Além disso, a introdução recente de genótipos suscetíveis de algodão de origem australiana e americana, onde a doença é menos importante, tem levado a diversos surtos epidêmicos. O uso de defensivos químicos tem sido a principal forma de controle dessa doença, mas acarreta prejuízos ambientais. Além disso, aplicações intensivas de fungicidas podem induzir a seleção e prevalência de populações do patógeno resistentes aos princípios ativos mais empregados. A utilização de variedades resistentes é uma excelente alternativa de manejo, mas também induzem mudanças na composição da população do patógeno para superação de resistência do hospedeiro. O conhecimento das populações do patógeno predominantes em cada região produtora é fundamental para que os programas de melhoramento desenvolvam cultivares com resistência ampla e durável. Com base na ramificação dos conidióforos a partir da base o agente causal da doença foi transferido de Ramularia areola, para Ramulariopsis gossypii. Recentemente estudos moleculares revelaram a existência de uma nova espécie (Ramulariopsis pseudoglycines) associada com a mancha de ramulária. Adicionalmente, é possível que essa doença seja causada por um complexo de espécies, como descrito em outros patossistemas. Portanto uma amostragem representativa das populações brasileiras de Ramulariopsis spp. é fundamental para a identificação precisa do patógeno e consequentemente para o controle eficiente da doença. Diante disso esse trabalho teve como objetivos verificar a espécie predominante de Ramulariopsis que ocorre nas principais regiões produtoras de algodão no Brasil e avaliar isolados representantes de cada região, quanto a parâmetros epidemiológicos do patossistema algodão-ramularia. A caracterização molecular de 93 isolados representativos das principais regiões produtoras de algodão no país, revelou que todos os espécimes pertenceram a R. pseudoglycines. Nos ensaios de avaliação dos parâmetros epidemiológicos com cinco isolados, em condições controladas, os isolados do Mato Grosso do Sul e Mato Grosso causaram maiores incidência e severidade agressivos na cultivar susceptível cv. FM 975WS que os isolados do Maranhão, Bahia e Goiás. Além disso, o período de incubação dos isolados mais agressivos foi cinco dias menor que o dos isolados menos agressivos na cultivar susceptível. Quando avaliados na cultivar resistente cv. BRS 372 não foi superada por todos os isolados testados, com menores índices de doença. As cvs. TMG 47B2RF e DP 1648B2RF não apresentaram sintomas quando inoculados com quaisquer dos cinco isolados testados. / Incidence of cotton diseases restricts increases of crop yield in all Brazilian producing regions. Among these diseases, the Ramularia leaf spot is the most important foliar disease in cotton in Brazil. Due to the expansion of cultivated areas to the Cerrado region, the disease now arises earlier, causing premature defoliation and, consequently, reduction in yield. Causal agente is traditionally referred to as Ramularia areola, but recente work, with few representatives of Brazilian isolates transferred the causal agent to Ramulariopsis pseudoglycines. So far, a representative study of Brazilian R. areola isolates has not been undertaken. In addition, the recent introduction of cotton susceptible genotypes from Australia and the United States, where the disease is less important, has been associated to several epidemic outbreaks. Nowadays, the use of pesticides is the most important control strategy of this disease, but intensive use of chemicals lead to environmental risks. However, intensive sprayings of fungicides may lead to resistant pathogen populations. The use of resistant varieties is an excellent management alternative due to its high efficiency and low environment impact, but reliance on major host resistance genes also pressures pathogen population towards resistance breakdown. Understanding the mechanisms of resistance and the variability of the pathogen populations in co-evolution with the plant host are essential for breeding programs focused on developing resistant cultivars. Based on the ramification of the conidiophores, the causal agent of ramularia leaf spot was transferred from Ramularia aerola para Ramulariopsis gossypii, and recently, molecular characterization revealed still another entity associated to ramularia leaf spot, Ramulariopsis pseudoglycines. Additionally, it is possible that the disease is caused by a complex of species, as it has been described in other pathosystems. Thus, a study of a representative sample of the Brazilian populations Ramulariopsis spp. is fundamental for the precise identification of the pathogen and for the efficient disease management. Therefore, this work aimed to identifying the predominant species of Ramulariopsis occurring in the Brazilian cotton growing regions and to evaluate representative isolates of each locality as to epidemiological parameters of the cotton-ramularia pathosystem. Molecular characterization of 93 isolate representative of the main Brazilian cotton growing regions showed that all specimens belonged to R. pseudoglycines. In the assays for evaluation of epidemiological parameters, with five isolates, in controlled conditions, representatives of the states of Mato Grosso do Sul and Mato Grosso caused higher disease incidence and severity in the susceptible cv. FM 975WS than the isolates from the states Maranhão, Bahia and Goiás. Furthermore, period of incubation of the most aggressive isolates was five days shorter than the ones of the least aggressive isolates in the susceptible cultivar. When tested against the resistant cultivar BRS 372, resistance was overcame by all isolates, albeit with lower disease levels. Cultivars TMG 47B2RF and DP 1648B2RF did not show any disease symptoms when inoculated with any one of the five isolates studied.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós–Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-03-11T15:16:39Z No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-03-18T13:36:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-18T13:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / O fungo dimórfico Paracoccidioides é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma doença adquirida pela inalação de conídios ou fragmentos de micélio que transitam para a fase patogênica, leveduriforme, nos pulmões do hospedeiro. Após a infecção, a sobrevivência do fungo depende da evasão do sistema imune e adaptação ao ambiente hostil do hospedeiro. Macrófagos alveolares são a primeira linha de defesa contra Paracoccidioides e para conter a infecção essas células produzem várias substâncias nocivas como o peróxido de hidrogênio (H2O2) que desencadeia o estresse oxidativo. Para investigar os efeitos que H2O2 causa no proteoma de Paracoccidiodes, foi utilizada a técnica de eletroforese em gel bidimensional (2-DE) para analisar as proteínas diferencialmente expressas durante a resposta inicial (2 h) e tardia (6 h) ao H2O2. A análise 2-DE revelou um total de 179 proteínas/spots diferencialmente expressos (116 spots com expressão aumentada e 63 com expressão diminuída). As proteínas/spots diferencialmente expressas foram submetidas à identificação por meio da espectrometria de massas e submissão da massa monoisotópica dos peptídeos ao banco de dados do NCBI. Todos os spots/proteínas foram identificados com sucesso e agrupados de acordo com a categoria funcional - FunCat2. Resgate, defesa e virulência celular, metabolismo e energia foram as categorias com as maiores freqüências de proteínas/isoformas. Várias enzimas antioxidantes, como catalase, superóxido dismutase, peroxidases e tioredoxinas foram identificadas, bem como outras oxidoredutases que estão provavelmente envolvidas na resposta contra o estresse oxidativo. O perfil metabólico foi caracterizado, verificando-se ativação da via das pentoses fosfato, uma importante fonte geradora de NADPH celular. No intuito de confirmar os dados proteômicos, ensaios confirmatórios de atividade enzimática, citometria de fluxo e análises dos níveis transcricionais e de NADPH foram realizados e se mostraram concordantes com os dados obtidos na análise proteômica. Os resultados sugerem que Paracoccidioides possui um amplo repertório antioxidante, composto por diferentes proteínas que atuam de maneira complementar, que foram capazes de detoxificar as EROs e de minimizar os efeitos causados pelo estresse oxidativo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis, a disease acquired by inhalation of infective airborne conidia or mycelia fragments that transit to the pathogenic yeast phase in the host lungs. Upon infection, fungal survival depends on evasion from the immune system and adaptation to the host environment. Alveolar macrophages are the first defense cells line against Paracoccidioides and aiming to restrict the fungal infection, macrophages produce several harmful substances, such as hydrogen peroxide (H2O2) that triggers oxidative stress. To investigate the effect of H2O2 on the proteome of Paracoccidiodes, we used a large scale 2-DE protein gel electrophoresis approach to analyze differentially expressed proteins that were detected in early (2 h) and in late (6 h) H2O2-treatments. The 2-DE analysis revealed a total 179 spots differentially expressed (116 proteins spots with increased expression and 63 with decreased expression). Differentially expressed proteins were subjected to identification by mass spectrometry and by submi tting the monoisotopic mass of the peptides to the NCBI non reduntand database. All spots were successfully identified and they were grouped according the functional category - FunCat2. Cell rescue, defense and virulence, metabolism and energy were the categories that showed the most number of occurrences of the proteins/isoforms. Several antioxidant enzymes, such as catalase, superoxide dismutase, peroxidases and thioredoxins were identified, as well as others oxidoreductases putatively involved with defense against oxidative stress. A view of the metabolic cell profile depicted an activation of the pentose phosphate pathway, a great source of cellular reducing power in the form of NADPH. Confirmatory assays of enzymatic activity, flow cytometry, transcript levels and NADPH measurements, produced data in agreement with proteomic analysis. The results indicated that Paracoccidioides has several antioxidant systems, including various proteins that complementarlly were able to detoxified ROS and minimized the damage triggered by oxidative stress.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-09-29T15:27:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoFenotipicaIsolados.pdf: 1039438 bytes, checksum: 3c6c87cbf938c2196c47c8af4a7fe355 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-10-02T16:49:44Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoFenotipicaIsolados.pdf: 1039438 bytes, checksum: 3c6c87cbf938c2196c47c8af4a7fe355 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-02T16:49:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoFenotipicaIsolados.pdf: 1039438 bytes, checksum: 3c6c87cbf938c2196c47c8af4a7fe355 (MD5) Previous issue date: 2005-02-25 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cryptococcus neoformans foi descrito como patógeno humano em 1894. Desde então, estudos abrangendo aspectos da biologia, taxonomia, ecologia e epidemiologia do fungo , vêm se desenvolvendo com significante importância para a medicina e para o meio ambiente. O fungo foi recentemente classificado em duas espécies distintas, C. neoformans (sorotipo A, D e AD) e C. gattii (sorotipos B e C), cada uma com características morfológicas e genéticas bem definidas, assim como seus aspectos ecológicos e epidemiológicos. C. neoformans acomete principalmente indivíduos imunocomprometidos, especialmente aqueles infectados pelo HIV, enquanto C. gattii infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, atingindo todas as faixas etárias. Os fatores principais que determinam a patogênese da criptococose são relacionados com a situação de defesa do hospedeiro, o tamanho do inóculo e a virulência da cepa, sendo este último determinado por quatro características principais: a cápsula polissacarídica, a produção de melanina, a diferença de tipos sexuados (MAT e MATa) e a termotolerância. O fungo possui ciclo de vida transitório entre formas leveduriformes haplóides e formas filamentosas dicarióticas. A reprodução sexuada envolve mistura de material genético de parentais que formam progênies contendo características genéticas de ambos. A forma sexuada pode ocorrer através de um processo conhecido como frutificação haplóide. As espécies são heterotálicas, com dois tipos sexuados MAT e MATa. Estudos de caracterização fenotípica, incluindo a identificação da espécie, sorotipo e tipo sexuado tem grande relevância para a condução de estudos mais aprofundados devido ao estreito relacionamento entre seus aspectos ecológicos variáveis e seu ciclo de desenvolvimento e multiplicação, especialmente para o Norte e Nordeste do Brasil, onde o sorotipo B destaca-se como principal agente de meningite fúngica em hospedeiros normais. Este trabalho utilizou a técnica do CGB para a análise metabólica (identificação da espécie), onde 28 cepas apresentaram resultado positivo, caracterizando C. gattii e duas apresentaram resultado negativo, caracterizando C. neoformans . Os resultados de sorotipagem, realizados através de teste de aglutinação revelaram 28 cepas do sorotipo B e duas do sorotipo A. A determinação do tipo sexuado foi realizada através de técnica de PCR e todas as amostras eram MAT. / Cryptococcus neoformans was described as human pathogen in 1894. Since then, studies about fungal aspects as biology, taxonomy, ecology and epidemiology have been developed with great importance to medicine and the environment. The fungus was recently classified in two separated species, C. neoformans (serotypes A, D and AD) and C. gattii (serotypes B and C) each one with well defined genetic and morphological features as well as ecology and epidemiology aspects. C. neoformans occurs mainly in immunocompromised hosts, especially those infected by HIV. In the other hand, C. gattii infects mainly immunocompetents individuals to all lifetimes. The main factors determining the cryptococcosys pathogenesis have relations with the host defenses state, the size of particle and strain virulence, this last for four main features: the polyssacharide capsule, the melanin production, the mating types (MAT and MATa) and thermotolerance. The fungus has a transitory life cycle between haploid yeast form and dykariotic filamentous forms. The sexual cycles includes a mixture of genetic parental genes that form progenies containing the genetic characteristics of both. The asexual cycle occurs through a process know as haploid fruiting. The species are heterothallic with two mating types MAT and MATa. Phenotypic characterization studies, including the species identification, serotype and mating type have a great importance for conductions of profound studies because of the close relation between the ecological variants features and its development cycle and multiplication, especially in Brazilian regions North and Northeast where serotype B is the most prevalent cause of meningitis in ordinary hosts. This work used the CGB techniques for methabolic analysis (species identification), where 28 strains were positive, characterizing C. gattii and two were negative, characterizing C. neoformans. The serotyping results, make among agglutination test reveals 28 strains of serotype B and two of serotype A. The mating type was realized by PCR technique and all strains were MAT.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2018. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: páginas 51, 52, 53, 55, 57 e anexos. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-30T18:16:15Z No. of bitstreams: 1 2018_EricaCristinaSilvaRego_PARCIAL.pdf: 2019467 bytes, checksum: 947f4fafb34f1929db0e14ebbcfd84ad (MD5) / Rejected by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br), reason: Boa tarde, Rejeitado a pedido do submetedor. on 2018-08-30T18:17:42Z (GMT) / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-30T18:23:27Z No. of bitstreams: 1 2018_EricaCristinaSilvaRego_PARCIAL.pdf: 2019467 bytes, checksum: 947f4fafb34f1929db0e14ebbcfd84ad (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-09-10T17:32:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_EricaCristinaSilvaRego_PARCIAL.pdf: 2019467 bytes, checksum: 947f4fafb34f1929db0e14ebbcfd84ad (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-10T17:32:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_EricaCristinaSilvaRego_PARCIAL.pdf: 2019467 bytes, checksum: 947f4fafb34f1929db0e14ebbcfd84ad (MD5) Previous issue date: 2018-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / A bananeira (Musa spp.) é uma das principais fontes de alimento do mundo. A banana é uma das frutas mais consumidas na maioria dos países tropicais e subtropicais, sendo componente básico da alimentação de mais de 400 milhões de pessoas. Um grande número de patógenos causam doenças na cultura da bananeira, dentre os principais agentes estão os vírus, bactérias, nematoides e fungos. Os fungos se destacam como um dos principais causadores de perdas na produção por causarem doenças como a Sigatoka-amarela, Sigatoka-negra, e Mal do Panamá. Pseudocercospora musae (Zimm.) Deighton é o agente causal da Sigatoka-amarela, e se destaca como a principal doença fúngica da bananeira. P. musae é um patógeno hemibiotrófico, e sua a infecção ocorre por meio dos estômatos. O objetivo geral desse trabalho é caracterizar os componentes moleculares presentes na interação M. acuminata – P. musae que exerçam possíveis papéis na defesa da planta frente à infecção. Desta forma foram validados nove pares de primers para oito genes de referência com o objetivo de normalizar a expressão gênica de genes alvos em RT-qPCR em Musa. Os genes utilizados foram Actina 1 (ACT1), Adenina Fosforibosil Transferase (APT), Fator de elongação 1 alfa (EF), Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase (GAPDH), Tubulina alfa (TUBA), GTP-Binding Nuclear Protein (RAN), Ubiquitina 1 (UBIQ1) e Ubiquitina 2 (UBIQ2). As análises demostraram que os genes mais estáveis foram Ubiquitina 2 e RAN. As análises de expressão diferencial de seis genes alvos por RT-qPCR demostraram que a maioria dos genes potencialmente envolvidos em processo de defesa não foram modulados. Foi realizado também sequenciamento Illumina de isolado de P. musae in vitro a fim de identificar os microRNAs (miRNAs) do fungo. Um total de 101 pré-miRNAs candidatos foram identificados, e os alvos potenciais desses miRNAs foram preditos usando a ferramenta psRNATarget, onde foram identificados um total de 381 genes alvos no genoma de Musa acuminata. Foi observado que alguns desses genes alvos tem papel potencial em resistência a estresse biótico, tais como, NBS-LRR, fatores de transcrição da superfamília WRKY, genes análogos em resistência (RGAs) tais como, RGA1 e RGA3, citocromo P450 e quinases. A identificação contínua de genes envolvidos em resposta ao estresse biótico em M. acuminata, junto com a caracterização de miRNAs no patógeno e seu papel na modulação de expressão gênica, contribuirão para o desenvolvimento de métodos de controle da doença Sigatoka-amarela. / Banana (Musa spp.) is one of the world's most important crops, and the most popular fruit in many tropical and subtropical countries. It is a staple food for millions of people throughout the developing world. Musa spp. are hosts to many infectious diseases caused bv a vast array of phytopathogenic fungi, bacteria, viruses, and nematodes. Fungal diseases may cause considerable yield losses in banana. They are responsible for diseases such as Yellow Sigatoka, Black Sigatoka, and Panama Disease. Pseudocercospora musae (Zimm.) Deighton is the causal agent of Yellow Sigatoka, and stands out as one of the main fungal diseases of banana. P. musae is a hemibiotrophic pathogen, and its´ infection occurs through the stomata. The aim of this study is to characterize molecular compounds of the interaction Musa acuminata - P. musae that may exert possible roles in defense of the plant against infection. Nine pairs of primers were validated for eight potential reference genes with the objective of enabling accurate normalization of gene expression of target genes in RT-qPCR for Musa. The genes used were Actin 1 (ACT1), Adenine phosphoribosyltransferase (APT), Elongation factor 1-alpha (EF), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Alpha-tubulin (TUBA), GTP-Binding Nuclear Protein (RAN), Ubiquitin 1 (UBIQ1) e Ubiquitin 2 (UBIQ2). The results showed that the most stable genes were Ubiquitin 2 and GTP-binding nuclear protein RAN. Differential expression analysis of six target genes demonstrated that most of the genes potentially involved in the defense process were not modulated. Illumina sequencing of P. musae in vitro was also carried out to identify microRNAs (miRNAs). A total of 101 candidate pre-miRNAs were identified, and potential gene targets of these miRNAs were predicted using psRNATarget. A total of 381 target genes in M. acuminata genome were identified. Some of these target genes are likely involved in resistance, such as NBS-LRRs, WRKY transcription factors, resistance gene analogs (RGAs) such as RGA1 and RGA3, cytochrome P450 and kinases. The continued characterization of resistance gene candidates in M. acuminata, together with the characterization of miRNAs in the pathogen and their role in gene expression modulation, will contribute towards the development of efficient methods for control of Yellow Sigatoka disease.