Le réseau vasculaire est composé non seulement des vaisseaux sanguins mais aussi des vaisseaux lymphatiques. Les premiers assurent l'approvisionnement des cellules en nutriments et oxygène et la récolte de leurs déchets métaboliques tandis que les seconds collectent les fluides, macromolécules et cellules immunitaires extravasés dans les tissus interstitiels pour les ramener à la circulation sanguine. Au cours de ces travaux de recherche, nous avons mis au point un substitut cutané reconstruit par génie tissulaire, contenant un réseau sanguin fonctionnel, exempt de toute matière exogène et potentiellement autologue. Ses applications cliniques sont particulièrement prometteuses puisque l'une des raisons majeures d'échec des greffes de peau sur les patients grands brûlés par exemple est la nécrose du greffon. Au cours d'une étude in vivo, nous avons démontré que le réseau contenu dans notre substitut cutané est fonctionnel, s'inoscule en moins de quatre jours avec le réseau vasculaire de l'hôte et qu'il apporte un avantage à la néovascularisation par rapport à un substitut non microvascularisé. Un substitut cutané microvascularisé tumoral a ensuite été développé pour étudier la biologie du mélanome. Notre modèle est particulièrement pertinent et complet pour ce type d'étude puisque les cellules cancéreuses interagissent avec les trois principaux types cellulaires du derme et de l'épidémie et évoluent au sein d'une matrice extracellulaire sécrétée par ces cellules. Ainsi, il a été vérifié que les cellules cancéreuses conservent le même type de comportement, tant au niveau du potentiel invasif que du potentiel pro-angiogénique, dans notre modèle tridimensionnel de peau qu'/« situ chez les patients. Les capillaires lymphatiques fournissent une voie privilégiée pour le processus métastatique de cancers comme les mélanomes, c'est pourquoi nous travaillons à ajouter un réseau lymphatique à notre substitut cutané microvascularisé. Jusque là, nous avons démontré que les cellules endothéliales lymphatiques s'organisent spontanément en réseau dans un substitut 3D de tissu conjonctif.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Les propriétés biomécaniques des tissus produits par génie tissulaire sont une des caractéristiques qui permet d'évaluer leur fonctionnalité. Ces propriétés peuvent dépendre, entre autres, de la méthode de fabrication utilisée lors de l'assemblage des tissus, du type de cellules utilisé lors de la reconstruction des tissus et des facteurs environnementaux cellulaires et tissulaires en présence lors de la culture des tissus. Dans le but de produire des tissus possédant des propriétés optimales pour d'éventuelles applications cliniques, il est important d'analyser et de comprendre le comportement biomécanique des tissus et de développer des méthodes de fabrication qui permettent de les produire de façon fiable et reproductible. L'objectif principal de cette thèse de doctorat était d'optimiser la fabrication des substituts vasculaires et cutanés reconstruits par la méthode d'auto-assemblage, par la compréhension de leur comportement biomécanique. Les travaux ont d'abord été dirigés vers le développement d'une nouvelle méthode de fabrication qui a permis d'augmenter l'efficacité de la production des substituts vasculaires et d'améliorer leurs propriétés mécaniques et viscoélastiques. Par la suite, des travaux ont été réalisés dans le but d'optimiser la production des substituts cutanés. Les résultats obtenus ont démontré qu'il était possible, par de nouvelles méthodes d'assemblage, d'augmenter la surface des substituts cutanés sans influencer leur structure ni leur contractilité. Un autre objectif poursuivi était de déterminer si l'utilisation de diverses sources cellulaires pouvait avoir une incidence sur les caractéristiques structurales et biomécaniques des substituts vasculaires. Ces travaux ont montré que les cellules artérielles et veineuses permettaient de produire des substituts vasculaires adéquats et que ceux produits à partir de cellules artérielles possédaient des propriétés mécaniques et élastiques supérieures à celles de tissus produits à partir de cellules veineuses. Dans le but de poursuivre l'optimisation de la fonctionnalité et des propriétés biomécaniques des tissus reconstruits, des méthodes permettant de stimuler mécaniquement les tissus pendant leur culture ont été développées. L'étude de la structure et des propriétés mécaniques des tissus résultant de cette culture dynamique a démontré une orientation axiale des composantes tissulaires, en plus d'une augmentation de la production des éléments de la matrice extracellulaire et d'une amélioration des propriétés mécaniques des tissus. En conclusion, le développement de ces nouvelles méthodes de fabrication a permis d'optimiser et de mieux définir certaines propriétés biomécaniques des substituts vasculaires et cutanés et a ainsi contribué à en améliorer leur fonctionnalité pour d'éventuelles applications cliniques.

Les brûlures profondes et étendues sont, de loin, le traumatisme le plus grave auquel un être humain peut faire face. La rapidité de couverture de ces plaies avec des pansements, surtout de nature biologique (p. ex. peau de cadavre), d’abord temporaire, et ensuite impérativement permanente, aura une influence déterminante sur le taux de survie des patients. À date, de nombreuses technologies ont été utilisées telles que les greffes pleines épaisseurs de peau provenant d’un site donneur sain, la culture d’épiderme autologue (CEA) et les substituts synthétiques. Cependant, ces technologies ont pour principale limite, respectivement, leur biodisponibilité, leur manque de propriété mécanique et leur manque d’activité biologique. Ces éléments ont ainsi mené au développement de substituts biologiquement actifs parmi lesquels les plus prometteurs possèderont une base autologue, l’épiderme, reposant sur une matrice, allogénique, xénogénique ou biosynthétique. Toutefois, la majorité de ces substituts ne pourra être utilisée que temporairement à cause de leur potentiel immunogénique résultant de la présence d’antigènes étrangers. Les technologies de production de substituts cutanés peuvent être divisées en deux approches distinctes, soit de type « Top-down », soit de type « Bottom-up ». La technologie la plus courante ainsi que la plus utilisée aujourd’hui est celle de type « Top-down ». Les substituts produits par cette approche se basent sur des matrices artificielles structurées élaborées via deux classes majeures de biomatériaux incluant (1) les biopolymères du sang comme la fibrine, et du tissu mou comme le collagène et la fibronectine ; (2) les polysaccharides, comme l’alginate, le chitosan et les glycosaminoglycanes, incluant le hyaluronan. L’approche de type « Bottom-up », quant à elle, se base sur la capacité des cellules à synthétiser et assembler leur propre matrice extracellulaire. Dans ce domaine, le laboratoire d’organogénèse expérimentale (LOEX) se positionne en tant que pionnier dans une méthode de production de substitut dite « d’auto-assemblage ». Cette méthode repose sur la capacité de l’acide ascorbique à promouvoir l’assemblage matriciel sécrété par les fibroblastes dermiques. Toutefois, les substituts obtenus par cette méthode présenteront (1) un temps de production long, car l’assemblage matriciel représentera à lui seul les 2/3 de la technique d’un total d’environ 8 à 9 semaines, (2) un manque de photoprotection de par l’absence de pigmentation, c’est à-dire sans ajout de cellules pigmentogènes (mélanocytes), et (3) peu ou pas de réseau de fibres élastiques, essentiel aux propriétés mécaniques cutanées. Afin de répondre aux problématiques identifiées, nous avons entrepris de concevoir plus rapidement des substituts cutanés pigmentés, intégrant un réseau de fibres élastiques selon la méthode d’autoassemblage. Pour ce faire, nous avons investigué la possibilité d’utiliser un derme reconstruit par « auto-assemblage » de type allogénique combiné à un épiderme syngénique. Cette modification au protocole qui implique initialement une reconstruction dermique et épidermique autologue à 100 % permettra d’éliminer l’étape de production dermique et ainsi réduire le temps global de production des substituts cutanés bilamellaires. L’esthétisme et la fonctionnalité des substituts ont été évalués par l’ajout de différentes densités de mélanocytes lors de la reconstruction de l’épiderme. Enfin, parallèlement à cette étude, nous avons investigué sur la faible présence du réseau de fibres élastiques dans nos substituts cutanés afin de proposer une technique de production modifiée permettant d’induire l’élastogenèse, le processus de formation de ce réseau. Plus spécifiquement, de l’aldostérone, une hormone minéralocorticoïde, et son inhibiteur compétitif, la spironolactone, ont été ajoutés dans le milieu de culture cellulaire en tout temps lors de la production des substituts cutanés afin de stimuler la voie de l’ « insulin-like growth factor I » (IGF-I) et ainsi l’élastogenèse. En résumé, mon projet de doctorat a permis de mettre en évidence : (1) la survie des fibroblastes allogéniques dermiques pour au moins huit semaines après greffes sur un modèle murin immunocompétent ; (2) qu’un seuil minimal de 200 mélanocytes par mm2 à la reconstruction de l’épiderme avait la capacité d’induire une pigmentation homogène après greffe, ainsi qu’une photoprotection comparable à une densité de 1500 mélanocytes par mm2 ; (3) que l’ajout d’aldostérone et de spironolactone augmente le nombre de fibres élastiques dans nos substituts cutanés et améliore les propriétés mécaniques par la diminution de la rétraction et l’augmentation de l’élasticité. De plus, l’ajout de mélanocytes a aussi permis d’améliorer les propriétés mécaniques des peaux reconstruites par leur effet positif encore mal compris sur l’élastogenèse. / Vast deep burns injuries are, by far, the worst trauma that a human being can experience. The time necessary for the coverage of thermal wounds with bandages, especially of a biological nature (e.g. cadaveric skin), at first temporary, and then permanently, influences the survival rate of patients. Over the years, numerous technologies were used to cover the skin wounds. Among them, we note split- and full-thickness skin grafts from a spared donor site, as well as cultured epithelial autografts (CEAs) and synthetic substitutes. However, these technologies showed some issues as the bioavailability of donor tissue or mechanical properties or biological activities. Indeed, it is the cellular and the extracellular matrix component that have a direct impact on the wound healing and on the longterm graft survival rate. In this way, new biologically active skin substitutes were developed. The most promising reconstructed skins to date are composed of an autologous epidermis associated with an extracellular matrix either allogeneic or xenogeneic or biosynthetic. However, the majority of these substitutes could only be used as temporary because of their immune inflammatory risk resulting from the presence of allogeneic or xenogeneic cells. Tissue-engineered technologies can be split in two approaches, either "Top-Down" or "Bottom-up". The most current as well as the most represented technology today is the "Top-Down" approach. Substitutes produced by this approach are based on structured artificial matrices developed via the major classes of biomaterials including (1) blood’s biopolymers such as fibrin, and components of the soft tissue such as collagen or fibronectin and (2) polysaccharides, as alginates, chitosan and glycosaminoglycan, including the hyaluronan. Alternatively, the "bottom-up" approach is based on the fibroblast’s capacity to synthesize and assemble their own extracellular matrix. In this field, the Laboratory of Organogenesis Experimental (LOEX) is a pioneer in a method of production of skin substitute called the "self-assembly" method. This method is based on the capacity of ascorbic acid to promote the extracellular matrix assembly secreted by fibroblasts. However, the histology and mechanical properties of these tissue-engineered skin substitutes, which are similar to native skin, (1) are quite long to produce, essentially because of the extracellular matrix assembly which takes twothird of the time of the whole production (2) lack of photoprotection, since pigment-producing cells called melanocytes are not added in the standard production and (3) the elastic fiber network, essential to insure their mechanical properties, is rudimentary. To address the identified problems, we designed a faster way to produce pigmented skin substitutes, integrating an elastic fiber network by tissue engineering according to the “self-assembly” method. To do so, we investigated the possibility of using an allogeneic reconstructed dermis associated with a syngeneic epidermis. This new method would allow eliminating two-third of the production time of the dermal part initially requested in the “on demand” production that was initially 100 % autologous. Estheticism and its functionality were evaluated by the addition of various densities of melanocytes during the epidermis reconstruction. Finally, at the same time, we addressed the weak presence of the elastic fiber network in our reconstructed skin. Indeed, we modified our production method to stimulate the elastogenesis process. More specifically, aldosterone, a mineralocorticoid hormone, and its competitive inhibitor, spironolactone, were added in the culture media during the skin substitute production in order to stimulate the insulin-like growth factor I (IGF-I) pathway and so the elastogenesis process. To conclude, my PhD project allowed to highlight: (1) the immunological tolerance of the allogeneic dermis with a long-term survival of their cellular components over the eight-week period, investigated in an immunocompetent murine model ; (2) that a minimal threshold of 200 melanocytes per mm2 in the epidermis reconstruction had the capacity to lead a homogeneous pigmentation after the transplant, as well as a photoprotection comparable to a 1500 melanocytes per mm2 density ; (3) that the addition of aldosterone and spironolactone increased the number of elastic fibers in our skin substitutes and improved the mechanical properties by the decrease of the shrinkage and the increase of the elasticity. Furthermore, the addition of melanocyte also increased the mechanical properties of the skin substitute. This positive impact on elastogenesis by melanocytes is poorly understood.

L'ulcère du pied diabétique (UPD), pathologie courante chez les patients diabétiques, est une plaie chronique qui peine à cicatriser et peut nécessiter l'amputation des membres inférieurs. Ainsi les patients diabétiques sont sujets à un nombre d'amputations 20 fois supérieur comparativement à des sujets sains. Notre hypothèse est qu'il est possible de modéliser différents aspects de cette pathologie en utilisant soit des cellules cutanées saines traitées avec du glyoxal, soit des cellules extraites de peaux de patients diabétiques. À ces fins, nous avons utilisé un biomatériau de collagène-chitosan pour produire deux modèles de cicatrisation et un tissu dermique endothélialisé. Le modèle de peau glyqué a été produit à partir de populations de fibroblastes et de kératinocytes isolées de prépuce. Les kératinocytes et les fibroblastes ont été ensemencés sur une éponge de collagène-chitosan. Après maturation de l'épiderme, les éponges ont été traitées avec du glyoxal pour simuler le diabète, de l'aminoguanidine qui est un inhibiteur de la glycation, ou les deux. Une plaie a ensuite été réalisée puis la réépithélialisation a été suivie pendant 8 jours. Nous avons alors observé une accumulation d'Advanced Glycation Endproducts (AGE), une perturbation de l'épiderme et une diminution des capacités de réépithélialisation dans les modèles glyqués. Ces effets ont été neutralisés par l'ajout d'aminoguanidine dans le milieu de culture. Le modèle de cicatrisation produit à partir de cellules de patients diabétiques de type 2 a été produit selon des méthodes similaires. Cependant, en parallèle ont été cultivés des feuillets de fibroblastes sains et diabétiques obtenus par autoassemblage pour permettre l'étude de l'état transcriptomique des cellules. Nous avons ainsi observé une désorganisation de l'épiderme et une diminution de la réépithélialisation. De plus, les données RNAseq indiquent une conservation d'un état transcriptomique correspondant au diabète en 3D, ce qui se traduit par la modulation de voies correspondant à l'inflammation, au métabolisme et à la régulation épigénétique. Enfin, nous avons développé un modèle de derme endothélialisé diabétique afin de reproduire le défaut d'angiogenèse des UPD. Les modèles ont été obtenus à partir de fibroblastes sains ou diabétiques et de cellules endothéliales microvasculaires saines transfectées pour produire de la GFP (Green Fluorescent Protein) et de la luciférase, ensemencés sur le biomatériau de collagène-chitosane. Nous avons alors quantifié le nombre de cellules endothéliales et le volume occupé par le réseau capillaire et ainsi observé une diminution des capacités du support angiogénique des fibroblastes diabétiques. Ceci était accompagné par une altération du profil sécrétoire de cytokines pro-angiogéniques dans les modèles. Pour conclure, nous avons réussi à produire deux modèles de cicatrisation et un tissu dermique capables de reproduire certaines caractéristiques d'un ulcère du pied diabétique afin de permettre le développement de nouveaux traitements pour l'UPD. / Diabetic foot ulcers (DFU), a common pathology in diabetic patients, are chronic wounds that fail to heal and may lead to the amputation of the lower limbs. Diabetic patients are 20 times more likely to undergo amputations than healthy subjects. Our main hypothesis is that it is possible to model different aspects of this pathology using either healthy skin cells treated with glyoxal or cells extracted from the skin of diabetic patients. To this end, we used a collagen-chitosan biomaterial to produce two wound healing models and an endothelialised dermal tissue. The glycated skin model was produced from populations of fibroblasts and keratinocytes isolated from foreskin. Keratinocytes and fibroblasts were seeded onto a collagen-chitosan sponge. Once the epidermis had matured, the sponges were treated with glyoxal to simulate diabetes, aminoguanidine, a glycation inhibitor, or both. A wound was then formed, and the re-epithelialization was monitored for 8 days. An accumulation of Advanced Glycation Endproducts (AGEs), a disruption of the epidermis and a reduction in the ability of glycated models to re-epithelialize were observed. These effects were neutralized by adding aminoguanidine to the culture medium. The wound healing model obtained from cells from type 2 diabetic patients was produced using similar methods. However, in parallel, sheets of healthy and diabetic fibroblasts obtained by the self-assembly approach were cultured in order to study the transcriptomic state of the cells. A disorganization of the epidermis and a reduction in re-epithelialization was then observed. In addition, RNAseq data indicated the conservation of a transcriptomic state corresponding to diabetes in 3D, resulting in the modulation of pathways corresponding to inflammation, metabolism and epigenetic regulation. Finally, we developed a model of diabetic endothelialized dermis in order to reproduce the angiogenesis defect of DFU. The models were obtained from healthy or diabetic fibroblasts and healthy microvascular endothelial cells transfected to produce GFP (Green Fluorescent Protein) and luciferase, seeded onto the collagen-chitosan biomaterial. The number of endothelial cells and the volume occupied by the capillary network was quantified and a reduction in the angiogenic support from diabetic fibroblasts was observed. This was accompanied by an alteration in the secretory profile of pro-angiogenic cytokines in the models. In conclusion, we have succeeded in producing two wound healing models and a dermal tissue capable of reproducing certain characteristics of a diabetic foot ulcer, with the aim of developing new treatments for DFU.

La disponibilité limitée de vaisseaux sanguins autologues pour les chirurgies vasculaires telles que le pontage coronarien ou périphérique et les performances cliniques insuffisantes des prothèses vasculaires pour le remplacement de vaisseaux sanguins de petit diamètre (Ø < 6 mm) justifie la recherche dans le domaine du génie tissulaire vasculaire. L’une des stratégies explorées – le génie tissulaire fonctionnel – vise à régénérer un vaisseau sanguin in vitro dans un environnement contrôlé appelé bioréacteur. L’objectif de cette thèse est de concevoir un bioréacteur à perfusion et de développer un système de contrôle pour ce bioréacteur afin d’interagir de manière dynamique avec une construction artérielle dans le but de guider et de stimuler la maturation de constructions artérielles. La principale question étudiée dans ce projet est de déterminer comment choisir les conditions de culture à l’intérieur d’un bioréacteur le plus efficacement possible. Deux grands enjeux ont été identifiés : d’abord, le besoin de comprendre les différents phénomènes physiques et biologiques qui se déroulent à l’intérieur du bioréacteur. Ensuite, la nécessité de diriger la régénération du tissu vasculaire. Une commande utilisant le concept de programmation génétique fut développé afin de modéliser en temps réel la régénération du tissu vasculaire. En utilisant les modèles générés, la commande recherche une stratégie optimale de culture (déformation circonférentielle, cisaillement longitudinal et fréquence du débit pulsé) en considérant un processus de décision Markovien résolu par programmation dynamique. Par simulation numérique, on montre que cette méthode a le potentiel de favoriser une croissance plus rapide et plus sécuritaire des tissus en culture et permet d’identifier plus efficacement les paramètres importants pour la croissance et le remodelage des constructions artérielles. La commande est capable de gérer des modèles de croissance non linéaires. Expérimentalement, le système développé permet de mieux comprendre l’évolution des propriétés mécaniques d’une construction artérielle dans un bioréacteur. / The limited availability of autologous blood vessels for bypass surgeries (coronary or peripheral) and the poor patency rate of vascular prosthesis for the replacement of small diameter vessels (Ø < 6 mm) motivate researches in the domain of vascular tissue engineering. One of the possible strategies named functional tissue engineering aims to regenerate a blood vessel in vitro in a controlled environment. The objective of this thesis is to design a perfusion bioreactor and develop a control system able to dynamically interact with a growing blood vessel in order to guide and stimulate the maturation of the vascular construct. The principal question addressed in this work is: How to choose culture conditions in a bioreactor in the most efficient way? Two main challenges have been identified: first, the need to develop a better comprehension of the physical and biological phenomenon occurring in bioreactors; second, the need to influence and optimize vascular tissue maturation. A controller based on the concept of genetic programming was developed for real-time modeling of vascular tissue regeneration. Using the produced models, the controller searches an optimal culture strategy (circumferential strain, longitudinal shear stress and frequency of the pulsed pressure signal) by the mean of a Markov decision process solved by dynamic programming. Numerical simulations showed that the method has the potential to improve growth, safety of the process, and information gathering. The controller is able to work with common nonlinearities in tissue growth. Experimental results show that the controller is able to identify important culture parameters for the growth and remodelling of tissue engineered blood vessels. Furthermore, this bioreactor represents an interesting tool to study the evolution of the mechanical properties of a vascular construct during maturation.

Malgré sa réputation d'être statique, le tissu osseux est un organe dynamique maintenu en équilibre sous les actions respectives des cellules résorbant l'os, les ostéoclastes, et les cellules formant l'os, les ostéoblastes. Les pathologies osseuses comme l'ostéoporose, découlent d'un débalancement entre la résorption et la formation osseuse. Ces maladies mènent à des diminutions nettes de la masse osseuse, à une augmentation de la fragilité du tissu et par conséquent à une perturbation de la qualité de vie chez les personnes atteintes. Les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) ont été identifiées comme d'intéressants candidats pour stimuler la régénération du tissu osseux. Les BMP-2 et -7 ont été approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) pour des applications orthopédiques spécifiques. Récemment, il a été démontré que la BMP-9 possédait un potentiel ostéogénique supérieur aux BMP-2 et -7 qui sont couramment utilisées en clinique. Toutefois, son effet sur l'ostéoclaste n'a jamais été caractérisé. À partir d'un modèle d'ostéoclastes obtenus à partir de sang de cordon ombilical, l'effet de la BMP-9 sur la différenciation ostéoclastique, la résorption osseuse et l'apoptose chez l'ostéoclaste a été étudié. La transduction du signal par la BMP-9 a été étudiée chez l'ostéoclaste. Les cultures d'ostéoclastes ayant atteint une différenciation terminale expriment les ARNm codant pour ALK-1, BMPR-IA, -IB et -II. La BMP-9 active la voie canonique des Smad chez l'ostéoclaste. Par une analyse de l'expression de marqueurs ostéoclastiques, il est observé que la BMP-9 ne module pas la formation des ostéoclastes. Pour l'étude sur la résorption osseuse, les précurseurs ostéoclastiques ont été cultivées sur des lamelles osseuses bovines. Il est observé que la BMP-9 ne module pas la résorption osseuse régulée par les ostéoclastes. L'apoptose des ostéoclastes a été étudiée par marquage TUNEL. Il est observé qu'en absence et présence des facteurs de survie, RANKL (Receptor activator of the nuclear factor KB ligand) et M-CSF (Macrophage colony stimulating factor), la BMP-9 à 50 et 150 ng.ml-1 protège les ostéoclastes de la mort cellulaire. Les mécanismes moléculaires de l'inhibition d'apoptose induite par la BMP-9 ont également été étudiés. La BMP-9 induit chez l'ostéoclaste une inhibition du clivage de la caspase-9 et non de la caspase-8, suggérant que celle-ci découle d'une diminution de l'activation de la voie intrinsèque de l'apoptose. Une étude de la modulation des homologues de la famille Bcl-2 a montré que la BMP-9 à 150 ng.ml-1 induit une diminution de l'expression de Bid, un homologue pro-apoptotique. Cette étude démontre pour la première fois les effets de la BMP-9 chez l'ostéoclaste humain. [Symboles non conformes]

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2014-2015 / La media vasculaire est au coeur des processus physiopathologiques qui entraînent le développement de l’athérosclérose. L’utilisation d’une media reconstruite par génie tissulaire permet d’étudier les cellules musculaires lisses (CML) humaines dans un environnement plus physiologique que les cellules en culture monocouche. Les travaux présentés dans cette thèse sont orientés autour de la media vasculaire reconstruite par génie tissulaire comme modèle d’étude pharmacologique et prothèse vasculaire autologue. La première partie des travaux porte sur l’étude des interactions de cette tunique avec les microparticules (MP) circulantes. D’abord, nous avons montré que la présence de l’adventice modifie la réponse de la media aux MP produites in vitro à partir des lymphocytes T. Ensuite, l’étude de l’effet des MP isolées du sérum de patients en choc septique sur la media humaine a démontré que ces MP sont en mesure d’augmenter la contraction de la media par un mécanisme impliquant une diminution du NO et une augmentation de l’expression de l’ARN messager de l’interleukine-10. L’incubation de la media reconstruite avec cette cytokine anti-inflammatoire bloque l’hyporéactivité induite par les lipopolysaccharides. Le même phénomène a été reproduit in vivo, chez le rongeur. Ces résultats suggèrent que les SMP auraient un effet protecteur sur la fonction vasculaire, en potentialisant la contraction de la media. Ensuite, nous avons optimisé l’approche de reconstruction de prothèses vasculaires par auto-assemblage proposée initialement pour l’adapter au contexte particulier des CML. L’objectif principal était de permettre l’étude physiopathologique de la media à partir de toutes les lignées de CML; indépendamment de leur capacité de synthèse de matrice extracellulaire. Pour ce faire, nous avons développé un échafaudage de matrice extracellulaire produit par auto-assemblage à partir de fibroblastes humains. L’utilisation de cet échafaudage génère une media plus résistante et plus contractile que la technique initiale. Enfin, une anisotropie a été créée dans cet échafaudage pour permettre une orientation physiologique des CML. La media reconstruite devient ainsi plus résistante et plus contractile. Ces améliorations permettent de reconstruire des media à partir des cellules de plus de patients et mèneront à des études pharmacologiques plus représentatives de la population. Cet échafaudage facilitera la translation clinique de ce modèle de media reconstruite par génie tissulaire. / The pathological processes that result in the development of atherosclerostic lesions take place in the vascular media layer. This condition is responsible for half of cardiovascular associated fatalities. The development of a tissue-engineered blood vessel can contribute to the in vitro study of the human media in a 3-dimensional environment. This blood vessel can also be used as a prosthesis for arterial bypasses. The work presented here focus on the reconstructed vascular media as a pharmacological model and a potential vascular substitute. The vascular media reconstructed by self-assembly was used to study the interactions between this layer and circulating microparticles (MPs). We demonstrated that the adventitia layer can influence the response of the media to T-Lymphocytes derived MPs. Next, we investigated the influence of MPs isolated from whole blood of septic shock patients (SMPs), on the human engineered media. This study demonstrated that the SMPs decrease nitric oxide (NO) production and increase interleukin-10 (IL-10) messenger RNA in the media layer. Incubation of reconstructed media with this anti-inflammatory cytokine blocks the hyporeactivity induced by lipopolysaccharides. This finding was confirmed in vivo, in rodents. Therefore, the elevation of MP levels in sepsis is potentially probeneficial to the cardiovascular function in this pathology. We then investigated the feasibility of improving the reconstructed media in order to facilitate the physiopathological studies of this layer and improve the potential of a smooth muscle cell (SMC)-containing substitutes to be implanted in human. Therefore, the self-assembly approach was used to generate an extracellular matrix (ECM) scaffold, produced in vitro by fibroblasts, in which SMCs can be seeded. After a week of culture in a decellularised matrix scaffold, the SMC-containing sheets were rolled around a mandrel to form a media layer. This engineered media demonstrated an increase mechanical resistance and contractility as compared with the original technique. Finally, we created an anisotropic ECM scaffold that can direct the orientation of SMCs to reproduce the physiological orientation of that layer. Reconstructed media produced using those anisotropic scaffolds were more resistant and contractile than the ones reconstructed using isotropic scaffolds. These improvements will facilitate the reconstruction of a media layer using pathological cells from patients and could lead to more representative pharmacological study of this layer. Moreover, this scaffold will facilitate the clinical translation of the model from bench to bedside.

Thèse en cotutelle : Université Laval, Québec et Université de Bordeaux, Talence, France. / Le besoin clinique de nouvelles stratégies pour pallier aux limites des techniques actuelles dans le cas de comblement et régénération osseuse a permis l’émergence de l’ingénierie tissulaire osseuse. En effet, les stratégies basées les techniques d’ingénierietissulaire semblent être une alternative à l’utilisation de greffes et ainsi de s’affranchir des limites qu’elles présentent. L’approche adoptée dans le cadre de cette thèse consiste en le développement et l’utilisation d’hydrogels comme matériaux d’échafaudage pour le comblement et la régénération de tissus osseux. De nombreuses approches utilisant elles aussi des hydrogels existent, chacune possède ses avantages et limites. Dans ce contexte, nos travaux ont consisté en l’utilisation d’un hydrogel non-polymérique comme matériau de base dans le développement des stratégies d’ingénierie tissulaire osseuse. Brièvement, plusieurs types cellulaires sont présents au sein du tissu osseux et vont participer aux processus de formation et de régénération osseuse. L’objectif de nos stratégies a été l’apport de cellules souches exogènes puis leur différenciation en cellules ostéoformatrices, ou le recrutement et la différenciation des cellules de l’hôte, au sein du matériau, en cellules ostéoformatrices. Le gel de GNF a été utilisé comme matrice tridimensionnelle pour ses propriétés d’injectabilité, de géléfication en l’absence d’agent de réticulation toxique et son potentiel ostéoinducteur. Ce travail a consisté audéveloppement de stratégies pour l’ingénierie tissulaire osseuse en associant le gel de GNF à une matrice naturelle de collagène cellularisée ou à des molécules bioactives pour promouvoir la régénération de lésions osseuses. Dans un premier temps, nos travaux ont reposé sur l’association de l’échafaudage à base d’hydrogels de GNF avec des cellules souches exogène ensemencées dans une matrice de collagène. Ensuite nos travaux ont porté sur l’association d’un échafaudage à base d’hydrogel de GNF avec un facteur de croissance ostéogénique. Ces travaux ont permis de développer et caractériser des stratégies pertinentes pour la régénération de lésions osseuses basées sur l’utilisation d’hydrogels. / New strategies to overcome the clinical limitations of current techniques for bone defect filling and regeneration has led to the involvement of bone tissue engineering. Indeed, strategies based on tissue engineering techniques seem to be an alternative to the use of grafts and thus to defeat their limits. The approach employed in this thesis consists in development and use of hydrogels as scaffold materials for bone defect filling and regeneration. There are many approaches that also use hydrogels, each one with its advantages and limitations. In this context, our work consisted in the use of a non-polymeric hydrogel as basic material in the development of strategies for bone tissue engineering. Briefly, several cell types are present within bone tissue and will participate in the processes of bone formation and regeneration. The objective of our strategies was the contribution of exogenous stem cells and then their differentiation into osteogenic cells or the recruitment and differentiation of the host cells into osteogenic cells within the material. The GNF gel was used as a three-dimensional matrix considering its properties of injectability, gelation in the absence of toxic crosslinking agent and its osteoinductive potential. The goal was to develop strategies for bone tissue engineering by combining the GNF gel with a natural matrix of cellular collagen or bioactive molecules to promote the regeneration of bone lesions. Initially, our work was based on the association of the scaffolds based on GNF hydrogels with exogenous stem cells seeded in a matrix of collagen gels. Next, our work focused on the association of a GNF hydrogel scaffold with an osteogenic growth factor. This work allowed to develop and characterize strategies relevant to the regeneration of bone lesions based on the use of hydrogels.

Les cellules endothéliales cornéennes constituent un tissu à la fois extrêmement particulier et d'une importance singulière. En effet, celui-ci est pourvu d'une capacité régénératrice pratiquement nulle, mais son intégrité est essentielle à la transparence cornéenne et donc à la vision. Par contre, l'endothélium cornéen fait défaut dans diverses pathologies telles que la dystrophie de Fuch et la kératopathie bulleuse du pseudophaque. La méthode traditionnelle pour le remplacement d'un endothélium cornéen pathologique est la greffe de cornée pleine épaisseur. Par contre, la greffe lamellaire postérieure est une alternative chirurgicale en plein essor, très intéressante, puisqu'elle permet de remplacer seulement la portion malade de la cornée. Cette technique chirurgicale a ouvert la porte à une nouvelle possibilité au niveau du génie tissulaire. En effet, il est maintenant envisageable de greffer un endothélium produit en laboratoire. Un défi supplémentaire, que s'est imposé notre équipe, est de reconstruire non seulement un endothélium complet, mais d'en reconstruire un qui serait également autologue, l'immunogénicité jouant un rôle non négligeable lors d'échec de greffes. Mon rôle dans ce projet était donc d'évaluer la faisabilité de reconstruire par génie tissulaire un endothélium cornéen autologue pour notre modèle animal, et ce, à des fins de greffes. D'abord en optimisant les conditions de culture afin de permettre la croissance des cellules endothéliales cornéennes animales. Puis en reconstruisant in vitro un endothélium à partir d'une biopsie cornéenne de taille minimale. Un endothélium sain similaire au tissu natif a ainsi été reconstruit.

Ce mémoire présente la conception, la fabrication et la caractérisation d'un système dédié au développement de techniques de génie tissulaire ayant pour objectif la culture de substituts valvulaires aortiques cardiaques. Une revue de littérature a été effectuée, recensant les bioréacteurs existants et les modèles mathématiques décrivant la nature puisée du débit sanguin aortique. Une étude des modèles théoriques Windkessel a permis de comprendre la dynamique des caractéristiques à reproduire. Le bioréacteur a été décomposée en ses principaux éléments, qui regroupés et réarrangés forment une architecture correspondant aux modèles théoriques. Supportée par ces modèles solides et les bioréacteurs les plus performants, l'équipe a étudié et conçu trois bioréacteurs de complexité différente. Les essais expérimentaux ont permis de valider le comportement théorique des architectures étudiées. Nous retenons que l'amélioration de la qualité de la réponse en pression se traduit essentiellement par une augmentation du nombre de composantes et une complexification de l'architecture.