Um dos principais reguladores da síntese proteica é o fator 2 do início da tradução de eucariotos (eIF2), formado por três subunidades não idênticas: a, β, e y. As funções citoplasmáticas da subunidade β, essenciais à integridade do processo, estão relacionadas à presença de dois domínios conservados: um deles composto por três blocos de seis a oito resíduos de lisinas e localizado na região amino terminal; e o outro constituído por quatro cisteínas que formam um motivo dedo de zinco localizado na região carboxiterminal. Em Saccharomyces cerevisiae, a expressão de eIF2β desprovido dos blocos de lisinas foi capaz de inibir o crescimento celular. Entretanto, até o momento não são relatados dados em células de mamíferos. Além de sua fundamental função na regulação do processo de síntese proteica no citoplasma, alguns estudos têm demonstrado que as três subunidades de eIF2 apresentam localização nuclear, mas essa também é uma questão ainda pouco explorada. Os resultados apresentados nessa tese mostram que a expressão de eIF2β desprovido dos blocos de lisinas causa uma redução acentuada na síntese proteica e, consequentemente, uma significativa diminuição da proliferação e viabilidade de células humanas. As análises da distribuição subcelular demonstram que eIF2β selvagem superexpresso está localizado no citoplasma, mas é capaz de translocar para o núcleo e acumular no nucléolo de maneira dependedente de ligação a RNA. Tanto os blocos de lisinas, quanto os resíduos de cisteínas mostram-se essenciais à retenção nucleolar de eIF2β. Além disso, sua exportação nuclear é mediada pela exportina CRM1 e é dependente de sua região amino terminal. Considerando os dados obtidos nesse trabalho, pode-se concluir que a ausência dos blocos de lisinas em eIF2β apresenta um efeito antiproliferativo em célula humanas e que a proteína eIF2β deve desempenhar funções no nucléolo relacionadas a algum processo que envolva ligação a RNA. Nesse contexto, podese observar também que, tal como o eIF2β, vários outros eIFs apresentam localização nuclear e participam em diferentes processos que ocorrem no núcleo, e que podem estar relacionados a um mecanismo de checagem da qualidade de mRNAs recém-sintetizados. Assim, os diferentes eIFs atuam em processos vitais à célula no núcleo e, nesse compartimento, também são importantes à regulação da expressão gênica. / The eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) is one of the main regulatory molecules in the protein synthesis. It is composed by three non identical subunits a, β, and y: The cytoplasmic functions of the β subunit, that are essential to the integrity of the process, are related to the presence of two conserved domains: one of them composed of three stretches of six to eight lysine residues and located in the amino-terminal region, and the other consisting of four cysteines that form a zinc finger motif located in the carboxyl-terminal portion. In Saccharomyces cerevisiae, the expression of recombinant eIF2β without of the polylysine stretches was able to inhibit cell proliferation, however no data are reported in mammalian cells so far. Additionaly to its fundamental role in regulating the process of protein synthesis in the cytoplasm, some studies have shown that eIF2 may act in the nucleus, but this issue is also still underexplored. Our results indicate a strong reduction in protein synthesis and consequently a significant decrease in cell proliferation and viability when the eIF2β without polylysine stretches is expressed in human cells. Analysis of cellular distribution of eIF2β indicates that it is located in the cytoplasm, but can translocate to the nucleus and accumulate in the nucleolus in a RNA-dependent manner. Both polylysine stretches and cysteine residues are essential for nucleolar retention of this factor. The eIF2β nuclear exclusion is mediated by exportin CRM1 and is dependent of its amino-terminal region. In conclusion, the results presented here show that the absence of polylysine stretches in human eIF2β has an antiproliferative effect in human cells and that the eIF2β protein should play a role related to some processes involving RNA in the nucleolus. In this context, we can also observe that, like eIF2β, others eIFs also present nuclear localization and participate in different processes in the nucleus which can de related to proofreading mechanism of newly synthesized mRNAs. In this way, several eIFs play a role in vital cellular processes in the nucleus and, in this compartment they also are important to regulation of gene expression.

A modulação fenotípica da célula estrelada hepática (CEH) é um dos eventos primários do processo de fibrose hepática. Durante este evento, a CEH modifica seu fenótipo lipocítico (quiescente) para miofibroblástico (ativado), fenômeno chamado de ativação. Estudos recentes sugerem que fatores de transcrição adipogênicos atuam no processo de ativação das CEH, e conseqüentemente teriam um papel chave na evolução do processo fibrótico. Neste estudo analisamos a expressão gênica de vários fatores de transcrição adipogênicos, como os receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (RAPP), receptor X do fígadoα (RXFα), proteína ligante de CCAAT/enhancerα (PLCEα) e proteína ligante do elemento regulatório de esteróis-1 (PLERE-1), em uma linhagem representativa de CEH, a GRX. A linhagem GRX, é capaz de ser induzida in vitro a expressar o fenótipo quiescente através do tratamento com indometacina ou retinol. Após 24 horas ou 7 dias de tratamento, a expressão gênica foi analisada através de PCR em tempo real. Tratamento com indometacina aumentou a expressão de todos os genes avaliados, exceto PLCEα e RAPPβ. O mesmo resultado obtido com desmetil indometacina (LM 4511) sobre RAPPα e γ sugere que a ação da indometacina sobre a diferenciação fenotípica da GRX é independente de sua ação inibitória sobre ciclooxigenase, já que a LM 4511 não possui esta atividade. Tratamento com retinol levou à modulação de um número menor de genes, diminuindo a expressão de PLCEα e aumentando a de RAPPγ, e RAPPβ. Adipsina, gene característico de adipócitos, teve sua expressão induzida apenas nas células tratadas com indometacina. Pex16 e catalase, genes modulados pelos RAPPs, foram diferencialmente expressos, dependendo do tratamento. Os resultados apresentados sugerem que a linhagem representativa de CEH, GRX, tem sua indução fenotípica modulada por fatores de transcrição adipogênicos, que são diferencialmente expressos dependendo do tratamento de conversão.

Os cestódeos são agentes etiológicos de doenças parasíticas em humanos e em animais domesticados. Estamos utilizando Mesocestoides corti como um sistema modelo para estudar a biologia do desenvolvimento dos cestódeos, particularmente a transição da fase larval para a fase adulta segmentada. Com o propósito de isolar seqüências diferencialmente expressas durante o processo de segmentação, aplicamos a metodologia de análise das diferenças de representações de cDNA (cDNA RDA) utilizando RNA total extraído de larvas e vermes segmentados em cultivos in vitro de M. corti. Duas bibliotecas de cDNA subtraídas, enriquecidas com seqüências diferencialmente expressas das formas larvais ou segmentadas, foram construídas usando uma razão de driver:tester de 100:1 e 800:1 no 1º e 2º ciclos de subtração, respectivamente. A eficiência de subtração foi avaliada com experimentos de hibridização, utilizando as seqüências subtraídas como sondas contra os produtos de cDNA amplificados por PCR, com análise de macroarranjos e com confirmação individual, em experimentos de Northern virtual, de clones selecionados. Uma estratégia de RT-PCR em tempo real para confirmação dos resultados está sendo otimizada e resultados preliminares são apresentados. Após o seqüenciamento de 1036 clones de cDNA independentes e adoção de uma estratégia de seqüenciamento de alta qualidade, foram identificadas 190 seqüências, preferencialmente expressas em tetratirídeos (49) ou em vermes segmentados (141). Entre os genes identificados, 71 foram funcionalmente anotados, incluindo seqüências relacionadas a reguladores de estrutura de cromatina e controle de transcrição, cujos ortólogos estão implicados em processos de desenvolvimento em Drosophila e em vertebrados.

A cada dia surgem novas tecnologias que possibilitam aos cientistas medirem a expressão de inúmeros genes em uma única experiência com uma alta rapidez e eficiência. No entanto, ainda não existem muitas metodologias que sirvam para a análise do funcionamento de células e tecidos que possibilitem diagnóstico, prevenção e terapias de doenças. Na presente tese propomos uma metodologia de análise de expressão gênica que mostra diferenças na performance da célula com o passar do tempo, e tem poder de diagnóstico quando uma célula mutada é comparada com uma célula normal. Partimos da ideia de que rotas bioquímicas podem ser representadas por uma rede de interações entre metabólitos, entre os quais muitos deles são proteínas codificadas a partir do genoma. Sendo assim, o funcionamento de uma célula implica em interações que compõem uma rede intricada e complexa. Reorganizamos a lista de genes em uma dimensão e reescrevemos a matriz de interação, sem a criação ou a destruição de interações, buscando correlacionar cada um dos genes com os seus respectivos vizinhos na lista unidimensional. Logo após a reorganização, encontramos módulos funcionais sobre a lista ordenada que são independentes do estado da célula estudada, é possível reconhecer os processos biológicos de cada módulo com o uso de banco de dados específicos. Com base nisto, sobrepondo dados de expressão gênica sobre o ordenamento (transcriptograma), teremos um perfil transcricional de um tecido no ato da medida experimental. Se medirmos a expressão gênica de células provenientes do mesmo tecido em diferentes estágios do ciclo celular podemos seguir as alterações metabólicas ao longo do ciclo celular. Também poderíamos analisar a expressão gênica de um tecido normal com um tecido alterado. Como resultado desta comparação saberíamos quais módulos estão super expressos e os subexpressos em relação ao tecido normal. Publicamos na internet um software que é capaz de reproduzir essas análises e gerar transcriptogramas para análise de expressão gênica. / Every day new technologies which allow scientists to measure the expression of numerous genes in a single experiment with a high speed and efficiency are emerging. However, there aren’t many methods which are used to analyze the functioning of cells and tissues which allow diagnosis, prevention and therapy of diseases. In this thesis we propose a methodology for gene expression analysis that presents those differences in cell performance over time, and has diagnostic power when comparing a mutant cell with a normal one. Starting from the idea that biochemical pathways can be represented by a network of interactions between metabolites, among which many are encoded proteins from the genome. Thus, the functioning of a cell involves interactions that make up an intricate and complex network. We reorganize the genes list in one dimension and rewrite the matrix of interaction, without the creation or destruction of interactions, seeking to correlate each gene with their respective neighbors in a one-dimensional list. Soon after the reorganization, we find functional modules on the ranked list that are state independent of the cell studied, it is possible to recognize the biological processes for each module by using specific databases. Based on this, overlapping gene expression data on reorganized gene list (transcriptogram), we obtain a transcriptional profile of a tissue at the experimental measurement time. If we measure the gene expression of cells from the same tissue at different celluar stages we can follow the metabolic changes during the cell cycle. We could also analyze the gene expression of normal tissue with a mutant tissue. As a result this comparison we would know what modules are super expressed and underexpressed when compared to normal tissue. We published on the Internet software which is able to reproduce these analysis and generate transcriptograms for gene expression analysis.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-06-12T19:11:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Brena Moitinho.pdf: 6153217 bytes, checksum: e4fc8f7d7d76e88833122d2b9cbfbf06 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-12T19:11:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Brena Moitinho.pdf: 6153217 bytes, checksum: e4fc8f7d7d76e88833122d2b9cbfbf06 (MD5) / A goma xantana é um biopolímero largamente utilizado nas indústrias alimentícias, farmacêuticas e de petróleo, e é sintetizada, naturalmente, por bactérias do gênero Xanthomonas. A biossíntese da xantana envolve 12 genes inseridos no grupamento gênico gum (denominados gumB a gumM), contudo, o estudo de sua expressão gênica pode ser baseado apenas nas regiões promotoras que conduzem sua transcrição. Baseado em estudos in silico de bioinformática, foram determinados promotores inseridos em seis regiões, upstream aos genes gumB C F H L e M. Primers para estas regiões foram então desenhados e sintetizados com base em parâmetros aplicados a PCR em tempo real e verificados por esta técnica, utilizando a sequência de uma linhagem de Xanthomonas arboricola como molde. Foi observado a especificidade dos primers desenhados para os genes gumB, C e M, que representam-se essenciais para estudos da expressão de genes que codificam moléculas relacionadas com a estrutura e a reologia da goma xantana. / Salvador

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:12:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345650.pdf: 1330328 bytes, checksum: 55dfae15bfefc3739493e70fb1ce1cd7 (MD5) / Cylindrospermopsis raciborskii é uma cianobactéria planctônica de água doce, conhecida por produzir cilindrospermosina, toxinas paralisantes e alguns outros compostos ainda não identificados. Esta espécie, originalmente identificada como restrita a regiões tropicais, apresenta grande capacidade de invasão e adaptação em corpos d?água ao redor do mundo. Na lagoa do Peri, um lago polimítico subtropical, localizado na costa sul do Brasil, C. raciborskii representa cerca de 90% da densidade do fitoplâncton total, mostrando-se dominante durante a maior parte do ano. O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar duas cepas, LP1, isolada em 2006, e LP2, isolada em 2013, ambas na Lagoa do Peri, quanto sua morfologia, ecofisiologia e seu perfil de toxinas, bem como, sua filogenia, além de relacionar o conteúdo de toxinas com os níveis relativos de transcritos dos genes sxtA, sxtB, sxtI e sxtS, presentes no agrupamento responsável pela biossíntese da saxitoxina. As duas, LP1 e LP2, cepas apresentaram 100% de identidade nas sequências parciais correspondentes aos genes 16S rRNA, ITS e rpoC1, entretanto, possuem características morfológicas, ecofisiológicas e toxicológicas distintas. As cepas apresentam morfologias distintas e diferenças significativas quanto ao comprimento e volume dos tricomas. A cepa LP2 mostrou uma tendência a maiores taxas de crescimento que a cepa LP1, nas três temperaturas (17°C, 22°C e 28°C) e nas três razões N:P (4,5:1, 10:1 e 40:1) testadas. Ambas as cepas apresentam baixo requerimento de luz, mas foram capazes de tolerar intensidades luminosas em torno de 200 µmol photons.m-2.s-1. A cepa LP2 apresentou maior concentração de clorofia-a e também maior dissipação de energia não fotoquímica (NPQ) que a cepa LP1, e quando exposta a altas intensidades luminosas, apresentou tricomas com maior volume. Com relação à produção de toxinas, a cepa LP2 apresentou um potencial tóxico maior que a cepa LP1, uma vez que apresentou uma maior variedade de análogos, sendo, portanto, considerada mais tóxica, de acordo com o nível de toxicidade de cada variante. A cepa LP1 não amplificou nenhum dos geneselecionados da via de biossíntese da saxitoxina, logo, apresentou ausência de expressão dos mesmos. De um modo geral, a expressão relativa dos genes sxtA, sxtB, sxtI e sxtS, foi menor na cepa LP2, quando comparada com os níveis relativos de transcritos da cepa C. raciborskii T3, usada como controle. Entretanto, só foi observada diferença estatística nos níveis de transcritos do gene sxtA. Também não foi observada diferença estatística entre os níveis relativos de transcritos dos quatro genes, dentro da mesma cepa. Esses resultados reforçam a hipótese que existam diferentes ecótipos desta espécie, que provavelmente se originaram em resposta às variações ambientais existentes na Lagoa do Peri. A sua dominância durante grande parte do ano pode ser explicada pela alternância desses ecótipos na contribuição de biomassa total de acordo com suas vantagens fisiológicas, contribuindo para o sucesso ecológico da espécie.<br. / Abstract : Cylindrospermopsis raciborskii is a freshwater planktonic cyanobacteria recognized to produce the alkaloid cylindrospermopsin, paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins, and some other unknown compounds. This species, previously restricted to the tropics, has great ability of invasion and adaptation, and is currently found in water bodies from a wide range of latitudes. In Peri Lagoon, a subtropical polimytic lake located at the southern coast of Brazil, the species represents about 90% of the total phytoplankton, being dominant for most part of the year. In the present work we attempted to characterize two strains of C. raciborskii, LP1, isolated in 2006, and LP2, isolated in 2013, from Peri Lagoon, for their morphology, ecophysiology, phylogeny and toxin profiles. In addition, the relationship between the toxin content and the relative transcripts level of sxtA, sxtB, sxtI and sxtS genes were evaluated. Both LP1 and LP2 strains showed 100% identity in the partial sequences corresponding to the 16S rRNA, ITS and rpoC1 genes, however, they have different morphological, ecophysiological and toxicological characteristics. The strains showed different morphologies and significant differences in the length and volume of trichomes. LP2 strain showed a tendency to higher growth rates than the LP1 strain at the three temperatures (17 °C, 22 °C and 28 °C) and N: P ratios (4.5:1, 10:1 and 40:1) tested. Both strains showed low light requirements, but were able to tolerate irradiances around 200 µmol photons.m-2.s-1. LP2 strain showed higher chlorophyll-a concentration and also a higher non-photochemical quenching (NPQ) than LP1 strain, and when exposed to high light intensities, showed higher trichomes volume. Regarding toxin content, the LP2 strain LP2 strains exhibited a higher toxic potential than the LP1 strain, and a wider range of analogs, being therefore more toxic. LP1 strain did not amplify any of the selected genes of the biosynthesis pathway of saxitoxin, as well as, showed no expression. In general, the relative transcripts' level of the sxtA, sxtB, sxtI and sxtS genes was lower in the LP2 strain when compared to the relative transcripts level of the C. raciborskii T3 strain used as control. However, only significant difference was observed in the sxtA gene transcript levels. In addition, no significant difference was observed between the relative levels of transcripts of the four genes within the same strain. These results support the hypothesis of ecotypes selection for this species, which probably were originated in response to environmental fluctuations in Peri Lagoon. Dominance duringalmost the whole year can be explained by the alternation of these ecotypes in the total biomass contribution according to their physiological advantages, contributing to the ecological success of this species.

RIBEIRO JÚNIOR, H. L. Expressão de genes relacionados às vias de reparo de danos em fita dupla no DNA em pacientes com Síndrome Mielodisplásica. 2016. 156 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-16T12:19:55Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_hlrjunior.pdf: 3941169 bytes, checksum: da8ed2c501a8d8f79b2699dd21d36ce6 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-16T12:20:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_hlrjunior.pdf: 3941169 bytes, checksum: da8ed2c501a8d8f79b2699dd21d36ce6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-16T12:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_hlrjunior.pdf: 3941169 bytes, checksum: da8ed2c501a8d8f79b2699dd21d36ce6 (MD5) Previous issue date: 2016-06-09 / The myelodysplastic syndrome (MDS) is a group of clonal hematopoietic stem cell disorders characterized by cytopenia (s) peripheral (s), dysplasia of one or more myeloid cell lineages and increased risk of acute myeloid leukemia development. MDS is considered a disease of elderly people, since approximately 80% of patients are over 60 years of diagnosis. The causes of MDS are known only in 15% of cases. With respect to environmental factors such as MDS triggers may be included the use of prior chemotherapy, especially alkylating agents and purine analogs, radiation therapy and smoking. The pathogenesis of MDS involves DNA damage in hematopoietic stem cells affected probably by double-stranded damage (DSB) in the DNA and the case of joints by non-homologous ends (NHEJ) and homologous recombination main repair mechanisms necessary to ensure stability genomics of stem cells. This cohort study aimed to assess the level of expression of mRNA of the genes active in the repair mechanism of double-stranded DNA damage (BRCA1, BRCA2 and RAD51, operating in HR mechanism, the XRCC5, XRCC6 and LIG4 related mechanism for NHEJ and, finally, the ATM) linking the molecular findings with their polymorphic variants (rs4793191, rs9567623, rs1801320, rs3835, rs2267437, rs1805388 and rs228593, respectively) and with clinical and socio-demographic of patients of Myelodysplastic Syndromes. This genotyping analysis was based on qPCR methodology, including bone marrow samples from 83 patients with MDS and 10 bone marrow samples from healthy elderly volunteers. The MDS patients were diagnosed according to the criteria proposed by the World Health Organization and stratified according to the criteria established by prognósitoc Score Index International Prognostic revised. In this study we observed that: 1. the ATM, BRCA1, BRCA2 and RAD51 genes were significantly associated with cellularity variable bone marrow of patients with MDS; 2. the XRCC5 gene introduced is associated with the presence of ringed sideroblasts on the analysis of the bone marrow of patients with MDS; 3. The BRCA2, RAD51 and LIG4 genes correspond to potential markers of poor prognosis and progression in clonal cases of MDS de novo of high level, being associated with decreased survival and a high chance of progression to AML; 4. the XRCC6 gene is a negative prognostic factor for patients at low risk, it is evident that the decrease in expression of this gene is able to identify an unfavorable subgroup within the low-risk patients who have higher dependence transfusion and increased genomic instability and finally, 5 the results of analysis of influence of functional polymorphisms in MDS emphasize the importance of polymorphism rs228593, rs2267437 and rs1805388 in differentiating the expression levels of ATM, XRCC6 and LIG4 genes, respectively, compared to patients with clinical variables MDS representing novel targets for the study of the pathogenesis of this disease. We demonstrate that the DSBs repair related genes are also related to the pathogenesis of MDS. These results support the importance of the expression levels of ATM, BRCA1, BRCA2, RAD51, XRCC5, XRCC6 and LIG4 genes, as well as the frequency of the respective polymorphisms (rs228593, rs4793191, rs9567623, rs1801320, rs3835, rs2267437 and rs1805388) in the maintenance genomic stability of hematopoietic stem cells promoting a better understanding of the etiology, diagnosis and prognostic stratification and the process of clinical development of Myelodysplastic Syndromes. / Síndrome Mielodisplásica (SMD) é um grupo de doenças clonais das células progenitoras hematopoiéticas, caracterizadas por citopenia(s) periférica(s), displasia de uma ou mais linhagens celulares mielóides e aumento do risco de desenvolvimento de leucemia mielóide aguda. A SMD é considerada uma doença de pessoas idosas, pois aproximadamente 80% dos pacientes possuem mais de 60 anos ao diagnóstico. As causas da SMD são conhecidas em apenas 15% dos casos. Em relação aos fatores ambientais como desencadeadores da SMD, podem ser incluídos o uso de quimioterapia prévia, especialmente de agentes alquilantes e análogos da purina, radioterapia e tabagismo. A patogênese da SMD envolve danos no DNA nas células tronco hematopoéticas acometido provavelmente pelos danos de fita dupla (DSB) no DNA tendo o processo de junções por extremidades não-homólogas (JENH) e recombinação homóloga como principais mecanismos de reparo necessários para garantir a estabilidade genômica das células-tronco. Este estudo de coorte propôs avaliar o nível de expressão do mRNA dos genes atuantes no mecanismo de reparo em danos de fita dupla no DNA (BRCA1, BRCA2 e RAD51, atuantes no mecanismo de Recombinação Homóloga; o XRCC5, XRCC6 e LIG4 relacionados ao mecanismo de Junções por Extremidades não-Homólogas e, por fim, o ATM) associando os achados moleculares com suas variantes polimórficas (rs4793191, rs9567623, rs1801320, rs3835, rs2267437, rs1805388 e rs228593, respectivamente) e com variáveis clínicas e sócio-demográficas de pacientes portadores de Síndrome Mielodisplásica. Esta análise de genotipagem baseou-se na metodologia de qPCR, entre amostras de medula óssea de 83 pacientes com SMD e 10 amostras de medula óssea de idosos voluntários sadios. Os pacientes com SMD foram diagnosticados de acordo com os critérios propostos pela Organização Mundial de Saúde e estratificados de acordo com os critérios prognósitoc estabelecidos pelo Índice de Score Prognóstico Internacional revisado. Com este estudo foi possível identificar que: 1. os genes ATM, BRCA1, BRCA2 e RAD51 foram associados significativamente com a variável de celularidade da medula óssea dos pacientes com SMD; 2. o gene XRCC5 apresentou-se associado com a presença de sideroblastos em anel quanto à análise da medula óssea dos pacientes com SMD; 3. os genes BRCA2, RAD51 e LIG4 correspondem a possíveis marcadores de pior prognóstico e de progressão clonal em casos de SMD de novo de alto grau, estando associados a uma diminuição da sobrevida e a uma elevada chance de evolução para LMA; 4. o gene XRCC6 é um fator de prognóstico desfavorável para os pacientes de baixo risco, sendo evidente que a diminuição da expressão deste gene é capaz de identificar um subgrupo desfavorável dentro dos pacientes de baixo risco que apresentariam maior dependência transfusional e maior instabilidade genômica e, por fim, 5. os resultados das análises de influência dos polimorfismos funcionais na SMD realçam a importância dos polimorfismos rs228593, rs2267437 e rs1805388 na diferenciação dos níveis de expressão dos genes ATM, XRCC6 e LIG4, respectivamente, frente às variáveis clínicas de pacientes com SMD, representando novos alvos para o estudo da patogênese desta doença. Demonstramos que os genes relacionados à reparação das DSBs são também relacionados a patogênese da SMD. Estes resultados suportam a importância dos níveis de expressão dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, RAD51, XRCC5, XRCC6 e LIG4, como também da frequência dos seus respectivos polimorfismos (rs228593, rs4793191, rs9567623, rs1801320, rs3835, rs2267437 e rs1805388) na manutenção da estabilidade genômica das células tronco hematopoiéticas promovendo um melhor entendimento da etiologia, estratificação diagnóstica e prognóstica e do processo de evolução clínica da Síndrome Mielodisplásica.

Um dos principais reguladores da síntese proteica é o fator 2 do início da tradução de eucariotos (eIF2), formado por três subunidades não idênticas: a, β, e y. As funções citoplasmáticas da subunidade β, essenciais à integridade do processo, estão relacionadas à presença de dois domínios conservados: um deles composto por três blocos de seis a oito resíduos de lisinas e localizado na região amino terminal; e o outro constituído por quatro cisteínas que formam um motivo dedo de zinco localizado na região carboxiterminal. Em Saccharomyces cerevisiae, a expressão de eIF2β desprovido dos blocos de lisinas foi capaz de inibir o crescimento celular. Entretanto, até o momento não são relatados dados em células de mamíferos. Além de sua fundamental função na regulação do processo de síntese proteica no citoplasma, alguns estudos têm demonstrado que as três subunidades de eIF2 apresentam localização nuclear, mas essa também é uma questão ainda pouco explorada. Os resultados apresentados nessa tese mostram que a expressão de eIF2β desprovido dos blocos de lisinas causa uma redução acentuada na síntese proteica e, consequentemente, uma significativa diminuição da proliferação e viabilidade de células humanas. As análises da distribuição subcelular demonstram que eIF2β selvagem superexpresso está localizado no citoplasma, mas é capaz de translocar para o núcleo e acumular no nucléolo de maneira dependedente de ligação a RNA. Tanto os blocos de lisinas, quanto os resíduos de cisteínas mostram-se essenciais à retenção nucleolar de eIF2β. Além disso, sua exportação nuclear é mediada pela exportina CRM1 e é dependente de sua região amino terminal. Considerando os dados obtidos nesse trabalho, pode-se concluir que a ausência dos blocos de lisinas em eIF2β apresenta um efeito antiproliferativo em célula humanas e que a proteína eIF2β deve desempenhar funções no nucléolo relacionadas a algum processo que envolva ligação a RNA. Nesse contexto, podese observar também que, tal como o eIF2β, vários outros eIFs apresentam localização nuclear e participam em diferentes processos que ocorrem no núcleo, e que podem estar relacionados a um mecanismo de checagem da qualidade de mRNAs recém-sintetizados. Assim, os diferentes eIFs atuam em processos vitais à célula no núcleo e, nesse compartimento, também são importantes à regulação da expressão gênica. / The eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) is one of the main regulatory molecules in the protein synthesis. It is composed by three non identical subunits a, β, and y: The cytoplasmic functions of the β subunit, that are essential to the integrity of the process, are related to the presence of two conserved domains: one of them composed of three stretches of six to eight lysine residues and located in the amino-terminal region, and the other consisting of four cysteines that form a zinc finger motif located in the carboxyl-terminal portion. In Saccharomyces cerevisiae, the expression of recombinant eIF2β without of the polylysine stretches was able to inhibit cell proliferation, however no data are reported in mammalian cells so far. Additionaly to its fundamental role in regulating the process of protein synthesis in the cytoplasm, some studies have shown that eIF2 may act in the nucleus, but this issue is also still underexplored. Our results indicate a strong reduction in protein synthesis and consequently a significant decrease in cell proliferation and viability when the eIF2β without polylysine stretches is expressed in human cells. Analysis of cellular distribution of eIF2β indicates that it is located in the cytoplasm, but can translocate to the nucleus and accumulate in the nucleolus in a RNA-dependent manner. Both polylysine stretches and cysteine residues are essential for nucleolar retention of this factor. The eIF2β nuclear exclusion is mediated by exportin CRM1 and is dependent of its amino-terminal region. In conclusion, the results presented here show that the absence of polylysine stretches in human eIF2β has an antiproliferative effect in human cells and that the eIF2β protein should play a role related to some processes involving RNA in the nucleolus. In this context, we can also observe that, like eIF2β, others eIFs also present nuclear localization and participate in different processes in the nucleus which can de related to proofreading mechanism of newly synthesized mRNAs. In this way, several eIFs play a role in vital cellular processes in the nucleus and, in this compartment they also are important to regulation of gene expression.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / A tecnologia microarray revelou ser metodologia eficiente na avaliacao da expressao diferencial de genes e, portanto, tornou-se ferramenta usual em investigacao molecular do cancer. Neste estudo, utilizou-se microarrays de cDNA contendo 2000 genes diferentes para analisar a expressao genica em 10 casos de carcinomas endometrioides humanos pos-¬menopausa pareados contra seus tecidos normais correspondentes adjacentes para identificar genes diferencialmente expressos. Varios genes foram encontrados diferencialmente expressos neste estudo. Destacou¬-se o MAP3K8, gene que nunca havia sido descrito superexpresso neste tipo de neoplasia maligna. Para validar a expressao diferencial deste gene, assim como a membrana array, executou-se analise RT-PCR semiquantitativa. O MAP3K8 mostrou-se superexpresso em 30 por cento das amostras de carcinoma de endometrio. Este e o primeiro relato mostrando o oncogene MAP3K8 relacionado ao carcinoma de endometrio humano, sugerindo ser outra molecula envolvida no cancer endometrial humano / Gene microarray technology is highly effective in screening for differential gene expression and has hence become a popular tool in the molecular investigation of cancer. In the present study, cDNA microarrays containing 2000 different genes were used to analyze gene expression profiles in 10 human postmenopausal endometrioid-paired carcinomas specimens versus corresponding adjacent normal tissue to identify differentially expressed genes. In our study several genes were found differentially expressed. One of them was the MAP3K8, a gene that was never described to be overexpressed in this kind of malignancy. To validate the differential expression of this gene as well as the membrane array, we performed semiquantitative reverse transcription-PCR analysis. The MAP3K8 was found overexpressed in 30% of endometrial carcinomas samples. To the best of our knowledge this is the first report showing the MAP3K8 oncogene linked to human endometrial carcinoma suggesting that it may be another molecule involved in human endometrial cancer. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Howard Hughes Medical Institute (HHMI) / Os índices que medem adaptação dos códons são amplamente utilizados para predizer o nível de expressão de um gene. Para verificar se: (i) o índice de adaptação dos códons (CAI) pode ser utilizado para ordenar e caracterizar genes hipotéticos em seqüências de genomas completos; (ii) a variação estocástica da expressão gênica entre as células (ruído) pode ser utilizada como um marcador quantitativo para diferenciar genes essenciais de não essenciais e (iii) qual a correlação existente entre o ruído e o CAI, subdividiu-se esse trabalho em duas partes. Na primeira parte analisei os índices de padrão de uso dos códons como preditores do nível de expressão de genes hipotéticos da levedura Candida albicans. Foram selecionados 744 genes hipotéticos que satisfazem três características simultaneamente sendo elas: (i) ORFs maiores que 500bp; (ii) fases abertas de leitura sem sobreposição com outras ORFs e (iii) ORFs com similaridade ≥ 60% com genes de Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe. O padrão de uso dos códons para os genes hipotéticos apresenta uma grande variedade nos diferentes genes selecionados, porém nota-se uma tendência a um baixo e médio nível de expressão independente do índice analisado. Os valores de CAI variam entre 0,044 e 0,540 com média de 0,170 (± 0,051). ORFs com baixo nível de expressão e potencialmente essenciais são ótimas candidatas para serem alvos para drogas potenciais. Essas características são importantes uma vez que um baixo nível de expressão implicaria numa menor dosagem da droga, e o gene de ser potencialmente essencial uma vez que se deseja a morte do fungo causando a infecção. Baseando-se nessas duas características selecionou-se duas ORFs hipotéticas para estudo de função: CaYdr187c (CAI = 0,084) e CaYlr339c (CAI = 0,088). A ORF CaYdr187c é uma possível proteína do envelope celular, com ontologia de resposta imune; e apresenta tanto peptídeo sinal quanto regiões transmembrana. De acordo com o RT-PCR esse gene é transcrito apenas na fase de levedura do fungo. A ORF CaYlr339c é uma possível proteína relacionada com a tradução, com ontologia de resposta imune; e não apresenta nem peptídeo sinal e nem regiões transmembrana. De acordo com o RT-PCR esse gene é transcrito tanto na fase de levedura quanto na de hifa do fungo. Na segunda parte, analisei a distribuição do ruído transcricional e sua possível utilização como classificador para a essencialidade dos genes. Para se estudar as distribuições estatísticas do ruído temporal no sistema eucariótico modelo Saccharomyces cerevisiae, nós analisamos dados de microarray correspondendo à um ciclo celular para 6.200 genes. Nós descobrimos que o ruído temporal segue uma distribuição log-normal com invariância de escala nos níveis genômico, cromossômico e sub-cromossômico. A correlação do ruído temporal com o índice de adaptação dos códons sugere que pelo menos 70% dos genes codificadores de proteínas são o centro de minimização de ruído do genoma. Nós propusemos um modelo matemático da dinâmica da expressão de um único gene, utilizando a teoria de operadores, o qual revela condições rígidas para a variabilidade do ruído e uma estratégia possível para a minimização / otimização do ruído em nível genômico. Nosso modelo e dados mostram que o ruído mínimo não corresponde a genes obedecendo a uma dinâmica estritamente determinística. A estratégia natural de minimização do ruído consiste em igualar o ruído (η) com a média do valor absoluto da variação relativa do nível de expressão (α). Nós hipotetizamos que o padrão do ruído temporal é uma propriedade emergente do genoma e mostra como a dinâmica da expressão gênica pode estar relacionada com a organização cromossômica. Os índices utilizados neste estudo foram validados como preditores do nível de expressão, caso do CAI para a Candida albicans, e de essencialidade, caso do ruído da expressão gênica. O índice de adaptação dos códons (CAI) é válido como preditor do nível de ruído bem como da dinâmica da expressão gênica. / The indices that measure the codon adaptation are widely used for predicting the expression level of a gene. To verify if: (i) the codon adaptation index (CAI) can be used to characterize hypothetical genes in complete genomes; (ii) the variation of gene expression within cells (noise) can be used as a quantitative marker for essentiality and (iii) what’s the correlation between noise and CAI, this work is divided in two parts. In first section we analyzed the indices that measure the codon adaptation as predictors of the expression level in hypothetical genes in the yeast Candida albicans. We selected 744 hypothetical ORFs that satisfied three characteristic: (i) ORFs longer than 500bp (bp); (ii) open reading frames not superposed with other ORFs and (iii) ORFs with similarity ≥ 60% with Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe genes. The codon usage for the hypothetical genes vary a lot between the selected ORFs, regardless the index. The CAI vary between 0,044 and 0,540 with average 0,170 (±0,051). ORFs with low expression level and that are possibly essential are good candidates to be new drug targets. Based on this two characteristics we selected two hypothetical ORFs for function studies: CaYdr187c (CAI=0,084) and CaYlr339c (CAI=0,088). The ORF CaYdr187c is a possible cell envelope protein, with gene ontology of immune response, and prediction of both signal peptide and transmembrane regions. Based on the RT-PCR this gene is expressed only in the yeast fase. The ORF CaYlr339c is a possible protein involved in translation, with gene ontology of immune response, and no prediction of both signal peptide and transmembrane regions. Based on the RT-PCR this gene is expressed both in the yeast and hypha fases. In the second section, I analyzed the transcription noise and its possible use as a classifier of gene essentiality. The analysis of transcriptional temporal noise could be an interesting means to study gene expression dynamics and stochasticity in eukaryotes. To study the statistical distributions of temporal noise in the eukaryotic model system Saccharomyces cerevisiae, we analyzed microarray data corresponding to one cell cycle for 6,200 genes. We found that the temporal noise follows a lognormal distribution with scale invariance at the genome, chromosomal and sub-chromosomal levels. Correlation of temporal noise with the codon adaptation index suggests that at least 70% of all protein-coding genes are a noise minimization core of the genome. Accordingly, a mathematical model of individual gene expression dynamics was proposed, using an operator theoretical approach, which reveals strict conditions for noise variability and a possible global noise minimization/optimization strategy at the genome level. Our model and data show that minimal noise does not correspond to genes obeying a strictly deterministic dynamics. The natural strategy of minimization consists in equating the mean of the absolute value of the relative variation of the expression level (α) with noise (η). We hypothesize that the temporal noise pattern is an emergent property of the genome and shows how the dynamics of gene expression could be related to chromosomal organization. / BV UNIFESP: Teses e dissertações