Spelling suggestions: "subject:"proteingekoppelten corezeptor"" "subject:"proteingekoppelten fotorezeptor""
1 |
Labeling approaches for functional analyses of adhesion G protein-coupled receptors / Markierungsverfahren zur funktionellen Analyse von Adhäsions-G-Protein-gekoppelten RezeptorenAltrichter, Steffen January 2021 (has links) (PDF)
The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) comprises more than 800 members, which are divided into five families based on phylogenetic analyses (GRAFS classification): Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2 and Secretin. The adhesion G protein-coupled receptor (aGPCR) family forms with 33 homologs in Mammalia the second largest and least investigated family of GPCRs. The general architecture of an aGPCR comprises the GPCR characteristics of an extracellular region (ECR), a seven transmembrane (7TM) domain and an intracellular region (ICR). A special feature of aGPCRs is the extraordinary size of the ECR through which they interact with cellular and matricellular ligands via adhesion motif folds. In addition, the ECR contains a so-called GPCR autoproteolysis-inducing (GAIN) domain, which catalyzes autoproteolytic cleavage of the protein during maturation. This cleavage leads to the formation of an N-terminal (NTF) and a C-terminal fragment (CTF), which build a unit by means of hydrophobic interactions and therefore appear as a heterodimeric receptor at the cell surface. In the past, it has been shown that the first few amino acids of the CTF act as a tethered agonist (TA) that mediates the activation of the receptor through the interaction with the 7TM domain. However, the molecular mechanism promoting the TA-7TM domain interaction remains elusive. This work reveals a novel molecular mechanism that does not require the dissociation of the NTF-CTF complex to promote release of the TA and thus activation of the aGPCR. The introduction of bioorthogonal labels into receptorsignaling- relevant regions of the TA of various aGPCRs demonstrated that the TA is freely accessible within the intact GAIN domain. This suggests a structural flexibility of the GAIN domain, which allows a receptor activation independent of the NTF-CTF dissociation, as found in cleavage-deficient aGPCR variants. Furthermore, the present study shows that the cellular localization and the conformation of the 7TM domain depends on the activity state of the aGPCR, which in turn indicates that the TA mediates conformational changes through the interaction with the 7TM domain, which ultimately regulates the receptor activity. In addition, biochemical analyses showed that the GAIN domain-mediated autoproteolysis of the human aGPCR CD97 (ADGRE5/E5) promotes further cleavage events within the receptor. This suggests that aGPCRs undergo cleavage cascades, which are initialized by the autoproteolytic reaction of the GAIN domain. Thus, it can be assumed that aGPCRs are subject to additional proteolytic events. Finally, the constitutive internalization of the NTF and the CTF of E5 was demonstrated by various labeling methods. It was possible to label both fragments independently and to follow their subcellular location in vitro. In summary, these obtained results contribute to a better understanding about the molecular mechanisms of activity and signaling of aGPCRs. / Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) umfasst weit mehr
als 800 Mitglieder, welche aufgrund von phylogenetischen Analysen in fünf Familien
unterteilt werden (GRAFS Klassifizierung): Glutamat, Rhodopsin, Adhäsion,
Frizzled/Taste2 und Sekretin. Die Familie der Ädhesions-G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren (aGPCRs) bildet mit 33 Homologen in Säugetieren die zweitgrößte Familie
innerhalb der GPCRs. Die generelle Architektur eines aGPCRs weist die GPCR
typischen Merkmale einer extrazellulären Region (ECR), einer sieben
Transmembrandomäne (7TM) und einer intrazellulären Region (ICR) auf. Eine
Besonderheit stellt hierbei die außergewöhnliche Größe der ECR, welche über
vielfältige Domänen mit zellulären und matrixgebundenen Liganden interagieren, dar.
Zusätzlich umfasst die ECR eine sogenannte GPCR Autoproteolyse-induzierende
(GAIN) Domäne, an welcher während der Proteinreifung eine autoproteolytische
Spaltung stattfindet. Diese Spaltung führt zur Entstehung eines N-terminalen (NTF)
und C-terminalen Fragmentes (CTF), welche mittels hydrophober Wechselwirkung
eine Einheit an der Zelloberfläche und daher einen heterodimeren Rezeptor bilden.
In der Vergangenheit zeigte sich, dass die ersten paar Aminosäuren des CTF als
angebundener Agonist (TA) agieren und über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine
Aktivierung des Rezeptors vermitteln. Der molekulare Mechanismus, welcher die
Wechselwirkung zwischen TA und 7TM Domänen fördert, ist jedoch weiterhin
unbekannt. Diese Arbeit enthüllt einen neuartigen molekularen Mechanismus, welcher
keine Dissoziation des NTF-CTF Komplexes benötigt, um eine Freisetzung des TA
und damit eine Aktivierung des aGPCR zu gewährleisten. Mittels der Einbringung von
bioorthogonalen Markierungen in rezeptorsignalisierungs-relevante Bereiche des TA
von diversen aGPCRs, wurde gezeigt, dass dieser innerhalb der intakten GAIN
Domäne freizugänglich vorliegt. Dies lässt auf eine strukturelle Flexibilität der GAIN
Domäne schließen, welche eine Rezeptoraktivierung unabhängig von der NTF-CTF
Dissoziation erlaubt, wie sie auch bei spaltungsdefizienten aGPCR Varianten
vorzufinden ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass sich die zelluläre
Lokalisation und die Konformation der 7TM Domäne abhängig vom Aktivitätszustand
des aGPCR ist, was wiederrum daraufhin deutet, dass der TA über die Interaktion mit
der 7TM Domäne eine Konformationsänderung vermittelt, welche letztendlich die
Rezeptoraktivität reguliert. Zudem zeigten biochemische Analysen, dass neben der
GAIN Domänen-vermittelten Autoproteolyse des humanen aGPCRs CD97
(ADGRE5/E5) weitere proteolytische Spaltungen innerhalb des Rezeptors stattfinden.
Dies deutet daraufhin, dass aGPCRs Spaltungskaskaden durchlaufen, welche über
die autoproteolytischen Reaktion der GAIN Domäne initialisiert werden. Dadurch kann
angenommen werden, dass aGPCRs zusätzlichen proteolytischen Ereignissen unterliegen. Schlussendlich konnte mittels diverser Markierungsverfahren die
konstitutive Internalisierung des NTF und des CTF von E5 nachgewiesen werden. Es
war möglich beide Fragmente unabhängig voneinander zu markieren und deren
subzelluläre Lokalisation in vitro zu verfolgen. Zusammenfassend tragen die
gewonnen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden
molekularen Mechanismen in Bezug auf Aktivität und Signalübertragung von aGPCRs
bei.
|
2 |
Activation kinetics of G-protein-coupled receptors / Aktivierungskinetik von G-Protein-gekoppelten RezeptorenGrushevskyi, Yevgenii January 2022 (has links) (PDF)
G-protein-coupled receptors (GPCRs) are key biological switches that transmit both internal and external stimuli into the cell interior. Among the GPCRs, the “light receptor” rhodopsin has been shown to activate with a re-arrangement of the transmembrane helix bundle within ≈1 ms, while all other receptors are thought to become activated in subsecond range at saturating concentrations. Here we investigate activation kinetics of a dimeric GPCR, the metabotropic glutamate receptor-1 (mGluR1), and several class A GPCRs, as muscarinic receptor 3 (M3R), adrenergic (α2aAR and β1R) and opioid (µOR) receptors. We first used UV-light-triggered uncaging of glutamate in intact cells. Sub-millisecond Förster resonance energy transfer recordings between labels at intracellular receptor sites were used to record conformational changes in the mGluR1. At millimolar ligand concentrations the initial rearrangement between the mGluR1 subunits occurs at a speed of τ1≈1-2 ms. These rapid changes were followed by significantly slower conformational changes in the transmembrane domain (τ2≈20 ms). We further characterized novel photoswitchable negative allosteric modulators for mGluR1, which bind to its transmembrane core and block the conformational change as well as the downstream signaling. Effects of the compounds were quantified in pharmacological cell assays in the dark and using UV and green light illumination. We finally develop a framework for image-based kinetic analysis of GPCRs which allowed us to measure activation kinetics of several prototypical class A GPCRs and to discover membrane heterogeneities of GPCR activation. It appears that GPCR activation signal is not only dependent on the amount of activated receptors, but also has some level of correlation with the local density of activated receptors. / G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Familie der membranständigen Proteine, welche sowohl interne als auch externe Stimulationen in den intrazellulären Raum weiterleiten und somit in Eukaryonten ein breites Spektrum an physiologischen Prozessen regulieren.
Innerhalb der GPCRs konnte für den „Lichtrezeptor“ Rhodopsin gezeigt werden, dass dessen Aktivierung, welche eine räumliche Umorientierung der Transmembrandomänen beinhaltet, innerhalb von einer Millisekunde erfolgt, wohingegen angenommen wurde, dass die meisten anderen dieser Rezeptoren wesentlich langsamer, im Sekundenbereich, aktiviert werden.
Die vorliegende Arbeit ist auf die Aktivierungskinetiken eines typisch- dimerischen Rezeptors, nämlich dem metabotrobischen Glutamat- rezeptor 1(mGluR1), sowie einige Klasse-A GPCRs fokussiert, darunter befinden sich sowohl der muskarinische M3-Rezeptor, die adrenergen α2A- und β1-Rezeptoren als auch der μ-opioid Rezeptor.
Wir nutzten zunächst durch UV-Licht aktivierbares Glutamat auf intakten Zellen. Hierbei erfolgte, unter Verwendung von Sättigungskonzentrationen, die Umorganisation der mGluR1- Untereinheiten innerhalb von ein bis zwei Millisekunden. Diesen Änderungen folgte eine signifikant langsamere Konformationsänderung von 20 Millisekunden in den Transmembrandomänen.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von neuen, durch Licht schaltbaren, negativen allosterischen Modulatoren des mGluR1-Rezeptors. Für diese konnte
gezeigt werden, dass sie unter bestimmten Belichtungsbedingungen im Mittelpunkt der Transmembrandomänen binden und dadurch sowohl die Konformationsänderung des Rezeptors als auch dessen weitere Signaltransduktion verhindern.
Zudem entwickelten wir ein Systemumfeld zur bildbasierten Analyse von GPCR-Kinetiken, welches es uns erlaubte die Aktivierungskinetiken einiger exemplarischer Klasse A GPCRs zu messen und heterogene Aktivierungskinetiken von GPCRs auf Zellmembranen zu entdecken.
Die Resultate dieser Arbeit legen Nahe, dass Aktivierungs- Signale von GPCRs nicht nur von der Menge der aktivierten Rezeptoren abhängen, sondern zusätzlich auch zu einem gewissen Grad mit der lokalen Dichte von aktivierten Rezeptoren korrelieren.
|
3 |
Localization and Trafficking of CXCR4 and CXCR7 / Lokalisation und Verteilung von CXCR4 und CXCR7İşbilir, Ali January 2022 (has links) (PDF)
G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest class of membrane proteins, and are the master components that translate extracellular stimulus into intracellular signaling, which in turn modulates key physiological and pathophysiological processes. Research within the last three decades suggests that many GPCRs can form complexes with each other via mechanisms that are yet unexplored. Despite a number of functional evidence in favor of GPCR dimers and oligomers, the existence of such complexes remains controversial, as different methods suggest diverse quaternary organizations for individual receptors. Among various methods, high resolution fluorescence microscopy and imagebased fluorescence spectroscopy are state-of-the-art tools to quantify membrane protein oligomerization with high precision. This thesis work describes the use of single molecule fluorescence microscopy and implementation of two confocal microscopy based fluorescence fluctuation spectroscopy based methods for characterizing the quaternary organization of two class A GPCRs that are important clinical targets: the C-X-C type chemokine receptor 4 (CXCR4) and 7 (CXCR7), or recently named as the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3). The first part of the results describe that CXCR4 protomers are mainly organized as monomeric entities that can form transient dimers at very low expression levels allowing single molecule resolution. The second part describes the establishment and use of spatial and temporal brightness methods that are based on fluorescence fluctuation spectroscopy. Results from this part suggests that ACKR3 forms clusters and surface localized monomers, while CXCR4 forms increasing amount of dimers as a function of receptor density in cells. Moreover, CXCR4 dimerization can be modulated by its ligands as well as receptor conformations in distinct manners. Further results suggest that antagonists of CXCR4 display distinct binding modes, and the binding mode influences the oligomerization and the basal activity of the receptor: While the ligands that bind to a “minor” subpocket suppress both dimerization and constitutive activity, ligands that bind to a distinct, “major” subpocket only act as neutral antagonists on the receptor, and do not modulate neither the quaternary organization nor the basal signaling of CXCR4. Together, these results link CXCR4 dimerization to its density and to its activity, which may represent a new strategy to target CXCR4. / G protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Klasse der Membranproteine und sind entscheidend an der Übersetzung extrazellulärer Reize in intrazelluläre Signale beteiligt, welche wiederum unzählige physiologische und pathophysiologische Prozesse regulieren. Die Forschungsergebnisse der letzten drei Jahrzehnte deutet darauf hin, dass viele GPCRs mittels noch weitgehend unbekannter Mechanismen miteinander Komplexe bilden können. Trotz vielfältiger Beobachtungen, die für die funktionelle Relevanz von GPCR-Dimeren und -Oligomeren sprechen, ist deren Existenz dennoch weiterhin umstritten, vor allem da verschiedene Methoden auf unterschiedliche quaternäre Anordnungen derselben Rezeptoren hinweisen. Von den derzeit verfügbaren Methoden zur genauen Untersuchung der GPCR Dimerisierung/-Oligomerisierung, stellen die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie sowie die bildbasierte Fluoreszenzspektroskopie die Techniken der Wahl dar. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die Anwendung der Einzelmolekül Fluoreszenzmikroskopie sowie zweier konfokalmikroskopischer
Methoden zur Messung der Fluoreszenzfluktuation, mit deren Hilfe die quaternäre Anordnung zweier klinisch hochattraktiver Klasse A GPCRs untersucht wurde: der C-X-C Typ Chemokinrezeptoren 4 (CXCR4) und 7 (CXCR7), letzterer auch bekannt als atypischer Chemokinrezeptor 3 (ACKR3). Der erste Teil der Ergebnisse legt anhand Untersuchungen an einzelnen Molekülen dar, dass CXCR4 überwiegend in Form monomerer Einheiten auftritt, die bei sehr geringen Expressionsleveln kurzlebige Dimere bilden können. Der zweite Teil beschreibt die Etablierung und Anwendung räumlicher und zeitlicher Brillanzmethoden, die auf der spektroskopischen Untersuchung der Fluoreszenzfluktuation beruhen. Die Ergebnisse dieses Abschnitts deuten darauf hin, dass ACKR3 sowohl in Form beständiger Rezeptor-Cluster, und monomere Einheit an der Oberfläche lebender Zellen auftritt. CXCR4 ist bei zunehmender Rezeptordichte hingegen vermehrt in Form von Dimeren zu finden. Zudem kann die Dimerisierung von CXCR4 von dessen Liganden, als auch von der drei dimensionalen Anordnung der Rezeptorteilstrukturen (Rezeptorkonformation)auf unterschiedliche Weise reguliert werden. Die weiteren Ergebnisse legen nahe, dass Antagonisten auf unterschiedliche Weise an CXCR4 binden können und dass der jeweilige Bindungsmodus entscheidend für den Einfluss des Liganden auf Oligomerisierung und basale Aktivität von CXCR4 ist: Während Liganden, die an eine kleinere Untertasche des Rezeptors binden, sowohl die Dimerisierung als auch die Basalaktivität unterdrücken, fungieren Verbindungen, die an eine andere, größere Untertasche binden, lediglich als neutrale Antagonisten und zeigen keinerlei Einfluss auf die quaternäre Anordnung und basale Aktivität von CXCR4. Zusammenfassend verknüpfen diese Ergebnisse CXCR4-Dimerisierung mit der Rezeptordichte in Zellen und seiner Aktivität, was die Grundlage für neue Strategien zur phamakologischen Modulation von CXCR4 darstellen könnte.
|
4 |
Modulation of parathyroid hormone 1 receptor (PTH1R) signaling by receptor activity-modifying proteins (RAMPs) / Regulierung der Signalübertragung des Parathormon 1-Rezeptors (PTH1R) durch Rezeptoraktivitäts-modifizierende Proteine (RAMPs)Nemec, Katarina January 2023 (has links) (PDF)
The receptor activity-modifying proteins (RAMPs) are ubiquitously expressed membrane proteins that interact with several G protein-coupled receptors (GPCRs), the largest and pharmacologically most important family of cell surface receptors. RAMPs can regulate GPCR function in terms of ligand-binding, G-protein coupling, downstream signaling, trafficking, and recycling. The integrity of their interactions translates to many physiological functions or pathological conditions.
Regardless of numerous reports on its essential importance for cell biology and pivotal role in (patho-)physiology, the molecular mechanism of how RAMPs modulate GPCR activation remained largely elusive.
This work presents new insights that add to the common understanding of the allosteric regulation of receptor activation and will help interpret how accessory proteins - RAMPs - modulate activation dynamics and how this affects the fundamental aspects of cellular signaling. Using a prototypical class B GPCR, the parathyroid hormone 1 receptor (PTH1R) in the form of advanced genetically encoded optical biosensors, I examined RAMP's impact on the PTH1R activation and signaling in intact cells. A panel of single-cell FRET and confocal microscopy experiments as well canonical and non-canonical functional assays were performed to get a holistic picture of the signaling initiation and transduction of that clinically and therapeutically relevant GPCR. Finally, structural modeling was performed to add molecular mechanistic details to that novel art of modulation.
I describe here that RAMP2 acts as a specific allosteric modulator of PTH1R, shifting PTH1R to a unique pre-activated state that permits faster activation in a ligand-specific manner. Moreover, RAMP2 modulates PTH1R downstream signaling in an agonist-dependent manner, most notably increasing the PTH-mediated Gi3 signaling sensitivity and kinetics of cAMP accumulation. Additionally, RAMP2 increases PTH- and PTHrP-triggered β-arrestin2 recruitment to PTH1R and modulates cytosolic ERK1/2 phosphorylation. Structural homology modeling shows that structural motifs governing GPCR-RAMP interaction originate in allosteric hotspots and rationalize functional modulation. Moreover, to interpret the broader role of RAMP's modulation in GPCRs pharmacology, different fluorescent tools to investigate RAMP's spatial organization were developed, and novel conformational biosensors for class B GPCRs were engineered. Lastly, a high throughput assay is proposed and prototyped to expand the repertoire of RAMPs or other membrane protein interactors.
These data uncover the critical role of RAMPs in GPCR activation and signaling and set up a novel platform for studying GPCR modulation. Furthermore, these insights may provide a new venue for precise modulation of GPCR
function and advanced drug design. / G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte und pharmakologisch wichtigste Familie von
Zelloberflächenrezeptoren, die zahlreiche (patho-)physiologische Prozesse im menschlichen Körper steuern. GPCRs
übertragen während des Rezeptoraktivierungsprozesses extrazelluläre Signale in das Zellinnere, wo durch die
extrazelluläre Stimulation Konformationsänderungen des Rezeptorkerns auslöst und die Bindung intrazellulärer
Bindungspartner – G Proteine, G Protein-gekoppelte Rezeptorkinase und Arrestine - ermöglicht. Es handelt sich
also um einen kritischen Prozess in der Signaltransduktion, der durch einige endogene Moleküle wie Ionen, Lipide
oder andere Proteine moduliert werden kann und Auswirkungen auf nachgeschaltete Signalkaskaden hat.
GPCRs bilden gewebeabhängige Oligomere mit ihren interagierenden Partnern, Rezeptor-Aktivitäts-modifizierende
Proteinen (RAMPs), ubiquitär exprimierten Membranproteinen. Bekannt ist, dass sie die Ligandenbindung, die G-
Protein-Kopplung, die nachgeschaltete Signalisierung, das Trafficking und das Recycling einiger GPCRs modulieren.
Ihre Rolle im kritischsten Prozess der Signaltransduktion - der Rezeptoraktivierung - wurde jedoch nur begrenzt
erforscht.
Anhand des physiologisch und therapeutisch wichtigen Parathormon-Rezeptors (PTH1R), einem GPCR der Klasse B,
wurden die Modulationseffekte von RAMPs auf den Prozess der Rezeptoraktivierung und ihre Folgen für die
nachgeschaltete Signalübertragung analysiert. Hierzu wurden verschiedene optische Biosensoren zur Messung der
Aktivierung des PTH1R und seiner Signalkaskade entwickelt und in verschiedenen Versuchsanordnungen
eingesetzt, mit dem Ziel einen holistischen Blick auf die Interaktion zwischen PTH1R und RAMPs und ihre
funktionellen Auswirkungen zu erhalten.
Die Interaktion zwischen PTH1R und RAMPs erwies sich als besonders ausgeprägt für RAMP2, und RAMP2 zeigte
eine spezifische allosterische Modulation der PTH1R-Konformation, sowohl im basalen als auch im Liganden-
aktivierten Zustand. Ein einzigartiger voraktivierter oder (meta-stabiler) Zustand ermöglichte eine schnellere
Rezeptoraktivierung auf Liganden-spezifische Weise. Außerdem beeinflusste RAMP2 die G Protein- und Nicht-G
Protein-vermittelte Signalübertragung indem es die PTH-vermittelte Gi3-Signalempfindlichkeit und die Kinetik der
cAMP-Akkumulation modulierte. Weiterhin erhöhte RAMP2 die Menge der β-Arrestin2-Rekrutierung an PTH1R auf
Liganden-spezifische Weise. Dies könnte mit einer erhöhten zytosolischen ERK-Menge zusammenhängen, die hat
sich von der nukleären ERK-Phosphorylierung unterscheidet. Um einen molekularen Mechanismus für die
vorgestellten Ergebnisse vorzuschlagen, wurden mehrere strukturelle Modelle entwickelt und analysiert.
Diese Arbeit liefert den Beweis, dass RAMP die GPCR-Aktivierung mit funktionellen Auswirkungen auf die zelluläre
Signalübertragung reguliert. Die Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit zellspezifischen Koexpressionsmustern
interpretiert werden und können zur Entwicklung von fortschrittlichen Therapeutika positiv beitragen. Da GPCRs
praktisch alle Zellfunktionen koordinieren und seit jeher wichtigen Angriffspunkten für Medikamente sind, tragen
die vorgestellten Erkenntnisse zum universellen Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die den
menschlichen Körper orchestrieren.
|
5 |
The physiological relevance of the G protein-coupled receptor P2Y14Meister, Jaroslawna 01 December 2014 (has links) (PDF)
UDP-sugars were identified as extracellular signaling molecules, assigning a new function to these compounds in addition to their well-defined role in intracellular substrate metabolism and storage. Previously regarded as an orphan receptor, the G protein-coupled receptor (GPCR) P2Y14 (GPR105) was found to bind extracellular UDP and UDP-sugars. Little is known about the physiological functions of this GPCR. To study its physiological role a gene-deficient
(KO) mouse strain expressing the bacterial LacZ reporter gene was used to monitor the physiological expression pattern of P2Y14. P2Y14 is mainly expressed in pancreas and salivary glands and in subpopulations of smooth muscle cells of the gastrointestinal tract,
bronchioles, blood vessels and uterus. Among other phenotypical differences KO mice showed a significantly impaired glucose tolerance following oral and intraperitoneal glucose application. An unchanged insulin tolerance points towards an altered pancreatic islet function. Transcriptome analysis of pancreatic islets showed that P2Y14 deficiency
significantly changed expression of components involved in insulin secretion. Insulin secretion tests revealed a reduced insulin release from P2Y14-deficient islets highlighting P2Y14 as a previously unappreciated modulator of proper insulin secretion.
|
6 |
Molekulare Charakterisierung und Identifizierung eines Aktivierungsmechanismus von Adhesion-G-Protein-gekoppelten RezeptorenSchön, Julia 17 December 2015 (has links) (PDF)
Die Familie der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) stellt die zweitgrößte Gruppe der GPCR dar. Ein strukturelles Charakteristikum der aGPCR ist der modular aufgebaute N-Terminus, welcher eine GPCR-proteolytic site (GPS) mit einem konservierten Spaltungsmotiv enthält. Trotz der hohen medizinischen Relevanz dieser Rezeptorgruppe sind für die meisten der 33 humanen Vertreter der aGPCR bis heute weder Funktion noch endogener Agonist bekannt. Um sie jedoch zukünftig als potentielle Angriffspunkte diagnostisch und therapeutisch nutzen zu können, kommt der umfassenden Charakterisierung der aGPCR hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen und Signaltransduktion große Bedeutung zu.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine kurze Peptidsequenz im C-terminalen Bereich des N-Terminus (Stachel-Sequenz genannt) als gebundener Agonist der aGPCR fungiert und G-Protein-vermittelte Signalwege aktiviert. Dazu wurden ortsgerichtete Mutagenesestudien durchgeführt und synthetisierte Peptide analog der Stachel-Sequenz der aGPCR in funktionellen second messenger-Akkumulationsexperimenten getestet. Während die Untersuchungen des Aktivierungsmechanismus an den bereits initial charakterisierten Rezeptoren GPR126 und GPR133 unternommen wurden, konnten 11 weitere aGPCR hinsichtlich ihrer Kopplung an G-Proteine, Expression und ihres autoproteolytischen Spaltungsverhaltens in vitro analysiert werden. Dabei ist herauszustellen, dass alle untersuchten aGPCR an das Gs-Protein koppeln. GPR115, GPR116 und GPR128 zeigten sogar eine multiple Kopplung an Gs-, Gq- und Gi-Proteine. Weiterhin konnte dargelegt werden, dass die Zerstörung hoch konservierter Disulfidbrückenbindungen innerhalb der GPS durch Aminosäuresubstitution in einer konstitutiven Aktivierung des Wildtyp-Rezeptors resultiert.
|
7 |
Molekulare Charakterisierung und Identifizierung eines Aktivierungsmechanismus von Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren: Molekulare Charakterisierung und Identifizierung eines Aktivierungsmechanismus von Adhesion-G-Protein-gekoppelten RezeptorenSchön, Julia 24 February 2015 (has links)
Die Familie der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) stellt die zweitgrößte Gruppe der GPCR dar. Ein strukturelles Charakteristikum der aGPCR ist der modular aufgebaute N-Terminus, welcher eine GPCR-proteolytic site (GPS) mit einem konservierten Spaltungsmotiv enthält. Trotz der hohen medizinischen Relevanz dieser Rezeptorgruppe sind für die meisten der 33 humanen Vertreter der aGPCR bis heute weder Funktion noch endogener Agonist bekannt. Um sie jedoch zukünftig als potentielle Angriffspunkte diagnostisch und therapeutisch nutzen zu können, kommt der umfassenden Charakterisierung der aGPCR hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen und Signaltransduktion große Bedeutung zu.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine kurze Peptidsequenz im C-terminalen Bereich des N-Terminus (Stachel-Sequenz genannt) als gebundener Agonist der aGPCR fungiert und G-Protein-vermittelte Signalwege aktiviert. Dazu wurden ortsgerichtete Mutagenesestudien durchgeführt und synthetisierte Peptide analog der Stachel-Sequenz der aGPCR in funktionellen second messenger-Akkumulationsexperimenten getestet. Während die Untersuchungen des Aktivierungsmechanismus an den bereits initial charakterisierten Rezeptoren GPR126 und GPR133 unternommen wurden, konnten 11 weitere aGPCR hinsichtlich ihrer Kopplung an G-Proteine, Expression und ihres autoproteolytischen Spaltungsverhaltens in vitro analysiert werden. Dabei ist herauszustellen, dass alle untersuchten aGPCR an das Gs-Protein koppeln. GPR115, GPR116 und GPR128 zeigten sogar eine multiple Kopplung an Gs-, Gq- und Gi-Proteine. Weiterhin konnte dargelegt werden, dass die Zerstörung hoch konservierter Disulfidbrückenbindungen innerhalb der GPS durch Aminosäuresubstitution in einer konstitutiven Aktivierung des Wildtyp-Rezeptors resultiert.
|
8 |
The physiological relevance of the G protein-coupled receptor P2Y14Meister, Jaroslawna 04 November 2014 (has links)
UDP-sugars were identified as extracellular signaling molecules, assigning a new function to these compounds in addition to their well-defined role in intracellular substrate metabolism and storage. Previously regarded as an orphan receptor, the G protein-coupled receptor (GPCR) P2Y14 (GPR105) was found to bind extracellular UDP and UDP-sugars. Little is known about the physiological functions of this GPCR. To study its physiological role a gene-deficient
(KO) mouse strain expressing the bacterial LacZ reporter gene was used to monitor the physiological expression pattern of P2Y14. P2Y14 is mainly expressed in pancreas and salivary glands and in subpopulations of smooth muscle cells of the gastrointestinal tract,
bronchioles, blood vessels and uterus. Among other phenotypical differences KO mice showed a significantly impaired glucose tolerance following oral and intraperitoneal glucose application. An unchanged insulin tolerance points towards an altered pancreatic islet function. Transcriptome analysis of pancreatic islets showed that P2Y14 deficiency
significantly changed expression of components involved in insulin secretion. Insulin secretion tests revealed a reduced insulin release from P2Y14-deficient islets highlighting P2Y14 as a previously unappreciated modulator of proper insulin secretion.
|
9 |
Mechanismen der Immunmodulation durch die Genprodukte US11 und US28 des humanen ZytomegalievirusDroese, Jana 08 November 2005 (has links)
Humane Zytomegalieviren (HCMV) etablieren nach einer Primärinfektion eine lebenslange latente oder persistierende Infektion. Es wird allgemein angenommen, daß hieran die Manipulation der humanen Immunantwort durch das Virus beteiligt ist. Hierzu zählen die Hemmung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen durch das Genprodukt US11 und die Beeinträchtigung der Leukozytenwanderung durch die Hemmung des Chemokinsystems durch den Chemokinrezeptor US28. Die Effizienz der US11-vermittelten Hemmung der T-Zell-Aktivierung wurde in einem rekombinanten Modell zur MHC-Klasse-I-vermittelten T-Zell-Aktivierung untersucht. Obwohl die Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle durch US11 in dendritische Zellen (DCs) um bis zu 60% vermindert war, konnte keine Hemmung der T-Zell-Proliferation beobachtet werden. US28 ist der einzige funktionelle Rezeptor für die inflammatorischen Chemokine MCP-1, MCP-3, RANTES, MIP-1(, MIP-1( sowie Fraktalkine. Er kann sowohl Liganden-abhängig die Aktivierung von MAPK als auch die konstitutive Aktivierung von NF-(B vermitteln. In der vorliegenden Arbeit konnte mit Hilfe einer Rezeptormutante der Argininrest an Position 129 des DRY-Motivs als Voraussetzung für die Aktivierung der Signalwegen identifiziert werden. Ferner bewirkt die Expression des US28-Rezeptors die Entfernung inflammatorischer Chemokine aus der Umgebung infizierter Zellen. Molekulare Grundlage der Liganden-Depletion stellt die Endozytose des US28-Liganden-Komplexes dar. Es konnte gezeigt werden, daß der US28-Rezeptor eine Umlagerung von (-Arrestin-Molekülen in Vesikel vermittelt, jedoch unabhängig von Arrestin-Molekülen endozytiert wird. Die Endozytose des US28-Rezeptors war abhängig von der GTP-ase Dynamin. Ebenso konnte die Beteiligung des Lipid-Raft-Weges an der US28-Endozytose gezeigt werden. Die Hemmung des Clathrinweges bewirkte jedoch eine zweifach stärkere Verminderung der US28-Endozytose, kann der Clathrin-abhängige Weg als der Hauptweg der US28-Endozytose angesehen werden. / Primary infections of the human cytomegalovirus (HCMV) are followed by a lifelong infection in the state of latency or persistence. It is believed that the virus employs a number of immunomodulatory mechanisms to establish latent infections. Among these are the inhibition of cytotoxic CD8+ T-cells by US11 and the impairment of leukocyte migration by US28. The potency of US11 to mediate the inhibition of T-cell activation was analysed in a model of MHC class I mediated T-cell activation. Surface expression of MHC class I molecules was reduced by 60 % after expression of US11 in murine dendritic cells. In contrast, there was no reduction in the capacity of the dendritic cells to induce T-cell proliferation. The US28 gene product has been characterized as a functional receptor for the inflammatory chemokines RANTES, MCP-1, MCP-3, MIP-1?? MIP-1? and fractalkine.Upon ligand stimulation US28 mediates the activation of MAPK and additionally a constitutive activation of NF-?B. By generating site directed receptor mutant it was shown that the arginine at position 129 represents a structural requirement for both the ligand-induced and the constitutive signaling by US28. Moreover, it was suggested that the US28 dependent sequestration of chemokines from the environment of infected cells hinders leukocytes from the recruitment to sites of viral infection. A molecular mechanism for the ligand depletion is provided by the endocytosis of US28-ligand complexes. Studies revealed that US28 expression induced a redistribution of ?-arrestin molecules into vesicular structures but was dispensable for the endocytosis of the US28 receptor. However, US28 internalization was dependent on the small GTPase dynamin and by impaired receptor endocytosis after inhibition of the lipid raft pathway. Since inhibition of the clathrin dependent pathway resulted in a two-fold stronger reduction of US28 endocytosis, the clathrin-dependent pathway can be considered as the major route of US28 endocytosis.
|
10 |
Structure, Function and Dynamics of G-Protein coupled ReceptorsEichler, Stefanie 09 February 2012 (has links) (PDF)
Understanding the function of membrane proteins is crucial to elucidate the molecular mechanisms by which transmembrane signaling based physiological processes,i. e., the interactions of extracellular ligands with membrane-bound receptors, are regulated.
In this work, synthetic transmembrane segments derived from the visual photoreceptor rhodopsin, the full length system rhodopsin and mutants of opsin are used to study physical processes that underlie the function of this prototypical class-A G-protein coupled Receptor.
The dependency of membrane protein hydration and protein-lipid interactions on side chain charge neutralization is addressed by fluorescence spectroscopy on synthetic transmembrane segments in detergent and lipidic environment constituting transmembrane segments of rhodopsin in the membrane. Results from spectroscopic studies allow us to construct a structural and thermodynamical model of coupled protonation of the conserved ERY motif in transmembrane helix 3 of rhodopsin and of helix restructuring in the micro-domain formed at the protein/lipid water phase boundary.
Furthermore, synthesized peptides and full length systems were studied by time resolved FTIR-Fluorescence Cross Correlation Hydration Modulation, a technique specifically developed for the purpose of this study, to achieve a full prospect of time-resolved hydration effects on lipidic and proteinogenic groups, as well as their interactions. Multi-spectral experiments and time-dependent analyses based on 2D correlation where established to analyze large data sets obtained from time-resolved FTIR difference spectra and simultaneous static fluorescence recordings. The data reveal that lipids play a mediating role in transmitting hydration to the subsequent membrane protein response followed by water penetration into the receptor structure or into the sub-headgroup region in single membrane-spanning peptides carrying the conserved proton uptake site (monitored by the fluorescence emission of hydrophobic buried tryptophan).
Our results support the assumption of the critical role of the lipid/water interface in membrane protein function and they prove in particular the important influence of electrostatics, i. e., side chain charges at the phase boundary, and hydration on that function. / Für die Aufklärung der molekularen Wirkungsweise von physiologischen, auf Signaltransduktion, d. h. dem Zusammenspiel von extrazellulären Reizen und membrangebundenen Rezeptoren, beruhenden Prozessen ist das Verständnis der Funktion von Membranproteinen unerlässlich.
In dieser Arbeit werden von Rhodopsin abgleitete, synthetische transmembrane Segmentpeptide, Opsin-Mutanten und der vollständige Photorezeptor Rhodopsin untersucht, um die physikalischen Prozesse zu beleuchten, die der Funktionen dieses prototypischen Klasse-A G-Protein gekoppelten Rezeptors zugrunde liegen.
Die Abhängigkeit der Membranprotein-Hydratation und der Lipid-Protein-Wechselwirkung von der Ladung einer Aminosäuren-Seitenkette wird erforscht. Hierzu werden synthetische, transmembrane Segmentpeptide in Lipid und Detergenz, als Modell transmembraner Segmente von Rhodopsin in der Membran mittels Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Aus den erhaltenen Ergebnissen wird ein thermodynamisches und strukturelles Modell hergeleitet, welches die Kopplung der Protonierung des hochkonservierten ERY-Motivs in Transmembranhelix 3 von Rhodopsin an die Restrukturierung der Helix in der Mikroumgebung der Lipid-Wasser-Phasengrenze erklärt. Des Weiteren werden sowohl die Segementpeptide als auch die vollständigen Systeme Opsin und Rhodopsin mittels zeitaufgelöster FTIR-Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Hydratations-Modulation untersucht. Diese Technik wurde eigens zur Aufklärung von zeitabhängigen Hydratationseffekten auf Lipide und Proteine oder Peptide entwickelt. Dabei werden zeitaufgelöste FTIR Differenz-Spektren und gleichzeitig statische Fluoreszenzsignale aufgenommen und diese zeitabhängigen multispektralen Datensätze mittels 2D Korrelation analysiert. Die Auswertung der Experimente enthüllt einen sequentiellen Hydratationsprozess. Dieser beginnt mit der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen an der Carbonylgruppe des Lipids, gefolgt von Strukturänderungen der Transmembranproteine und abgeschlossen durch das Eindringen von Wasser in das Proteininnere. Letzteres wird nachgewiesen durch die Fluoreszenz von Tryptophan im hydrophoben Peptid- oder Proteininneren.
Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Annahme, dass Lipid-Protein-Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle in der Funktion von Membranproteinen spielen und das insbesondere Elektrostatik, in Form von Ladungen an der Phasengrenze, und die Hydratisierung einen kritischen Einfluss auf diese Funktion haben.
|
Page generated in 0.0498 seconds