Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen einer kooperativen Promotion zwischen der TU Dresden und der Hochschule Mittweida angefertigt. In dieser werden neuartige, computerorientierte Ansätze für die Analyse von Membranproteinen vorgestellt. Membranproteine sind von essentieller Bedeutung für eine Vielzahl biologischer Prozesse innerhalb eines Organismus und stellen wichtige Zielmoleküle für eine breite Palette von Pharmazeutika dar. Ihre Sequenzen liefern wertvolle und teilweise noch nicht entschlüsselte Informationen über die dreidimensionale Struktur und funktionale Eigenschaften. Innerhalb der Proteomik und Genomik stellen Analysen an Membranproteinstrukturen einen wichtigen Teil für das Verständnis komplexer biologischer Prozesse dar. Im Zuge von Untersuchungen an Membranproteinen konnte eine Vielzahl kurzer wiederkehrender Muster, sogenannte Motive, in den Sequenzen von Membranproteinen beobachtet werden. Diese Motive unterstützen das Verständnis, wie sich Membranproteine in der Zellmembran falten. Im Fokus dieser Arbeit stehen derartige Sequenzmotive. Innerhalb von drei Projekten bilden ausschließlich sequenzmotivbasierte Ansätze die Grundlage für nähere Untersuchungen an Membranproteinstrukturen. Letztendlich liefern die in dieser Arbeit postulierten Methoden wertvolle Erkenntnisse über die strukturelle und funktionelle Rolle von Sequenzmotiven, auf deren Grundlage dazu beigetragen wird, den komplexen Aufbau von Membranproteinen besser verstehen zu können. Generell wird die Zusammenführung proteomischer und mutagener Informationen intensiviert. Nicht zuletzt wird dazu beigetragen, die in dieser Arbeit zusammengetragenen Ergebnisse, für die Planung von in vitro Experimenten sowie weiterführenden Arbeiten auf dem Gebiet der Membranproteinanalyse, der Wissenschaft zur Verfügung zu stellen. / The present work was written as part of a cooperative doctorate between the TU Dresden and the University of Applied Sciences Mittweida. In the doctoral thesis, novel, computer-oriented approaches for the analysis of membrane proteins are presented. Membrane proteins are essential for many cellular processes and are important targets for a wide range of pharmaceuticals. Their sequences provide valuable and partly not yet decoded information about their three-dimensional structure and functional characteristics. The analysis of membrane proteins is an important part for the understanding of complex biological processes in the context of proteomics and genomics. Research of membrane proteins revealed a large number of short, distinct sequence motifs. The motifs found so far support the understanding of the folded protein in the Membrane environment. In this dissertation, in three different approaches it is shown how the output of sequence motif-based methods can support the understanding of structural and functional properties of membrane proteins. In general, the junction of proteomic and mutagenic information is intensified. Last but not least, the results of this work are made available for the planning of in vitro experiments as well as for further works in the field of membrane Protein analysis.

Relatively little is known about the folding and stability of membrane proteins. Conventional thermal or chemical unfolding techniques probe the average behavior of large numbers of molecules and thus cannot resolve co-existing minor and major unfolding pathways and intermediates. Here, I applied single-molecule force measurements based on an atomic force microscope (AFM) to characterize the stability of the membrane protein bacteriorhodopsin (BR). In these mechanical unfolding experiments, an external pulling force played the role of the denaturant and lead to unfolding of the three-dimensional structure of individual proteins. It was found that single BRs unfold step-wise in a well-defined sequence of stable intermediates and in different unfolding pathways. Although single [alpha]-helices were sufficiently stable to unfold in individual steps they also exhibited certain probabilities to unfold in pairs. These observations support the "two-stage" and the "helical-hairpin" model of membrane protein folding. Dynamic force measurements showed that [alpha]-helices and helical hairpins are relatively rigid structures, which are stabilized by narrow energy barriers and have stabilities between 100-10?000 seconds. These forced unfolding experiments were complemented with the development of new force measurement techniques. It is demonstrated that hydrodynamic effects need to be considered to obtain more complete kinetic pictures of single molecules. In addition, two force spectroscopy approaches to measure the complex visco-elastic response of single molecules are presented and applied to BR. These experiments revealed that the unfolding patterns of single proteins are dominated by purely elastic polypeptide extension and determined the dissipative interactions associated with the unfolding of single [alpha]-helices. In addition, it was found that kinks result in a reduced unfolding cooperativity of [alpha]-helices.

Understanding the function of membrane proteins is crucial to elucidate the molecular mechanisms by which transmembrane signaling based physiological processes,i. e., the interactions of extracellular ligands with membrane-bound receptors, are regulated. In this work, synthetic transmembrane segments derived from the visual photoreceptor rhodopsin, the full length system rhodopsin and mutants of opsin are used to study physical processes that underlie the function of this prototypical class-A G-protein coupled Receptor. The dependency of membrane protein hydration and protein-lipid interactions on side chain charge neutralization is addressed by fluorescence spectroscopy on synthetic transmembrane segments in detergent and lipidic environment constituting transmembrane segments of rhodopsin in the membrane. Results from spectroscopic studies allow us to construct a structural and thermodynamical model of coupled protonation of the conserved ERY motif in transmembrane helix 3 of rhodopsin and of helix restructuring in the micro-domain formed at the protein/lipid water phase boundary. Furthermore, synthesized peptides and full length systems were studied by time resolved FTIR-Fluorescence Cross Correlation Hydration Modulation, a technique specifically developed for the purpose of this study, to achieve a full prospect of time-resolved hydration effects on lipidic and proteinogenic groups, as well as their interactions. Multi-spectral experiments and time-dependent analyses based on 2D correlation where established to analyze large data sets obtained from time-resolved FTIR difference spectra and simultaneous static fluorescence recordings. The data reveal that lipids play a mediating role in transmitting hydration to the subsequent membrane protein response followed by water penetration into the receptor structure or into the sub-headgroup region in single membrane-spanning peptides carrying the conserved proton uptake site (monitored by the fluorescence emission of hydrophobic buried tryptophan). Our results support the assumption of the critical role of the lipid/water interface in membrane protein function and they prove in particular the important influence of electrostatics, i. e., side chain charges at the phase boundary, and hydration on that function. / Für die Aufklärung der molekularen Wirkungsweise von physiologischen, auf Signaltransduktion, d. h. dem Zusammenspiel von extrazellulären Reizen und membrangebundenen Rezeptoren, beruhenden Prozessen ist das Verständnis der Funktion von Membranproteinen unerlässlich. In dieser Arbeit werden von Rhodopsin abgleitete, synthetische transmembrane Segmentpeptide, Opsin-Mutanten und der vollständige Photorezeptor Rhodopsin untersucht, um die physikalischen Prozesse zu beleuchten, die der Funktionen dieses prototypischen Klasse-A G-Protein gekoppelten Rezeptors zugrunde liegen. Die Abhängigkeit der Membranprotein-Hydratation und der Lipid-Protein-Wechselwirkung von der Ladung einer Aminosäuren-Seitenkette wird erforscht. Hierzu werden synthetische, transmembrane Segmentpeptide in Lipid und Detergenz, als Modell transmembraner Segmente von Rhodopsin in der Membran mittels Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Aus den erhaltenen Ergebnissen wird ein thermodynamisches und strukturelles Modell hergeleitet, welches die Kopplung der Protonierung des hochkonservierten ERY-Motivs in Transmembranhelix 3 von Rhodopsin an die Restrukturierung der Helix in der Mikroumgebung der Lipid-Wasser-Phasengrenze erklärt. Des Weiteren werden sowohl die Segementpeptide als auch die vollständigen Systeme Opsin und Rhodopsin mittels zeitaufgelöster FTIR-Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Hydratations-Modulation untersucht. Diese Technik wurde eigens zur Aufklärung von zeitabhängigen Hydratationseffekten auf Lipide und Proteine oder Peptide entwickelt. Dabei werden zeitaufgelöste FTIR Differenz-Spektren und gleichzeitig statische Fluoreszenzsignale aufgenommen und diese zeitabhängigen multispektralen Datensätze mittels 2D Korrelation analysiert. Die Auswertung der Experimente enthüllt einen sequentiellen Hydratationsprozess. Dieser beginnt mit der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen an der Carbonylgruppe des Lipids, gefolgt von Strukturänderungen der Transmembranproteine und abgeschlossen durch das Eindringen von Wasser in das Proteininnere. Letzteres wird nachgewiesen durch die Fluoreszenz von Tryptophan im hydrophoben Peptid- oder Proteininneren. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Annahme, dass Lipid-Protein-Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle in der Funktion von Membranproteinen spielen und das insbesondere Elektrostatik, in Form von Ladungen an der Phasengrenze, und die Hydratisierung einen kritischen Einfluss auf diese Funktion haben.