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Yes / Inhibitory GABAB receptors (GABABRs) can down-regulate most excitatory synapses in the CNS by reducing postsynaptic excitability. Functional GABABRs are heterodimers of GABAB1 and GABAB2 subunits and here we show that the trafficking and surface expression of GABABRs is differentially regulated by synaptic or pathophysiological activation of NMDA receptors (NMDARs). Activation of synaptic NMDARs using a chemLTP protocol increases GABABR recycling and surface expression. In contrast, excitotoxic global activation of synaptic and extrasynaptic NMDARs by bath application of NMDA causes the loss of surface GABABRs. Intriguingly, exposing neurons to extreme metabolic stress using oxygen/glucose deprivation (OGD) increases GABAB1 but decreases GABAB2 surface expression. The increase in surface GABAB1 involves enhanced recycling and is blocked by the NMDAR antagonist AP5. The decrease in surface GABAB2 is also blocked by AP5 and by inhibiting degradation pathways. These results indicate that NMDAR activity is critical in GABABR trafficking and function and that the individual subunits can be separately controlled to regulate neuronal responsiveness and survival. / BBSRC, MRC and the European Research Council

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments. / G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest family of therapeutic targets for the treatment of a wide variety of human pathologies. Decades of research have provided an extensive base of knowledge about these fascinating membrane proteins, yet significant advancements in the understanding of the structural and functional details of these important drug targets continue to accumulate to this day. One such area of research in particular that has caused a paradigm shift in the way we conceptualize receptor function is a recently identified phenomenon known as ligand functional selectivity. This concept refers to the numerous observations that the pharmacological activity of a ligand at a given receptor is not always conserved over all possible signalling events engaged by the receptor, often resulting in the selectivity of a ligand to modulate only a subset of the receptor’s signalling repertoire. This model of receptor activity reveals exciting new possibilities for the discovery of safer and more efficacious drugs targeting GPCRs; through the design of drugs specifically targeting the pathway of therapeutic interest without modulating other, uninvolved pathways which could lead to tolerance or adverse effects. This thesis will describe the use of a novel, label-free technique based on cellular impedance to further characterize ligand functional selectivity at GPCRs. By measuring changes in higher-order cellular responses, such as changes in morphology, adhesion and redistribution of macromolecules, this approach provides a means to simultaneously measure the activity of multiple signalling pathways converging on these responses. Using the β2-adrenergic receptor (β2AR) as a model system, we have demonstrated that changes in cellular impedance reflect the activity of multiple signalling events elicited following ligand stimulation of the receptor. Isoproterenol, the prototypical agonist of the β2AR, was found to elicit a dose-dependent impedance response consisting of multiple, discrete features over time, which could be blocked in a competitive manner by the antagonist ICI118,551. Using pathway-selective inhibitors, we were able to dissect the contribution of many of the canonical pathways activated by the β2AR, including Gs- and Gi-dependent signalling, as well as cAMP production and ERK1/2 activation. Furthermore, through the pharmacological dissection of this impedance response, we identified a novel Ca2+ mobilization pathway that contributes to the overall cellular response to β2AR stimulation. In a separate study of the mechanism generating this β2AR-promoted Ca2+ response, we revealed a Gs-dependent transactivation mechanism of the Gq-coupled P2Y11 purinergic receptor. Given the ability of impedance measurements to capture this pleiotropic signalling activity, we then reasoned that ligands exhibiting different signalling profiles should generate distinct impedance signatures. In screening a library of functionally selective compounds targeting the β2AR, we obtained a wide variety of impedance signatures. Through the development of a novel computational approach, we were able to cluster these signatures into five distinct compounds classes, which were highly correlated with signalling profiles of the ligands. In an extension of this approach, we then combined impedance screening with the use of pathway-selective inhibitors to determine if this would provide greater resolution in distinguishing among functionally distinct compounds. By assessing if and how a given signalling pathway contributes to a ligand’s impedance signature, we were able to reveal even more texture among ligands targeting the β2AR. Furthermore, this approach was found to be predictive of the signalling profiles of a library of uncharacterized compounds for the β2AR. This work led to the development of a visualization method to express ligand functional selectivity and revealed potentially novel classes of compounds for the receptor. These compound classes were then validated in human cardiomyocytes, confirming that compounds clustering into different classes produced distinct effects on cardiomyocyte contractility. Altogether, this work demonstrates the ability of cellular impedance to accurately measure functional differences among compounds targeting GPCRs. In providing a representation of the pluridimensionality of GPCR signalling using a single, label-free assay, impedance profiling represents an innovative strategy to assess ligand functional selectivity and may be a valuable addition to future drug discovery campaigns.

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sind Rezeptoren mit 7 Transmembrandomänen. Nach Bindung ihres Liganden werden über die Kopplung von G-Proteinen rezeptorspezifisch Signaltransduktionswege aktiviert. Ein bislang nicht ausreichend verstandener Prozess für die Funktion von GPCR ist deren Oligomerisierung. Für einige GPCR konnte gezeigt werden, dass die Oligomerisierung den Rezeptortransport und/oder die Dynamik der Rezeptoraktivierung moduliert. Dabei ist noch nicht aufgeklärt, ob die entsprechenden GPCR ausschließlich als Oligomere oder in einem bestimmten Monomer-Dimer Verhältnis (M/D) vorliegen und welcher Dynamik dieses Verhältnis unterliegt. In dieser Arbeit wurde die Homo-Oligomerisierung des Endothelin-B-Rezeptors (ETBR), des Vasopressin-V2-Rezeptors (V2R) und der Corticotropin-Releasing-Factor-Rezeptoren Typ 1 (CRF1R) und Typ 2(a) (CRF2(a)R) analysiert. Im Anschluss an diese Untersuchungen wurde das M/D der GPCR bestimmt. Zur Detektion der Protein-Protein Interaktionen wurden die biophysikalischen Methoden Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) und Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS) eingesetzt. Mit Hilfe der FCCS konnte das spezifische M/D der GPCR bestimmt und über FRET ein Unterschied in der Interaktions-Dynamik zwischen den GPCR der Familie 1 (am Bsp. des V2R) und der Familie 2 (am Bsp. des CRF1R) ermittelt werden. Des Weiteren lieferten die genutzten Methoden den Nachweis, dass der zum CRF1R homologe CRF2(a)R ausschließlich als Monomer vorliegt. Zusätzliche Untersuchungen an Signalpeptidmutanten des CRF1R und des CRF2(a)R weisen darauf hin, dass das Pseudosignalpeptid des CRF2(a)R, welches bislang einzigartig in der Superfamilie der GPCR ist, die Oligomerisierung des Rezeptors verhindert. Zusätzlich zu diesen neuen Daten konnte in dieser Arbeit erstmals ein Zusammenhang zwischen Rezeptorinteraktion und G-Protein Selektivität für den CRF1R und den CRF2(a)R festgestellt werden / The heptahelical G protein-coupled receptors (GPCRs) are important drug targets. Following activation by their ligands, they exert their function via the binding of G proteins and activation of specific signal transduction cascades. To date, the functional significance of the oligomerization of GPCRs is not completely understood. For some GPCRs it could be shown that the oligomerization modulates receptor transport and/or the dynamics of receptor activation. Most importantly, it is not clear whether the GPCRs exist exclusively as oligomers or in a certain monomer-dimer ratio (M/D) or whether a given ratio is dynamic. In this work, the homo-oligomerization of the endothelin-B-receptor (ETBR), the vasopressin-V2-receptor (V2R) and the corticotropin-releasing-factor-receptors type 1 (CRF1R) and type 2(a) (CRF2(a)R) was analysed. In addition, the M/D of these GPCRs was determined. For the detection of the protein-protein interactions, the following biophysical methods were established: fluorescence-resonance-energy-transfer (FRET) and fluorescence-crosscorrelation-spectroscopy (FCCS). With the help of FCCS, a specific M/D could be determined for each of the GPCRs. Using FRET, differences in the interaction dynamics between family 1 (V2R) and family 2 GPCRs (CRF1R) could be described. Moreover, it was experimentally verified that the CRF2(a)R is exclusively expressed as a monomer, in contrast to the other GPCRs and even the highly homologous CRF1R. Using signal peptide swap experiments, it could be demonstrated that the N-terminal pseudo signal peptide of the CRF2(a)R, which is so far unique in the superfamily of GPCRs, prevents oligomerization of the receptor. In addition, a relation of receptor oligomerization and G protein coupling selectivity was established for the CRF1R and the CRF2(a)R which is novel for the GPCR protein family.

Das fibrillen-bildende beta2-Mikroglobulin (b2M) und das CRF1-Mimetikum mit verzweigter Rückgratstruktur können als „schwierige“ Proteine betrachtet werden, deren Darstellung sich eignet, gegenwärtige Möglichkeiten und Grenzen der Proteinsynthese zu ermitteln. Die Proteine sollen zu spektroskopischen Untersuchungen von Proteinfaltung bzw. Ligand-Rezeptor- Wechselwirkungen eingesetzt werden. Versuche zur Chemosynthese von b2M über drei Segmente führten per NCL zwar zu linearen Produkten mit korrekter Primärstruktur, aber wiederholt wurden zwei, mittels HPLC trennbare Proteine erhalten, deren enzymatische Spaltung zu identischen Fragmenten führte. Eine Isomerisierung (wie z.B. Epimerisierung) als Ursache für die Bildung der zwei Produkte konnte ausgeschlossen werden. Mittels CD- und FTIR-Spektroskopie wurden für beide Produkte beta- Faltblatt-Strukturen ermittelt, die sich sowohl untereinander als auch vom rekombinanten Protein unterschieden. Die „fehlgefalteten“ Syntheseprodukte konnten nicht entfaltet und anschließend in die „korrekte“ Struktur des rekombinanten b2M überführt werden. Es ist denkbar, dass die beobachtete „Fehlfaltung“, deren Ursache nicht geklärt werden konnte, für vom b2M ausgelöste Amyloidosen verantwortlich ist. Das CRF1-Modell, das aus drei zyklischen Peptiden und einem Protein mit Disulfidbrücken besteht, welche auf einem linearen Peptid-Templat verankert sind, wurde durch ein zyklisches Templat zur strukturellen Einschränkung modifiziert. Durch das zyklische Templat ergaben sich keine Syntheseprobleme, aber interessanterweise führte die Zyklisierung des Templats zu einer signifikant höheren Affinität für den Agonisten Urocortin-I im funktionellen Assay. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein zyklisches Rezeptor-Loop-Peptid mittels EPL im mg-Maßstab erhalten werden kann, was künftig die Synthese isotopenmarkierter Analoga für Struktur-Untersuchungen ermöglicht. / The fibril forming beta2-microglobulin (b2m) and the CRF1 mimic with branched peptide backbone could be considered as “difficult” proteins, whose synthesis is suited for determining present possibilities and limits of protein synthesis. The proteins shall be used for spectroscopic analysis of protein misfolding or ligand-receptor-interaction, respectively. Efforts of the chemosynthesis of b2m over three segments may lead via NCL to linear products with correct primary structure, but two, via HPLC isolatable proteins were repetitively susbstained, whose enzymatic digest lead to identical fragments. An isomerization (such as e. g. epimerization) as reason for the formation of the two products could be excluded. By means of CD and FTIR spectroscopy for both products beta-sheet structure were determined, which differ among themselves as well as from the recombinant protein. The “misfolded” synthetic product could not be unfolded und subsequently converted into the “correct” structure of the recombinant b2m. It is possible that the observed “misfolding”, whose cause could not be clarified, is reasonable for the amyloidosis induced by b2m. The CRF1 model that consists of three cyclic peptides and one protein with disulfid bridges coupled to a linear peptide template, was modified for structural constraints by a cyclic template. In consequence of the cyclic template no synthetic problems aroused, although the cyclisation of the template leads interestingly to a significant higher affinity for the antagonist urocortin-I in the functional assay. Furthermore, it was shown that a cyclic receptor loop peptide could be received via EPL in mg scale, what in future enables the synthesis of isotopically labeled analogs for structure investigations.

Der menschliche Organismus nutzt G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), membranständige Rezeptoren an Zelloberflächen, um extrazelluläre Signale wie z.B. Hormone, Neurotransmitter, gustatorische und olfaktorische Signale ins Zellinnere zu übertragen. Die spezifische Bindung dieser extrazellulären Liganden induziert in GPCRs eine Konformationsänderung, wodurch diese mit heterotrimeren G-Proteinen im Zellinnern interagieren und den GDP/GTP Nukleotidaustausch im G-Protein katalysieren können. Das G-Protein vermittelt seinerseits das Signal durch Protein-Protein Interaktion an intrazelluläre Effektorproteine weiter. Die in der vorliegenden Habilitationsschrift zusammengefassten Publikationen über das Rhodopsin/Transducin System der Photorezeptorzelle, einem Modellsystem für GPCRs/G-Proteine, umfassen drei Themenschwerpunkte: 1. Methodische Entwicklungen zur biophysikalischen Messung der Interaktion zwischen Rhodopsin und Transducin über Lichtstreu- und Evaneszentfeld-Techniken, insbesondere der Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie. 2. Die Ausbildung der aktiven Konformation des Rhodopsins. Es wurde die zeitliche Abfolge der mit der Rhodopsinaktivierung verbundenen Protonierungsänderungen im Rezeptor untersucht sowie der Einfluß der 9-Methylgruppe des Retinal Liganden auf diese Vorgänge. Eine wesentliche Determinante für die Aktivierung der cytoplasmatischen Rezeptoroberfläche stellt das konservierte NPxxY(x)5,6F Motiv in Helix VII/VIII dar. 3. Das Rezeptor / G-Protein Interface. Durch Rezeptor-Mutagenese und die Verwendung von den Bindungsstellen des G-Proteins abgeleiteten Peptiden wurde der Helix VIII (frühere vierte cytoplasmatische Rezeptorschleife) eine essentielle Funktion bei der Interaktion mit dem G-Protein zugeschrieben. Aus unseren Studien wurde ein sequenzieller Zwei-Schritt Mechanismus für die Rhodopsin/Transducin-Interaktion abgeleitet. / The human organism employs G protein coupled receptors (GPCRs), cell surface receptors in the plasma membrane, to transmit extracellular signals such as hormones, neurotransmitters, gustatory and olfactory signals into the interior of the cell. Specific binding of these extracellular ligands induces a conformational change in GPCRs, which allows the interaction with heterotrimeric G proteins and the catalysis of GDP/GTP nucleotide exchange in the G protein. The G protein then transmits the signal by protein-protein interaction to intracellular effector proteins. The publications summarized here on the rhodopsin/transducin system of photoreceptor cells, a model system for GPCRs/G proteins, cover three topics: 1. Methodology developments for biophysical monitoring of the interaction between rhodopsin and transducin by light scattering and evanescent field techniques, in particular surface plasmon resonance spectroscopy. 2. Formation of the active conformation of rhodopsin. The temporal sequence of protonation changes linked to rhodopsin activation was investigated as well as the effect of the 9-methyl group of the retinal ligand on these processes. A crucial determinant for activation of the cytoplasmic receptor surface is represented by the NPxxY(x)5,6F motif in helices VII/VIII. 3. The receptor/G protein interface. An essential role in the interaction with the G protein was assigned to helix VIII (former fourth cytoplasmic receptor loop) by employing receptor mutagenesis and peptides derived from binding sites on the G protein. Based on our studies we proposed a sequential two-step mechanism for the rhodopsin/transducin interaction.

Unnatural amino acids (uAA) expand the structural and functional possibilities of proteins. Numerous previous studies have demonstrated uAA as a powerful tool for protein engineering, but challenges also remain. Three notable such challenges include: (1) the fitness of uAA-incorporated proteins are difficult to predict and time-consuming to screen with conventional methods, (2) uAA incorporation in difficult-to-express proteins (e.g. membrane proteins such as G-protein coupled receptors) remain challenging, and (3) the incorporation of multiple types of uAA are still limited. In response, we pose cell-free protein synthesis (CFPS), a rapid and versatile in vitro expression system, as a platform to explore solutions to these challenges. The "cell-free" nature of CFPS enables it to accelerate protein expression and tolerate extensive modifications to its translational environment. In this work, these advantages were utilized to address the aforementioned challenges by: (1) rapidly expressing and screening uAA-containing proteins, (2) incorporating uAA in functional G-protein coupled receptor in the presence of membrane-mimicking lipid additives, and (3) engineer the translational environment extensively towards multiple uAA incorporation.

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El objetivo de la presente tesis es el de aportar conocimiento sobre la bioquímica y la farmacología de los receptores de adenosina, así como entender las relaciones entre estructura química y actividad farmacológica de los ligandos existentes para estos receptores. Con este objetivo se han empleado distintas técnicas y metodologías del diseño de fármacos asistido por ordenador. Los resultados presentados en este trabajo incluyen:· El desarrollo de una estrategia original para la selección de una muestra que cubra adecuadamente la diversidad molecular existente en una base de datos de compuestos químicos· La construcción de un modelo de la región transmembrana del receptor A1 humano de adenosina, en el que se ha localizado y caracterizado un sitio de unión de agonistas compatible con los datos experimentales.· Predicciones teóricas de las energías de unión de ligandos, realizadas a partir de los complejos agonista-receptor predichos sobre el modelo mencionado, obteniendo un grado de acuerdo con los datos experimentales que resulta esperanzador / The goal of the present thesis is to gain knowledge about the biochemistry and pharmacology of adenosine receptors, as well as to understand structure-activity relationships for the existing ligands for this receptors. In order to achieve this goal, we have used several techniques and methodologies from the computer-aided drug design field. Results presented in this work include:· The development of an original strategy of selection of a maximum diversity sample that adequately covers the original molecular diversity contained in a compound database· The building of the transmembrane region of a human A1 adenosine receptor model. In such a model, an agonists binding site has been located and characterized, showing agreement with experimental data.· The resulting ligand-receptor complexes have been studied with computational approaches for the prediction of ligand-binding free energies. A nice correlation with experimental results was observed