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Doctor of Philosophy / Department of Horticulture, Forestry, and Recreation Resources / Sunghun Park / Plants are continuously exposed to numerous abiotic stresses, which adversely affect plant growth, development, and yield. Plants have developed different signaling pathways to cope with abiotic stresses, and some of the pathways converge to help plants tolerate simultaneous stresses. Here, we report ectopic expression of an Arabidopsis glutaredoxin AtGRXS17 that confers tolerance to multiple abiotic stresses in tomato plants. In yeast assays, AtGRXS17 co-localized with yeast ScGrx3 in the nucleus and suppressed the sensitivity of yeast grx3grx4 double mutants to oxidative stress and heat shock. In plants, GFP-AtGRXS17 fusion proteins initially localized in the cytoplasm but migrated to the nucleus during heat stress. Ectopic expression of AtGRXS17 in tomato plants minimized photo-oxidation of chlorophyll and reduced oxidative damage of cell membrane systems under heat stress. Furthermore, expression of the heat shock transcription factor (HSF) and heat shock protein (HSP) genes was up-regulated in AtGRXS17-expressing tomato plants during heat stress when compared to wild-type controls. Under cold, drought, and oxidative stress conditions, AtGRXS17-expressing tomato plants also displayed more vigorous growth and less physiological damage than those of the wild-type control plants. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis indicated that expression of AtGRXS17 alters multiple stress defense signaling pathways, including the Abscisic Acid (ABA) and C-Repeat Binding Factors (CBF) pathways. The results revealed a conserved function for a glutaredoxin protein in abiotic stress adaptation, and manipulation of AtGRXS17 may be a useful approach to improve crop stress tolerance and understand plant signaling under abiotic stress conditions. Deregulated expression of an Arabidopsis H[superscript]+/Ca[superscript]2[superscript]+ antiporter (sCAX1) in agricultural crops increases total calcium (Ca[superscript]2[superscript]+) but may result in yield loses due to calcium-deficiency like symptoms. Here we demonstrate that co-expression of a maize calreticulin (CRT, a Ca[superscript]2[superscript]+ binding protein located at endoplasmic reticulum) in sCAX1-expressing plants mitigated these adverse effects while maintaining enhanced Ca[superscript]2[superscript]+ content. Co-expression of CRT and sCAX1 could alleviate the hypersensitivity to ion imbalance in tobacco plants. Furthermore, blossom-end rot (BER) in tomato may be linked to changes in CAX activity and enhanced CRT expression mitigated BER in sCAX1 expressing lines. These findings suggest that co-expressing Ca[superscript]2[superscript]+ transporters and binding protein at different intracellular compartments can alter the content and distribution of calcium within the plant matrix.

Macrophage death is likely to contribute to the transformation of fatty streaks into advanced atherosclerotic lesions. Previous work in the laboratory showed that OxLDL promotes cell death in human macrophages by a mechanism involving intracellular peroxide formation. Here we show that glutathione depletion induced by OxLDL occurs independent of peroxyl radical formation. Our data suggest that the depletion of glutathione is the fundamental defect that renders macrophages susceptible to OxLDL-induced cell injury, but alone is not sufficient to kill macrophages. We indicate that increased protein-Sglutathionylation is involved in OxLDL-induced macrophage death. A potentiation of OxLDL toxicity was observed in macrophages transfected with siRNA directed against either glutathione reductase or glutaredoxin. Our data suggests that OxLDL-induced cell injury in human macrophage is mediated by the depletion of GSH, a decreased in the GSH/GSSG ratio and peroxyl radical formation. All three signals are required for OxLDL-induced macrophage death. Our results also show that the glutathione reductase/glutaredoxin system protects macrophages from OxLDL-induced cell death.

Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2017-08-15T12:27:16Z No. of bitstreams: 1 BRUNO_DE_SOUZA_BASSO_DIS.pdf: 1709254 bytes, checksum: 167b84b794ff4ea4955b2ef79229ab4e (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-08-16T13:04:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 BRUNO_DE_SOUZA_BASSO_DIS.pdf: 1709254 bytes, checksum: 167b84b794ff4ea4955b2ef79229ab4e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-16T13:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BRUNO_DE_SOUZA_BASSO_DIS.pdf: 1709254 bytes, checksum: 167b84b794ff4ea4955b2ef79229ab4e (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The genus Baccharis belongs to the family Asteraceae and has several species widely used in folk medicine and own many compounds of pharmaceutical interest. The aim of this work was to evaluate the cytotoxic, antiproliferative effect and phenotypic reversion of Baccharis anomala extract on activated hepatic stellate cells (HSCs) and identify the compounds present in the extract. In order to evaluate the cytotoxic and antiproliferative effect of the fractionated extract, lactate dehydrogenase (LDH) release and the trypan blue exclusion method were used. The phenotype reversion was evaluated by staining with Oil Red and PPAR-? expression by RT-PCR. The fractions obtained from the methanolic extract were characterized for their phenolic composition by HPLC. The results showed that two fractions of methanolic extract decreased cell proliferation without increasing LDH release levels. Cell cycle arrest was evaluated using 7-AAD and DAPI staining was used to evaluate indications of apoptosis. Fractions of B.anomala induced cell cycle arrest in G1 phase, while DAPI staining did not reveal cell death by apoptosis. Oil-Red (ORO) staining showed the ability of fractions to induce phenotypic reversion and the evaluation of PPAR-? mRNA expression was not altered, suggesting that there is an independent PPAR-? pathway involved. The main components identified in the fractions that presented biological activity were hydroxybenzoic, chlorogenic and coumaric acid. Our study was able to show the antiproliferative effect of methanolic extract fractions of B.anomala, its potential to reverse the activated phenotype of hepatic stellate cells and showed its potential for the treatment of liver fibrosis. / O g?nero Baccharis pertence ? fam?lia Asteraceae e tem v?rias esp?cies amplamente utilizadas na medicina popular, possuindo muitos compostos de interesse farmac?utico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito citot?xico, antiproliferativo e a revers?o fenot?pica do extrato de Baccharis anomala em c?lulas estreladas hep?ticas ativadas (HSCs) e identificar os compostos presentes no extrato. Para avaliar o efeito citot?xico e antiproliferativo do extrato fracionado, foram utilizadas a libera??o de lactato desidrogenase (LDH) e o m?todo de exclus?o de azul de Tripan. A revers?o do fen?tipo foi avaliada por colora??o com Oil Red e pela express?o de PPAR-? por RT-PCR. As fra??es obtidas a partir do extrato metan?lico foram caracterizadas pela sua composi??o fen?lica por HPLC. Os resultados mostraram que duas fra??es do extrato metan?lico diminu?ram a prolifera??o celular sem aumentar os n?veis de libera??o de LDH. A parada do ciclo celular foi avaliada usando 7-AAD e colora??o por DAPI foi utilizada para avaliar a apoptose celular. As fra??es de B.anomala induziram a parada do ciclo celular em fase G1, a colora??o por DAPI n?o revelou morte celular por apoptose. Colora??o por Oil-RedO (ORO) mostrou a capacidade de indu??o da revers?o fenot?pica, a avalia??o da express?o mRNA de PPAR-y por RT-PCR n?o foi alterada, sugerindo que exista uma via independente de PPAR-y envolvida. Os principais componentes identificados nas fra??es que apresentaram atividade biol?gica foram os ?cidos hidroxibenz?ico, clorog?nico e cum?rico. Nosso estudo foi capaz de mostrar o efeito antiproliferativo das fra??es de extrato metan?lico de B.anomala, seu potencial para reverter o fen?tipo ativado das c?lulas estreladas hep?ticas e mostrou seu potencial para o tratamento da fibrose hep?tica.

Glutaredoxine wie auch Thioredoxine gehören der großen Proteinfamilie der Redoxine an. Das in dieser Arbeit näher untersuchte Glutaredoxin S17 (GRXS17) besteht aus einer Thioredoxin (Trx)- und bis zu drei Glutaredoxin (Grx)-Homologie-Domänen (HD). Es ist in ähnlicher Zusammensetzung in allen eukaryotischen und in vielen prokaryotischen Organismen unter unterschiedlichen Namen zu finden. Der Aufbau aus einer Trx-HD und drei Grx-HD kommt nur in höheren Pflanzen vor. In dieser Arbeit wurde das GRXS17 aus A. thaliana (AtGRXS17) sowohl durch computerbasierte Promotoranalysen als auch durch in vitro-Protein-Interaktionsstudien mit Transkriptionsfaktoren und Kinasen in Verbindung gebracht, die an Differenzierungsprozessen wie z.B. der Blühinduktion und/ oder an der Blütenbildung beteiligt sind. Mittels Bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BiFC) wurden Interaktionen von AtGRXS17 mit der Kinase At1g50570 und dem CCAAT-Transkriptionsfaktor NF-YC11 (At3g12480) verifiziert, welche zuvor bereits mittels massenspektrometrischer Analysen von pulldown-Versuchen identifiziert worden waren. Die drei Grx-HD des AtGRXS17-Proteins können [2Fe-2S]-Cluster einlagern (Kooperation mit C. Berndt, Karolinska Institut, Schweden). Eine regulative Funktion auf Transkriptebene, wie sie für das zu AtGRXS17 homologe GRX4 aus Saccharomyces cerevisiae (ScGRX4) durch die Interaktion mit dem CCAAT-Transkriptionsfaktor PHP4 in Abhängigkeit vom [2Fe-2S]-Cluster-Status des ScGRX4 stattfindet, ist daher denkbar. T DNA-Insertions-Mutanten im AtGRXS17-Gen generieren unter Langtag-Bedingungen (LT) verschiedene Differenzierungs-Phänotypen, während die Pflanzen unter Kurztag-Bedingungen (KT) in ihrer Entwicklung keine Abweichungen vom WT aufweisen. Der auffälligste dieser LT-Phänotypen zeigt eine verspätete Blühinduktion, die mit einem blütenlosen ersten Spross (PIN-like-Phänotyp) einhergeht. Erhöhte Lichtintensitäten verzögern die Blühinduktion weiter und lösen unterschiedliche stark ausgeprägte Entwicklungsstörungen in allen Blüten aus. Verschiedene, ebenfalls an der Blühinduktion beteiligte Vertreter der NF-Y-Transkriptionsfaktoren bilden mit CONSTANS (CO) einen Transkriptionsfaktor-Komplex zur Initiation der Transkription von FLOWERING LOCUS T (FT), dessen Genprodukt aus dem Blatt über das Phloem in den Vegetationskegel transportiert wird. Dort löst der Transkriptionsfaktor FT mit weiteren Transkriptionsfaktoren die Blühinduktion aus. Die Interaktion von AtGRXS17 mit dem NF YC11 und die Funktionsweise dieser Transkriptionsfaktor-Familie legen nahe, dass AtGRXS17 an regulativen Prozessen der Transkription von FT und somit an der Blühinduktion beteiligt ist. In 35S::AtGRXS17-Komplementations-Linien sind alle beobachteten Phänotypen der AtGRXS17-KO-Pflanzen behoben. Gibberellinsäure-Behandlungen an den KO-Pflanzen schwächen die Phänotypen, die bei Blühinduktion und Blütenbildung auftreten, ab. Vernalisierung unter LT-Bedingungen revertiert den Phänotyp der KO-Mutante vollständig. Da diese Behandlungen, die die Phänotypen des AtGRXS17 revertieren können, Mechanismen betreffen, die der Induktion durch die Photoperiode (LT) nachgeschaltet sind, ist der Wirkort von AtGRXS17 im Blühinduktionsweg durch LT-Bedingungen belegt.

A fibrose hepática é uma patologia que acompanha outras doenças crônicas do fígado como a cirrose e o hepatocarcinoma. As células estreladas hepáticas (HSC, do inglês hepatic stellate cells) compõem uma população celular heterogênea que se caracteriza por transitar entre dois fenótipos. As células com fenótipo quiescente possuem a capacidade de armazenar vitamina A em gotas lipídicas. Os insultos ao fígado desencadeiam uma resposta inflamatória que gera estímulos parácrinos e autócrinos mediados por citocinas e espécies reativas. Neste contexto, as HSC assumem um fenótipo ativado fibrogênico e tornam-se responsáveis pela cicatrização hepática. Danos crônicos ao fígado levam a uma deposição de matriz extracelular exagerada que configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas. Inúmeros efeitos benéficos à saúde são atribuídos ao RSV por causa do seu potencial antioxidante, antiinflamatório e pró-apoptótico. Estudos anteriores mostraram que tratamento da GRX, uma linhagem murina de HSC ativadas, com concentrações de RSV próximas as biodisponíveis (0,1 a 1 μM) resultou em parada do ciclo na fase S com consequente inibição de proliferação celular, um efeito associado à citotoxicidade e que pode favorecer a resolução da fibrose hepática. Neste estudo, por técnicas espectrofotométricas, foi demonstrado que tratamento da GRX por 24 horas com concentrações entre 0,1 a 50 μM de RSV promoveu um efeito pró-oxidante que causa uma citotoxicidade dependente da dose, bastante aumentada no grupo tratado com a concentração mais alta. Os efeitos citotóxicos atenuados encontrados nas células tratadas por 120 horas sugerem que a GRX pode se tornar resistente a estes efeitos. O potencial pró-oxidante do RSV foi o ponto de partida para investigar a possibilidade de que esta fitoalexina provocasse uma alteração no metabolismo mitocondrial da GRX. Para isso, os efeitos do RSV (1 a 50 μM) na função mitocondrial, na indução de morte mediada por estas organelas e na autofagia/mitofagia foram investigados por técnicas de espectrofotometria, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo, de microscopia confocal e de microscopia eletrônica de transmissão em GRX tratadas por 24 e 120 horas. Foi demonstrado que todas as concentrações de RSV promovem apoptose por meio da ativação de caspases, alteram a dinâmica/função mitocondrial e induzem o aumento de autofagia/mitofagia na GRX. No entanto, o RSV provocou biogênese de mitocôndrias nos grupos tratados com 1 e 10 μM, enquanto que o tratamento com 50 μM causou dano celular evidente na GRX, sem induzir biogênese de mitocôndrias. Desta forma, é possível que a citotoxicidade “dose-dependente” do RSV, que causa a morte celular e dano oxidativo em 24 horas de tratamento, esteja relacionada com o desequilíbrio entre a indução concomitante de apoptose mediada por dano mitocondrial, autofagia/mitofagia e biogênese de mitocôndrias. Por fim, foi investigada a liberação de TNF-α, Interleucina-6 e Interleucina-10 pela GRX tratada por 24 e 120 horas com RSV (0,1 a 50 μM), considerando o papel antiinflamatório do RSV e o papel das HSC ativadas na sinalização autócrina que contribui para a modulação fenotípica destas células. Foi demonstrado que o tratamento da GRX com RSV por 24 e 120 horas induziu a redução da liberação de Interleucina-6; enquanto que a liberação de TNF-α e Interleucina-10 foi aumentada. Estes resultados confirmam um efeito antiinflamatório do RSV que deve contribuir na prevenção da ativação ou da perpetuação do estado ativado das HSC por meio de sinalização autócrina. Ainda que a concentração do RSV seja importante para efetivamente induzir a morte das HSC ativadas, o tratamento com esta fitoalexina pode ser promissor para a resolução da fibrose hepática por diminuir a população de células ativadas e, possivelmente, prevenir a perpetuação do estado fenotípico ativado. Estudos avaliando indicadores de quiescência em células tratadas são ainda necessários para desvendar completamente os efeitos do RSV quanto às possibilidades de inibição da perpetuação ou reversão fenotípica das HSC ativadas. / Liver fibrosis is a disease that accompanies other hepatic chronic diseases such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatic stellate cells (HSC) are a heterogeneous cell population characterized by transiting between two phenotypes. Cells with a quiescent phenotype are able to store vitamin A into lipid droplets. Damage to the liver trigger an inflammatory response that generates paracrine and autocrine stimulation mediated by cytokines and reactive species. In this context, HSC assume an activated and fibrogenic phenotype responsive for hepatic wound-healing. Chronic insults to the liver lead to an excessive deposition of extracellular matrix that configures the pathological state of fibrosis. Resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic potential. Previous studies showed that treatment with bioavailable concentrations of RSV (0.1 to 1 μM) promoted an arrest cycle at the S phase in GRX, a murine activated HSC model, leading to cell proliferation inhibition, a cytotoxic effect that contributes to the liver fibrosis resolution. In this study, it was shown by spectrophotometric techniques that GRX treatment for 24 hours at concentrations between 0.1 to 50 μM of RSV promoted a fairly clear pro-oxidant effect that causes a dose-dependent cytotoxicity that was higher in the group treated with 50 μM. The attenuated cytotoxicity found after 120 hours of GRX treatment suggest that these cells became resistant to this effect. The pro-oxidant potential of RSV was the starting point for investigating the possibility that this phytoalexin would cause a change in the GRX mitochondrial metabolism. Thus, the effects of RSV (1 to 50 μM) on altering the mitochondrial function, on inducing mitochondrial-mediated cell death, and autophagy/mitofagia were investigated in GRX treated for 24 and 120 hours by spectrophotometric techniques, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal microscopy, and transmission electron microscopy. All the RSV concentrations promote cell apoptosis through caspases activation, alter the mitochondrial dynamics and function, and induce an increase of autophagy/mitofagia. Curiously, only 1 and 10 μM of RSV induced mitochondrial biogenesis in GRX, while the highest concentration caused an evident cell damage without inducing mitochondrial biogenesis. Thus, it is possible that the "dose-dependent" cytotoxicity of RSV, which causes cell death and oxidative damage in 24 hours of treatment, is related to an imbalance between the concomitant induction of mitochondrial-mediated apoptosis, autophagy/mitofagia, and mitochondrial biogenesis. Finally, it was investigated the release of TNF-α, Interleukin-6 and Interleukin-10 by GRX treated for 24 and 120 hours with RSV (0.1 to 50 μM), considering the anti-inflammatory role of RSV and the autocrine signalling role of HSC that contributes to the perpetuation of its activated phenotype. It was demonstrated that GRX treatment with RSV for 24 and 120 hours reduced the release of Interleukin-6 in the culture medium; whereas the release of TNF-α and Interleukin-10 was increased. These results confirm the anti-inflammatory properties of RSV and may contribute to the prevention of HSC activation through autocrine signalling. Although RSV concentration is important to effectively induce activated HSC death, cells treatment with this phytoalexin may be promising for liver fibrosis resolution through decreasing the population of activated cells or through preventing the perpetuation of activated state of HSC. Future studies evaluating the quiescence indicators of GRX under RSV treatment are still needed to fully unravel the effects of this phytoalexin on inhibiting the perpetuation of activated HSC or reversing its activated phenotype.

A fibrose hepática é uma patologia que acompanha outras doenças crônicas do fígado como a cirrose e o hepatocarcinoma. As células estreladas hepáticas (HSC, do inglês hepatic stellate cells) compõem uma população celular heterogênea que se caracteriza por transitar entre dois fenótipos. As células com fenótipo quiescente possuem a capacidade de armazenar vitamina A em gotas lipídicas. Os insultos ao fígado desencadeiam uma resposta inflamatória que gera estímulos parácrinos e autócrinos mediados por citocinas e espécies reativas. Neste contexto, as HSC assumem um fenótipo ativado fibrogênico e tornam-se responsáveis pela cicatrização hepática. Danos crônicos ao fígado levam a uma deposição de matriz extracelular exagerada que configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas. Inúmeros efeitos benéficos à saúde são atribuídos ao RSV por causa do seu potencial antioxidante, antiinflamatório e pró-apoptótico. Estudos anteriores mostraram que tratamento da GRX, uma linhagem murina de HSC ativadas, com concentrações de RSV próximas as biodisponíveis (0,1 a 1 μM) resultou em parada do ciclo na fase S com consequente inibição de proliferação celular, um efeito associado à citotoxicidade e que pode favorecer a resolução da fibrose hepática. Neste estudo, por técnicas espectrofotométricas, foi demonstrado que tratamento da GRX por 24 horas com concentrações entre 0,1 a 50 μM de RSV promoveu um efeito pró-oxidante que causa uma citotoxicidade dependente da dose, bastante aumentada no grupo tratado com a concentração mais alta. Os efeitos citotóxicos atenuados encontrados nas células tratadas por 120 horas sugerem que a GRX pode se tornar resistente a estes efeitos. O potencial pró-oxidante do RSV foi o ponto de partida para investigar a possibilidade de que esta fitoalexina provocasse uma alteração no metabolismo mitocondrial da GRX. Para isso, os efeitos do RSV (1 a 50 μM) na função mitocondrial, na indução de morte mediada por estas organelas e na autofagia/mitofagia foram investigados por técnicas de espectrofotometria, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo, de microscopia confocal e de microscopia eletrônica de transmissão em GRX tratadas por 24 e 120 horas. Foi demonstrado que todas as concentrações de RSV promovem apoptose por meio da ativação de caspases, alteram a dinâmica/função mitocondrial e induzem o aumento de autofagia/mitofagia na GRX. No entanto, o RSV provocou biogênese de mitocôndrias nos grupos tratados com 1 e 10 μM, enquanto que o tratamento com 50 μM causou dano celular evidente na GRX, sem induzir biogênese de mitocôndrias. Desta forma, é possível que a citotoxicidade “dose-dependente” do RSV, que causa a morte celular e dano oxidativo em 24 horas de tratamento, esteja relacionada com o desequilíbrio entre a indução concomitante de apoptose mediada por dano mitocondrial, autofagia/mitofagia e biogênese de mitocôndrias. Por fim, foi investigada a liberação de TNF-α, Interleucina-6 e Interleucina-10 pela GRX tratada por 24 e 120 horas com RSV (0,1 a 50 μM), considerando o papel antiinflamatório do RSV e o papel das HSC ativadas na sinalização autócrina que contribui para a modulação fenotípica destas células. Foi demonstrado que o tratamento da GRX com RSV por 24 e 120 horas induziu a redução da liberação de Interleucina-6; enquanto que a liberação de TNF-α e Interleucina-10 foi aumentada. Estes resultados confirmam um efeito antiinflamatório do RSV que deve contribuir na prevenção da ativação ou da perpetuação do estado ativado das HSC por meio de sinalização autócrina. Ainda que a concentração do RSV seja importante para efetivamente induzir a morte das HSC ativadas, o tratamento com esta fitoalexina pode ser promissor para a resolução da fibrose hepática por diminuir a população de células ativadas e, possivelmente, prevenir a perpetuação do estado fenotípico ativado. Estudos avaliando indicadores de quiescência em células tratadas são ainda necessários para desvendar completamente os efeitos do RSV quanto às possibilidades de inibição da perpetuação ou reversão fenotípica das HSC ativadas. / Liver fibrosis is a disease that accompanies other hepatic chronic diseases such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatic stellate cells (HSC) are a heterogeneous cell population characterized by transiting between two phenotypes. Cells with a quiescent phenotype are able to store vitamin A into lipid droplets. Damage to the liver trigger an inflammatory response that generates paracrine and autocrine stimulation mediated by cytokines and reactive species. In this context, HSC assume an activated and fibrogenic phenotype responsive for hepatic wound-healing. Chronic insults to the liver lead to an excessive deposition of extracellular matrix that configures the pathological state of fibrosis. Resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic potential. Previous studies showed that treatment with bioavailable concentrations of RSV (0.1 to 1 μM) promoted an arrest cycle at the S phase in GRX, a murine activated HSC model, leading to cell proliferation inhibition, a cytotoxic effect that contributes to the liver fibrosis resolution. In this study, it was shown by spectrophotometric techniques that GRX treatment for 24 hours at concentrations between 0.1 to 50 μM of RSV promoted a fairly clear pro-oxidant effect that causes a dose-dependent cytotoxicity that was higher in the group treated with 50 μM. The attenuated cytotoxicity found after 120 hours of GRX treatment suggest that these cells became resistant to this effect. The pro-oxidant potential of RSV was the starting point for investigating the possibility that this phytoalexin would cause a change in the GRX mitochondrial metabolism. Thus, the effects of RSV (1 to 50 μM) on altering the mitochondrial function, on inducing mitochondrial-mediated cell death, and autophagy/mitofagia were investigated in GRX treated for 24 and 120 hours by spectrophotometric techniques, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal microscopy, and transmission electron microscopy. All the RSV concentrations promote cell apoptosis through caspases activation, alter the mitochondrial dynamics and function, and induce an increase of autophagy/mitofagia. Curiously, only 1 and 10 μM of RSV induced mitochondrial biogenesis in GRX, while the highest concentration caused an evident cell damage without inducing mitochondrial biogenesis. Thus, it is possible that the "dose-dependent" cytotoxicity of RSV, which causes cell death and oxidative damage in 24 hours of treatment, is related to an imbalance between the concomitant induction of mitochondrial-mediated apoptosis, autophagy/mitofagia, and mitochondrial biogenesis. Finally, it was investigated the release of TNF-α, Interleukin-6 and Interleukin-10 by GRX treated for 24 and 120 hours with RSV (0.1 to 50 μM), considering the anti-inflammatory role of RSV and the autocrine signalling role of HSC that contributes to the perpetuation of its activated phenotype. It was demonstrated that GRX treatment with RSV for 24 and 120 hours reduced the release of Interleukin-6 in the culture medium; whereas the release of TNF-α and Interleukin-10 was increased. These results confirm the anti-inflammatory properties of RSV and may contribute to the prevention of HSC activation through autocrine signalling. Although RSV concentration is important to effectively induce activated HSC death, cells treatment with this phytoalexin may be promising for liver fibrosis resolution through decreasing the population of activated cells or through preventing the perpetuation of activated state of HSC. Future studies evaluating the quiescence indicators of GRX under RSV treatment are still needed to fully unravel the effects of this phytoalexin on inhibiting the perpetuation of activated HSC or reversing its activated phenotype.

A fibrose hepática é uma patologia que acompanha outras doenças crônicas do fígado como a cirrose e o hepatocarcinoma. As células estreladas hepáticas (HSC, do inglês hepatic stellate cells) compõem uma população celular heterogênea que se caracteriza por transitar entre dois fenótipos. As células com fenótipo quiescente possuem a capacidade de armazenar vitamina A em gotas lipídicas. Os insultos ao fígado desencadeiam uma resposta inflamatória que gera estímulos parácrinos e autócrinos mediados por citocinas e espécies reativas. Neste contexto, as HSC assumem um fenótipo ativado fibrogênico e tornam-se responsáveis pela cicatrização hepática. Danos crônicos ao fígado levam a uma deposição de matriz extracelular exagerada que configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas. Inúmeros efeitos benéficos à saúde são atribuídos ao RSV por causa do seu potencial antioxidante, antiinflamatório e pró-apoptótico. Estudos anteriores mostraram que tratamento da GRX, uma linhagem murina de HSC ativadas, com concentrações de RSV próximas as biodisponíveis (0,1 a 1 μM) resultou em parada do ciclo na fase S com consequente inibição de proliferação celular, um efeito associado à citotoxicidade e que pode favorecer a resolução da fibrose hepática. Neste estudo, por técnicas espectrofotométricas, foi demonstrado que tratamento da GRX por 24 horas com concentrações entre 0,1 a 50 μM de RSV promoveu um efeito pró-oxidante que causa uma citotoxicidade dependente da dose, bastante aumentada no grupo tratado com a concentração mais alta. Os efeitos citotóxicos atenuados encontrados nas células tratadas por 120 horas sugerem que a GRX pode se tornar resistente a estes efeitos. O potencial pró-oxidante do RSV foi o ponto de partida para investigar a possibilidade de que esta fitoalexina provocasse uma alteração no metabolismo mitocondrial da GRX. Para isso, os efeitos do RSV (1 a 50 μM) na função mitocondrial, na indução de morte mediada por estas organelas e na autofagia/mitofagia foram investigados por técnicas de espectrofotometria, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo, de microscopia confocal e de microscopia eletrônica de transmissão em GRX tratadas por 24 e 120 horas. Foi demonstrado que todas as concentrações de RSV promovem apoptose por meio da ativação de caspases, alteram a dinâmica/função mitocondrial e induzem o aumento de autofagia/mitofagia na GRX. No entanto, o RSV provocou biogênese de mitocôndrias nos grupos tratados com 1 e 10 μM, enquanto que o tratamento com 50 μM causou dano celular evidente na GRX, sem induzir biogênese de mitocôndrias. Desta forma, é possível que a citotoxicidade “dose-dependente” do RSV, que causa a morte celular e dano oxidativo em 24 horas de tratamento, esteja relacionada com o desequilíbrio entre a indução concomitante de apoptose mediada por dano mitocondrial, autofagia/mitofagia e biogênese de mitocôndrias. Por fim, foi investigada a liberação de TNF-α, Interleucina-6 e Interleucina-10 pela GRX tratada por 24 e 120 horas com RSV (0,1 a 50 μM), considerando o papel antiinflamatório do RSV e o papel das HSC ativadas na sinalização autócrina que contribui para a modulação fenotípica destas células. Foi demonstrado que o tratamento da GRX com RSV por 24 e 120 horas induziu a redução da liberação de Interleucina-6; enquanto que a liberação de TNF-α e Interleucina-10 foi aumentada. Estes resultados confirmam um efeito antiinflamatório do RSV que deve contribuir na prevenção da ativação ou da perpetuação do estado ativado das HSC por meio de sinalização autócrina. Ainda que a concentração do RSV seja importante para efetivamente induzir a morte das HSC ativadas, o tratamento com esta fitoalexina pode ser promissor para a resolução da fibrose hepática por diminuir a população de células ativadas e, possivelmente, prevenir a perpetuação do estado fenotípico ativado. Estudos avaliando indicadores de quiescência em células tratadas são ainda necessários para desvendar completamente os efeitos do RSV quanto às possibilidades de inibição da perpetuação ou reversão fenotípica das HSC ativadas. / Liver fibrosis is a disease that accompanies other hepatic chronic diseases such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatic stellate cells (HSC) are a heterogeneous cell population characterized by transiting between two phenotypes. Cells with a quiescent phenotype are able to store vitamin A into lipid droplets. Damage to the liver trigger an inflammatory response that generates paracrine and autocrine stimulation mediated by cytokines and reactive species. In this context, HSC assume an activated and fibrogenic phenotype responsive for hepatic wound-healing. Chronic insults to the liver lead to an excessive deposition of extracellular matrix that configures the pathological state of fibrosis. Resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic potential. Previous studies showed that treatment with bioavailable concentrations of RSV (0.1 to 1 μM) promoted an arrest cycle at the S phase in GRX, a murine activated HSC model, leading to cell proliferation inhibition, a cytotoxic effect that contributes to the liver fibrosis resolution. In this study, it was shown by spectrophotometric techniques that GRX treatment for 24 hours at concentrations between 0.1 to 50 μM of RSV promoted a fairly clear pro-oxidant effect that causes a dose-dependent cytotoxicity that was higher in the group treated with 50 μM. The attenuated cytotoxicity found after 120 hours of GRX treatment suggest that these cells became resistant to this effect. The pro-oxidant potential of RSV was the starting point for investigating the possibility that this phytoalexin would cause a change in the GRX mitochondrial metabolism. Thus, the effects of RSV (1 to 50 μM) on altering the mitochondrial function, on inducing mitochondrial-mediated cell death, and autophagy/mitofagia were investigated in GRX treated for 24 and 120 hours by spectrophotometric techniques, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal microscopy, and transmission electron microscopy. All the RSV concentrations promote cell apoptosis through caspases activation, alter the mitochondrial dynamics and function, and induce an increase of autophagy/mitofagia. Curiously, only 1 and 10 μM of RSV induced mitochondrial biogenesis in GRX, while the highest concentration caused an evident cell damage without inducing mitochondrial biogenesis. Thus, it is possible that the "dose-dependent" cytotoxicity of RSV, which causes cell death and oxidative damage in 24 hours of treatment, is related to an imbalance between the concomitant induction of mitochondrial-mediated apoptosis, autophagy/mitofagia, and mitochondrial biogenesis. Finally, it was investigated the release of TNF-α, Interleukin-6 and Interleukin-10 by GRX treated for 24 and 120 hours with RSV (0.1 to 50 μM), considering the anti-inflammatory role of RSV and the autocrine signalling role of HSC that contributes to the perpetuation of its activated phenotype. It was demonstrated that GRX treatment with RSV for 24 and 120 hours reduced the release of Interleukin-6 in the culture medium; whereas the release of TNF-α and Interleukin-10 was increased. These results confirm the anti-inflammatory properties of RSV and may contribute to the prevention of HSC activation through autocrine signalling. Although RSV concentration is important to effectively induce activated HSC death, cells treatment with this phytoalexin may be promising for liver fibrosis resolution through decreasing the population of activated cells or through preventing the perpetuation of activated state of HSC. Future studies evaluating the quiescence indicators of GRX under RSV treatment are still needed to fully unravel the effects of this phytoalexin on inhibiting the perpetuation of activated HSC or reversing its activated phenotype.

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