Cell migration is critical in generating complex animal forms during development; misregulation of migration contributes to pathological conditions such as cancer metastasis. Thanks to its easily traceable cell lineages in a transparent body and a compact genome accessible to a wealth of genetic manipulations, the use of the nematode C. elegans as a model system has greatly advanced our understanding of mechanisms governing cell migration conserved through higher organisms. Among several migration processes in C. elegans, sex myoblast (SM) migration is an attractive system that has a simple and well-defined migratory route along the ventral side from the posterior to the precise center of the gonad. A multitude of guidance mechanisms control SM migration, many of which are likely to be conserved in other migratory processes. Similar to vertebrate systems, C. elegans uses Rho family small GTPases to regulate the engine of cell motility, the actin cytoskeleton, in response to guidance cues. The differential utilizations of Rho GTPases in distinct processes in vivo remain a central question in the study of Rho GTPases. I investigated how Rho GTPases regulate different aspects of SM migration, and found that Cdc-42/CDC42 functions in the anteroposterior migration, whereas MIG-2/RhoG and CED-10/Rac1 control ventral restriction independently of FGF and SLIT/Robo signaling. The relative difficulty in perturbing SM migration using constitutively active Rho GTPases compared to other migration processes illustrates the robustness of the mechanisms that control SM migration. On a technical aspect, I established a nematode larval cell culture system that allows access to postembryonic cells. Compared to the flourishing genetic researches in C. elegans, there are few studies of molecules that also extend to the subcellular level in postembryonic development, mainly due to the lack of a larval cell culture system. I developed a novel method combining SDS-DTT presensitization of larval cuticles and subsequent pronase E digestion. My method efficiently isolates both low- and high-abundance cell types from all larval stages. This technical advance will not only facilitate studies such as regulation of actin dynamics with high-resolution microscopy, but is beginning to be used by researchers to tackle cell-type specific questions through profiling methods as gene expression analysis. / Ph. D.

Les protéines DOCK180 et ELMO coopèrent ensemble biochimiquement et génétiquement afin d’activer la GTPase Rac1 lors de plusieurs évènements biologiques. Toutefois, le rôle que jouent ces protéines dans la signalisation par Rac est encore mal compris. Nous émettons l’hypothèse que Dock180 agit comme activateur de Rac, alors que ELMO est requis pour l’intégration de la signalisation de Rac plutôt que son activation per se. Nous postulons que ELMO agit comme signal de localisation intracellulaire afin de restreindre de façon spatio-temporelle la signalisation de Rac en aval de Dock180, et/ou que ELMO agit comme protéine d’échafaudage entre Rac et ses effecteurs pour amplifier la migration cellulaire. Dans l’objectif nº 1, nous démontrons que le domaine PH atypique de ELMO1 est le site d’interaction principal entre cette protéine et DOCK180. De plus, nous démontrons que la liaison entre ELMO et DOCK180 n’est pas nécessaire pour l’activation de Rac, mais est plutôt essentielle pour faciliter la réorganisation du cytosquelette induite par l’activation de Rac en aval de Dock180. Ces résultats impliquent que ELMO pourrait jouer des rôles additionnels dans la signalisation par Rac. Dans l’objectif nº 2, nous avons découvert l’existence d’une homologie structurelle entre ELMO et un module d’autorégulation de la formine Dia1, et avons identifié trois nouveaux domaines dans la protéine ELMO : les domaines RBD, EID et EAD. De façon analogue à Dia1, nous avons découvert que ELMO à l’état basal est autoinhibé grâce à des intéractions intramoléculaires. Nous proposons que l’état d’activation des protéines ELMO est régulé de façon similaire aux formines de la famille Dia, c’est-à-dire grâce à des interactions avec d’autres protéines. Dans l’objectif nº 3, nous identifions un domaine RBD polyvalent chez ELMO. Ce domaine possède une double spécificité pour les GTPases de la famille Rho et Arf. Nous avons découvert que Arl4A agit comme signal de recrutement membranaire pour le module ELMO/DOCK180/Rac. Nos résultats nous permettent de supposer que d’autres GTPases pourraient être impliquées dans l’activation et la localisation de cette voie de signalisation. Nous concluons qu’à l’état basal, ELMO et DOCK180 forment un complexe dans lequel ELMO est dans sa conformation autoinhibée. Bien que le mécanisme d’activation de ELMO ne soit pas encore bien compris, nous avons découvert que, lorsqu’il y a stimulation cellulaire, certaines GTPases liées au GTP peuvent intéragir avec le domaine RBD de ELMO pour relâcher les contacts intramoléculaires et/ou localiser le complexe à la membrane. Ainsi, les GTPases peuvent servir d’ancrage au complexe ELMO/DOCK180 pour assurer une regulation spatiotemporelle adequate de l’activation et de la signalisation de Rac. / DOCK180 and ELMO cooperate biochemically and genetically to activate Rac in several biological events. However, the role of these proteins in Rac signaling is still poorly understood. We hypothesize that DOCK180 functions as a RacGEF, with ELMO binding to DOCK180 being required for integration of proper Rac signaling rather than Rac activation per se. We postulate that ELMO acts as a subcellular targeting signal for spatio-temporal restriction of DOCK180-mediated Rac signaling and/or as a scaffold for Rac effectors to enforce cell migration. In Aim #1, we elucidate that the atypical ELMO1 PH is the major DOCK180 binding site. We demonstrate that the binding of ELMO1 to DOCK180 is not necessary for Rac GTP-loading, but is instead required to facilitate Rac-GTP induced cytoskeletal changes following DOCK180 activation. These results imply additional roles for ELMO in mediating Rac signaling. In Aim #2, we reveal structural homology between ELMO and an autoregulatory module in the formin, Dia1, and identify three novel domains in ELMOs: the RBD, EID and EAD. Analogous to Dia1, we uncovered that ELMO is autoinhibited via intramolecular interactions at basal state. We propose that the activation state of ELMO proteins is regulated, much like in Dia-family formins, via interaction with other proteins. Aim #3 identifies a polyvalent RBD in ELMO with dual specificity for Rho and Arf family GTPases. We found Arl4A as a novel membrane recruitment signal for the ELMO/DOCK180/Rac module. Our results may have broad implications in the activation and localization of this pathway by additional GTPases. We conclude that, at basal levels, ELMO/DOCK180 is complexed, with ELMO in an autoinhibited state in the cytosol. Through cell stimulation, certain GTPases will be activated that now bind the ELMO RBD and alleviate the intramolecular contacts. In this way, the GTPase anchors the activated ELMO/DOCK180 module in place for proper spatio-temporal regulation of Rac activation and signaling.

Linfócitos T CD8 e células NK atuam no combate à infecções por bactérias intracelulares, vírus e células tumorais, provocando a morte dessas células por meio da secreção de grânulos citotóxicos. Proteínas RAB GTPase têm se destacado em estudos de tráfego intracelular, porém, são escassos dados sobre o papel destas proteínas em células citóxicas. Um estudo prospectivo de proteômica realizado por nosso grupo identificou a RAB2A, RAB5A, RAB17 e RAB18 em grânulos citotóxicos. Análises mais aprofundadas revelaram que a RAB2A está associada a proteínas como LAMP-1 e LAMP-2, enquanto que RAB5A, RAB17 e RAB18 estavam presentes na mesma linhagem em um contexto não contemplado neste estudo. Desenvolvemos ainda uma abordagem de silenciamento gênico da RAB2A, e por fim, adaptamos uma série de protocolos de simples execução e baixo custo para avaliar funções efetoras de células NK. O conhecimento da maquinaria secretória é fundamental, uma vez que defeitos nas vias de tráfego intracelular constituem a base de um grande número de doenças que desencadeiam quadros fatais. / CD8 T lymphocytes and NK cells fight against infections by intracellular bacteria, viruses and tumor cells by killing those cells through the secretion of cytotoxic granules. RAB GTPase has been highlighted in studies of intracellular trafficking, however there are scarce reports regarding the role of these proteins in cytotoxic cells. A proteomic study performed by our group identified RAB2A, RAB5A, RAB17 and RAB18 in cytotoxic granules. Further analysis revealed that RAB2A is associated with LAMP-1 and LAMP-2, while RAB5A, RAB17 and RAB18 were present in the same cell line, but in a context not included in this study. We also have developed a gene silencing approach for RAB2A and adapted a number of protocols, simple and low-cost, that can be used to evaluate effector functions of natural killer cells The knowledge of secretory machinery involved in the movement cytotoxic granules of cytotoxic cells is critical, since defects in intracellular trafficking pathways constitute the basis for a large number of diseases which trigger death.

Les protéines DOCK180 et ELMO coopèrent ensemble biochimiquement et génétiquement afin d’activer la GTPase Rac1 lors de plusieurs évènements biologiques. Toutefois, le rôle que jouent ces protéines dans la signalisation par Rac est encore mal compris. Nous émettons l’hypothèse que Dock180 agit comme activateur de Rac, alors que ELMO est requis pour l’intégration de la signalisation de Rac plutôt que son activation per se. Nous postulons que ELMO agit comme signal de localisation intracellulaire afin de restreindre de façon spatio-temporelle la signalisation de Rac en aval de Dock180, et/ou que ELMO agit comme protéine d’échafaudage entre Rac et ses effecteurs pour amplifier la migration cellulaire. Dans l’objectif nº 1, nous démontrons que le domaine PH atypique de ELMO1 est le site d’interaction principal entre cette protéine et DOCK180. De plus, nous démontrons que la liaison entre ELMO et DOCK180 n’est pas nécessaire pour l’activation de Rac, mais est plutôt essentielle pour faciliter la réorganisation du cytosquelette induite par l’activation de Rac en aval de Dock180. Ces résultats impliquent que ELMO pourrait jouer des rôles additionnels dans la signalisation par Rac. Dans l’objectif nº 2, nous avons découvert l’existence d’une homologie structurelle entre ELMO et un module d’autorégulation de la formine Dia1, et avons identifié trois nouveaux domaines dans la protéine ELMO : les domaines RBD, EID et EAD. De façon analogue à Dia1, nous avons découvert que ELMO à l’état basal est autoinhibé grâce à des intéractions intramoléculaires. Nous proposons que l’état d’activation des protéines ELMO est régulé de façon similaire aux formines de la famille Dia, c’est-à-dire grâce à des interactions avec d’autres protéines. Dans l’objectif nº 3, nous identifions un domaine RBD polyvalent chez ELMO. Ce domaine possède une double spécificité pour les GTPases de la famille Rho et Arf. Nous avons découvert que Arl4A agit comme signal de recrutement membranaire pour le module ELMO/DOCK180/Rac. Nos résultats nous permettent de supposer que d’autres GTPases pourraient être impliquées dans l’activation et la localisation de cette voie de signalisation. Nous concluons qu’à l’état basal, ELMO et DOCK180 forment un complexe dans lequel ELMO est dans sa conformation autoinhibée. Bien que le mécanisme d’activation de ELMO ne soit pas encore bien compris, nous avons découvert que, lorsqu’il y a stimulation cellulaire, certaines GTPases liées au GTP peuvent intéragir avec le domaine RBD de ELMO pour relâcher les contacts intramoléculaires et/ou localiser le complexe à la membrane. Ainsi, les GTPases peuvent servir d’ancrage au complexe ELMO/DOCK180 pour assurer une regulation spatiotemporelle adequate de l’activation et de la signalisation de Rac. / DOCK180 and ELMO cooperate biochemically and genetically to activate Rac in several biological events. However, the role of these proteins in Rac signaling is still poorly understood. We hypothesize that DOCK180 functions as a RacGEF, with ELMO binding to DOCK180 being required for integration of proper Rac signaling rather than Rac activation per se. We postulate that ELMO acts as a subcellular targeting signal for spatio-temporal restriction of DOCK180-mediated Rac signaling and/or as a scaffold for Rac effectors to enforce cell migration. In Aim #1, we elucidate that the atypical ELMO1 PH is the major DOCK180 binding site. We demonstrate that the binding of ELMO1 to DOCK180 is not necessary for Rac GTP-loading, but is instead required to facilitate Rac-GTP induced cytoskeletal changes following DOCK180 activation. These results imply additional roles for ELMO in mediating Rac signaling. In Aim #2, we reveal structural homology between ELMO and an autoregulatory module in the formin, Dia1, and identify three novel domains in ELMOs: the RBD, EID and EAD. Analogous to Dia1, we uncovered that ELMO is autoinhibited via intramolecular interactions at basal state. We propose that the activation state of ELMO proteins is regulated, much like in Dia-family formins, via interaction with other proteins. Aim #3 identifies a polyvalent RBD in ELMO with dual specificity for Rho and Arf family GTPases. We found Arl4A as a novel membrane recruitment signal for the ELMO/DOCK180/Rac module. Our results may have broad implications in the activation and localization of this pathway by additional GTPases. We conclude that, at basal levels, ELMO/DOCK180 is complexed, with ELMO in an autoinhibited state in the cytosol. Through cell stimulation, certain GTPases will be activated that now bind the ELMO RBD and alleviate the intramolecular contacts. In this way, the GTPase anchors the activated ELMO/DOCK180 module in place for proper spatio-temporal regulation of Rac activation and signaling.

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Tous les organismes, les animaux, les plantes et les microbes, sont composés de cellules polarisées, en affichant un positionnement asymétrique des organites sub-cellulaires ou des structures. Le contrôle de polarité a été étudié chez les eucaryotes pendant une longue période, et a été montré pour être impliqués dans de nombreux processus physiologiques, tels que l'embryogenèse, le cancer métastatique et les maladies dégénératives des neurones. Chez les procaryotes, des études de polarité ne sont apparues récemment avec le développement de la microscopie à fluorescence sensibles. Ces études ont révélé que les cellules procaryotes sont en fait très organisé et une masse croissante de la littérature a montré que les cellules bactériennes également utiliser des radeaux lipidiques, courbure membranaire, la paroi cellulaire et un cytosquelette complexe pour diriger le positionnement spécifique de structures subcellulaires.Petites GTPases de la superfamille Ras sont des éléments réglementaires polarisation répandue chez les eucaryotes. Malgré l'existence depuis longtemps de ces petites GTPases dans les génomes procaryotes, leur fonction a jamais été étudiée. Pendant ce travail de thèse, nous avons trouvé, pour la première fois, qu'une petite GTPase, MglA et de sa protéine apparentée Activation GTPase (GAP) MglB, directe une dynamique axe antéro-postérieur à la motilité directe en forme de tige deltaproteobacterium Myxococcus xanthus. Dans ce processus, MglA s'accumule dans son état lié au GTP au niveau du pôle leader de cellules, en activant les machineries motilité. Ce schéma de localisation est maintenue par MglB, qui localise le pôle opposé, le blocage de l'accumulation MglA à ce pôle à travers son activité GAP. Remarquablement, les deux protéines passer leur localisation synchrone, ce qui correspond à un changement dramatique dans la direction du mouvement cellulaire (inversion). Ce commutateur est réglementé par un système chimiosensoriels-like, Frz. Dans une deuxième partie de ce travail, nous avons identifié un régulateur de protéine de réponse, RomR qui est essentiel pour le regroupement polaire de MglA. Interdépendances complexes entre la localisation RomR, MglA et MglB indiquent que ces protéines pourraient constituer un complexe de polarité dynamique de trois protéines qui reçoit Frz de signalisation pour passer l'axe de polarité. En conclusion, les résultats de ce travail de thèse suggère que M. xanthus intégré un module de polarité eucaryotes-like (MglAB) dans un procaryote spécifique (Frz) réseau de signalisation pour réguler sa motilité. Une telle réglementation est distincte sous forme de petites protéines G des règlements, qui sont généralement couplés à la protéine G récepteurs couplés (GPCR) chez les eucaryotes. Enfin, ce travail ouvre la voie pour comprendre comment la réglementation seule la motilité cellulaire sont intégrés pour générer des comportements commandés multicellulaires donnant naissance à des structures primitives de développement, par exemple, la morphogenèse du corps fructifères. D'autre part, ce travail fournit également un exemple d'analyser les étapes évolutives donnant lieu à des réseaux de signalisation. / All organisms, animals, plants and microbes, are composed of polarized cells, displaying asymmetric positioning of sub-cellular organelles or structures. Polarity control has been studied in eukaryotes for a long time, and has been shown to be involved in many physiological processes, such as embryogenesis, cancer metastasis and neuron degenerative diseases. In prokaryotes, polarity studies only emerged recently with the development of sensitive fluorescent microscopy. These studies revealed that prokaryotic cells are in fact highly organized and a growing body of literature has shown that bacterial cells also use lipid rafts, membrane curvature, the cell wall and a complex cytoskeleton to direct the specific positioning of subcellular structures.Small GTPases of the Ras superfamily are widespread polarization regulatory elements in eukaryotes. Despite the long known existence of such small GTPases in prokaryotic genomes, their function has never been studied. During this thesis work, we found, for the first time, that a small GTPase, MglA and its cognate GTPase Activating Protein (GAP) MglB, direct a dynamic anterior- posterior axis to direct motility of the rod-shaped deltaproteobacterium Myxococcus xanthus. In this process, MglA accumulates in its GTP-bound state at the leading cell pole, activating the motility machineries. This localization pattern is maintained by MglB, which localizes at the opposite pole, blocking MglA accumulation at this pole through its GAP activity. Remarkably, both proteins switch their localization synchronously, which correlates with a dramatic change in the direction of cell movement (reversal). This switch is regulated by a chemosensory-like system, Frz. In a second part of this work, we identified a response regulator protein, RomR which is essential for the polar clustering of MglA. Intricate localization interdependencies between Romr, MglA and MglB indicate that these proteins might constitute a dynamic three-protein polarity complex that receives Frz-signaling to switch the polarity axis. In conclusion, the results from this thesis work suggest that M. xanthus integrated a eukaryotic-like polarity module (MglAB) into a prokaryotic- specific (Frz) signaling network to regulate its motility. Such regulation is distinct form small G- protein regulations, which are generally coupled to G-protein coupled receptors (GPCRs) in eukaryotes. Finally, this work paves the way to understand how single cell motility regulations are integrated to generate ordered multicellular behaviors giving rise to primitive developmental structures, for example fruiting body morphogenesis. On the other hand, this work also provides an example to analyze the evolutionary steps giving rise to signaling networks.

Linfócitos T CD8 e células NK atuam no combate à infecções por bactérias intracelulares, vírus e células tumorais, provocando a morte dessas células por meio da secreção de grânulos citotóxicos. Proteínas RAB GTPase têm se destacado em estudos de tráfego intracelular, porém, são escassos dados sobre o papel destas proteínas em células citóxicas. Um estudo prospectivo de proteômica realizado por nosso grupo identificou a RAB2A, RAB5A, RAB17 e RAB18 em grânulos citotóxicos. Análises mais aprofundadas revelaram que a RAB2A está associada a proteínas como LAMP-1 e LAMP-2, enquanto que RAB5A, RAB17 e RAB18 estavam presentes na mesma linhagem em um contexto não contemplado neste estudo. Desenvolvemos ainda uma abordagem de silenciamento gênico da RAB2A, e por fim, adaptamos uma série de protocolos de simples execução e baixo custo para avaliar funções efetoras de células NK. O conhecimento da maquinaria secretória é fundamental, uma vez que defeitos nas vias de tráfego intracelular constituem a base de um grande número de doenças que desencadeiam quadros fatais. / CD8 T lymphocytes and NK cells fight against infections by intracellular bacteria, viruses and tumor cells by killing those cells through the secretion of cytotoxic granules. RAB GTPase has been highlighted in studies of intracellular trafficking, however there are scarce reports regarding the role of these proteins in cytotoxic cells. A proteomic study performed by our group identified RAB2A, RAB5A, RAB17 and RAB18 in cytotoxic granules. Further analysis revealed that RAB2A is associated with LAMP-1 and LAMP-2, while RAB5A, RAB17 and RAB18 were present in the same cell line, but in a context not included in this study. We also have developed a gene silencing approach for RAB2A and adapted a number of protocols, simple and low-cost, that can be used to evaluate effector functions of natural killer cells The knowledge of secretory machinery involved in the movement cytotoxic granules of cytotoxic cells is critical, since defects in intracellular trafficking pathways constitute the basis for a large number of diseases which trigger death.

Le rétromère est un complexe multiprotéique qui régule le trafic intracellulaire et qui est conservé chez les eucaryotes. Chez la levure et les animaux, le complexe rétromère est impliqué dans le recyclage des régulateurs de la polarité cellulaire. Chez Arabidopsis thaliana, les travaux de notre équipe ont démontré que ce complexe est requis pour la localisation polaire des transporteurs d’auxine de la famille PIN. Au cours de mon travail de thèse, j’ai approfondi la caractérisation de la fonction du composant AtVPS29 du rétromère et démontré son rôle dans la régulation de la croissance cellulaire polarisée et dans la polarité planaire chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Les mutants perte de fonction vps29 présentent des défauts de croissance polaire des tubes polliniques et des poils absorbants, et également des défauts de morphogenèse des cellules épidermiques des cotylédons. Les petites GTPases ROP (Rho-Of-Plant) sont les régulateurs majeurs de la polarité cellulaire chez les plantes. ROP1 est requis pour la croissance du tube pollinique, et ROP2 pour la morphogenèse des poils absorbants et des cellules épidermiques des cotylédons. Le travail décrit ici est destiné à comprendre les liens fonctionnels et moléculaires entre AtVPS29 et les protéines ROP. Mes résultats suggèrent que l’activité de ROP2 est dépendante de VPS29. J’ai également établi que VPS29 était nécessaire pour assurer la localisation subcellulaire de ROP1 et de ROP2. Chez les mutants vps29, l’analyse de la voie de signalisation ROP2 suggère que l’activité de ROP2 est fortement dérégulée. Ainsi, nos données montrent que le complexe rétromère de plante régule le trafic membranaire des protéines ROP, assurant la localisation de leur activité dans les bons territoires cellulaires, et in fine, la croissance polaire des cellules. Ces données suggèrent que le complexe rétromère de plante pourrait réguler la formation et/ou le maintien de la polarité chez différents types de cellules végétales. Ils soulignent également l’importance du trafic endocytique dans la régulation de la polarité cellulaire chez les plantes. / The retromer complex is a coat pentameric complex, strongly conserved among eukaryotes and involved in intracellular trafficking. In yeast and animals, the retromer complex participates in the polar targeting of regulators of cell polarity. Our group has previously shown that the retromer is required for the polar localization of auxin carrier proteins of the PIN-FORMED (PIN) family in Arabidopsis thaliana. Here, I demonstrate that the plant retromer component AtVPS29 regulates cell polarity, with a specific focus on polar cell growth and planar cell polarity in the model plant A. thaliana. Null vps29 mutants display defects in both pollen tube and root hair tip growth, as well as in the diffuse polar growth of epidermal pavement cells. Rho-of-plant (ROP) small GTPases are master regulators of cell polarity in plants. ROP1 is required for pollen tube growth, while ROP2 coordinates root hair and pavement cell morphogenesis. The aim of my work was focused on the functional and the molecular links between the AtVPS29 and ROP proteins. My results indicate that ROP2 signaling activity is VPS29-dependent in root hairs and in pavement cells. They also suggest that VPS29 is required for the proper localization of ROP1 and ROP2. The analysis of ROP2 signaling pathway in the vps29 mutant, suggest that ROP2 activity is completely deregulated in the absence of VPS29. Altogether, my data indicate that the plant retromer mediates ROP membrane trafficking to allow the proper localization of its activity, a prerequisite for cell polar growth. These findings suggest that the plant retromer might regulate maintenance and/or establishment of cell polarity in various cell types and further emphasize the importance of endocytic recycling in the regulation of polarity in plants.

Candida albicans est un pathogène fongique opportuniste de l’Homme, qui peut causer des infections superficielles mais aussi systémiques chez les patients immunodéprimés. Sa virulence est associée à sa capacité de changer d’une forme bourgeonnante à une forme hyphale. La petite GTPase de type Rho, Cdc42, est critique pour la croissance filamenteuse et, sous forme activée, sa localisation est restreinte à l’extrémité des hyphes. J’ai utilisé un système photoactivable, constitué des domaines d’Arabidopsis thaliana Cry2PHR-CibN, pour contrôler le recrutement de Cdc42 constitutivement actif à la membrane plasmique. J'ai déterminé comment le photo-recrutement de Cdc42 constitutivement actif perturbe la croissance filamenteuse et où, quand et comment une nouvelle croissance filamenteuse est ré-initiée. Mes résultats démontrent que, lors du photo-recrutement de Cdc42 constitutivement actif, l'extension du filament cesse puis un nouveau site de croissance s’établit dans la cellule. La localisation de ce nouveau site de croissance est corrélée à la longueur du filament. J'ai étudié les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le désassemblage du site de croissance initial et l'emplacement spécifique du nouveau site de croissance filamenteuse. Dans les hyphes en croissance, un «cluster» de vésicules, appelé Spitzenkörper, est localisé à l'extrémité du filament. Lors du photo-recrutement de Cdc42 constitutivement actif, un nouveau «cluster» de vésicules, de composition similaire à celui du Spitzenkörper initial, apparaît dans la cellule mère. J'ai suivi la dynamique du Spitzenkörper et la localisation de Cdc42 sous forme activée, des sites d'endocytose, des vésicules de sécrétion et des câbles d’actine suite à la perturbation du site de croissance initial dans le filament. Dans l’ensemble, mes résultats indiquent qu'il existe une compétition pour la croissance entre le Spitzenkörper et le «cluster» de vésicules qui se forme immédiatement après le photo-recrutement de Cdc42 constitutivement actif et qu'un axe de polarité dynamique peut être établi en l'absence de croissance directionnelle. / Candida albicans is a fungal human pathogen that can cause life-threatening infections in immunocompromised patients, in part, due to its ability to switch between an oval budding form and a filamentous hyphal form. The small-Rho GTPase Cdc42 is crucial for filamentous growth and, in its active form, localizes as a tight cluster at the tips of growing hyphae. I have used a light-activated membrane recruitment system comprised of the Arabidopsis thaliana Cry2PHR-CibN domains to control the recruitment of constitutively active Cdc42 to the plasma membrane. I have determined how photorecruitment of constitutively active Cdc42 perturbs filamentous growth and where, when and how new filamentous growth is subsequently initiated. My results demonstrate that, upon photorecruitment of constitutively active Cdc42, filament extension is abrogated and a new growth site can be established in the cell. Location of a new filamentous growth site correlates with the length of the initial filament. I have investigated the molecular mechanisms that underlie the disassembly of an initial growth site and the specific location of the new filamentous growth site. In growing hyphae a cluster of vesicles, referred to as a Spitzenkörper, is localized at the tip of the filament. Upon photorecruitment of constitutively active Cdc42, a new cluster of vesicles, with a composition similar to that of the initial Spitzenkörper, appears in the mother cell. I have followed the dynamics of the Spitzenkörper, active Cdc42, sites of endocytosis, secretory vesicles and actin cables subsequent to disruption of the initial growth site in the filament. Taken together, my results suggest that there is competition for growth between the Spitzenkörper and the cluster of vesicles that forms immediately after the photorecruitment of constitutively active Cdc42 and that a dynamic polarity axis can be established in the absence of directional growth.

L'étude des mécanismes moléculaires de la carcinogenèse hépatique a montré l'implication de la RhoGTPase, Rnd3/RhoE. La protéine Rnd3 est sous-exprimée dans le carcinome hépatocellulaire et la diminution de son expression engendre, in vitro, une augmentation de l'invasion des hépatocytes tumoraux. Sur la base de ces travaux, ce projet de thèse s'est décomposé en deux axes. Le premier axe a été d'étudier le rôle de Rnd3 dans la carcinogenèse ainsi que dans la physiologie hépatique in vivo. Ce projet a débuté par la génération d'un modèle murin présentant un KO conditionnel ethépato-spécifique de Rnd3 {KORnd3). L'utilisation de plusieurs stratégies s'est révélée nécessairepour obtenir une extinction protéique de Rnd3 dans la majorité des hépatocytes chez les souris KO. Après hépatectomie des deux tiers, les premiers résultats montrent un retard de régénération hépatique chez les souris KORnd3. En ce qui concerne la carcinogenèse hépatique, nous avons mis en place un modèle de carcinogène chimique en utilisant le diéthylnitrosamine et un modèle de carcinogénèse spontanée chez les animaux KORnd3Hep. Le deuxième axe a porté sur l'étude des invadosomes, structures d'actine impliquées dans l'invasion cellulaire. Nous avons établi une signature minimum pour les invadosomes, impliquant la GTPase Cdc42 et la protéine d'échafaudage TksS. Nos résultats suggèrent également une implication de Rnd3 dans la fonction de dégradation des invadosomes. Ce travail de thèse a ainsi permis d'apporter de nouveaux outils et de nouvellespistes quant à l'implication de Rnd3 dans la physiopathologie hépatique et dans l'invasion cellulaire. / The study of the molecular mechanisms involved in hepatic carcinogenesis revealed the significant down-regulation of the RhoGTPase Rnd3/RhoE in hepatocellular carcinoma as compared to non- tumor liver. Rnd3 down-regulation provides an invasive advantage to tumor hepatocytes suggesting that RND3 might represent a metastasis suppressor gene in hepatocellular carcinoma. This PhD work was divided in two axes. We first studied the role of Rnd3 in the mouse liver using carcinogenesis and liver regeneration protocols. We thus generated conditional and liver specific Rnd3 KO mice (KORnd3Hep). The first results obtained after partial hepatectomy suggest a delay in liver regeneration for the KORnd3Hep mice. We also developed a carcinogenesis strategy in KORnd3Hep mice using diethylnitrosamine treatment. The second axis focused on invadosomes, which are actin-based structures involved in cell invasion. We have determined a minimal and universal molecular signaturefor functional invadosomes, which involves the RhoGTPase Cdc42 and the adaptor protein TksS. We also highlighted the role of Rnd3 in invadosome degradation. ln conclusion, this work provides new tools and new insights on Rnd3 function in hepatic physiopathology and cellular invasion.