Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: Galactooligosaccharides are produced by the transglycosylation activity of β-galactosidases (β-gal, EC 3.2.1.23) when utilising lactose as a substrate. They have emerged as important constituents used in the food and pharmaceutical industries owing to their prebiotic properties. Although transglycosylation was discovered in 1951 (Wallenfels 1951), and a number of β-gals have had their transglycosylation activity characterised, the activities of these enzymes are not optimal for industrial use. Their tendency to favour the hydrolytic reaction over the transglycosylation reaction, coupled with the production of shorter chain oligosaccharides has driven scientists to investigate altering protein structure both to increase chain lengths and the amount of oligosaccharide produced at lower substrate concentrations. In an attempt to alter the amount of oligosaccharide produced by a metagenomically derived β-gal belonging to the glycosyl hydrolase 2 family, random and site-directed mutagenesis were used. A randomly mutagenised library was screened on SOB agar plates containing 5% (w/v) lactose which should select for clones that synthesise oligosaccharides at relatively low concentrations. No such activity was detected. Site-directed mutagenesis was also utilised to alter protein structure. It was confirmed that the β-gal utilised in this study belonged to the glycosyl hydrolase 2 family through mutation of the predicted catalytic acid/base glutamic acid to a non-catalytic residue, thus removing activity. Another mutation was utilised to investigate if it was possible to increase the degree of polymerisation of oligosaccharides produced by the β-gal. This mutation was successful in increasing the degree of polymerisation. Biochemical characterisation of the β-gal revealed that it exhibited optimal activity at pH 8.0, with a temperature optimum of 30°C. The β-gal exhibited a Km and Vmax of 54.23 mM and 2.26 μmol/minute-1/mg protein-1 respectively, similar to kinetic parameters that have been determined for a number of previously characterised enzymes. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Galaktooligosakkariede word geproduseer deur die transglikosileering aktiwiteit van β-galaktosidase (β-gal, EG 3.2.1.23) wanneer hulle laktose as 'n substraat gebruik. Hierdie oligosakkariede het na vore gekom as 'n belangrike bestandeel vir gebruik in die voedsel en farmaseutiese bedryf as gevolg van hulle prebiotiese eienskappe. Alhoewel transglycosylation al in 1951 ontdek is (Wallenfels 1951) en 'n aantal β-gals se transglycosylation aktiwiteit gekenmerk is, is hierdie ensieme nie ideaal vir industriële toepassings nie. Die geneigdheid om die hidrolitiese reaksie oor die transglycosylation reaksie bevoordeel, tesame met die produksie van korter oligosakkariede het wetenskaplikes ondersoek genoop om die proteïenstruktuur te verander om ketting-lengte en die kwantiteit van oligosakkaried geproduseer teen laer substraat konsentrasies te verhoog. In 'n poging om die opbrengs van die oligosakkaried wat deur 'n metagenomiese β-gal wat aan die glycosyl hidrolase 2 familie behoort te verander, is lukraak en terrein gerigte-mutagenese gebruik. Die mutagenese biblioteek is op SOB agarplate met 5% (w/v) lactose gekeur, om klone wat die fenotipe wat verband hou met die produksie oligosakkaried teen relatiewe lae konsentrasies te selekteer. Geen aktiwiteit is opgemerk nie. Terrein gerigte-mutagenese is ook gebruik om die proteïenstruktuur te verander. Deur ‘n bioinformatiese voorspelling, is dit bevestig dat die β-gal wat in hiedie studie gebruik word tot die glycosyl hidrolase 2 familie behoort. Dit is gedoen deur mutasie van die voorspelde katalitiese suur/basis glutamiensuur na 'n nie-katalitiese oorskot, dus die verwydering van aktiwiteit. Nog ‘n mutasie is gebruik om te ondersoek of dit moontlik was om die ketting-lengte van die oligosakkaried wat deur die β-gal geproduseer is te verhoog. Die mutasie was suksesvol in die verhoging van die oligosakkaried wat geproduseer was. Biochemiese karakterisering van die β-gal het getoon dat hierdie β-gal optimale aktiwiteit het by pH 8.0, met 'n optimum temperatuur van 30°C. Die β-gal het 'n Km en Vmax van 54.23 mM en 2.26 μmol/minute-1/mg proteïen-1 onderskeidelik, soortgelyk aan kinetiese parameters wat bepaal word vir ensieme wat voorheen gekenmerk is.

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Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-18T18:24:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 370583 bytes, checksum: 949df73c78eb106c4c4cee4a0d7df145 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T18:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 370583 bytes, checksum: 949df73c78eb106c4c4cee4a0d7df145 (MD5) Previous issue date: 2002-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, o que limita o seu consumo. Dentre os sintomas desagradáveis, destaca-se a flatulência, que é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares das sementes ou do extrato hidrossolúvel poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. Vários processos para redução do conteúdo de RO em derivados de soja já foram descritos; entretanto, a hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o mais promissor. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência da α-galactosidase de sementes de soja em germinação para hidrolisar os RO presentes no extrato de soja. Sementes de soja (Glycine max , vr. CAC-1) foram germinadas por 60 h, a 27 °C. O extrato enzimático foi obtido pela trituração das sementes em tampão citrato/fosfato de sódio, pH 5,0. A suspensão foi filtrada e centrifugada, e o extrato enzimático resultante, utilizado para a purificação da α-galactosidase. Em uma primeira abordagem, o extrato enzimático foi fracionado em um sistema de duas fases aquosas (SDFA), formado por uma mistura de 16% (p/p) de PEG 1500, 16% (p/p) de fosfato de sódio pH 5,0 e 12% (p/p) de NaCl. A enzima presente na fase superior do SDFA foi dialisada e submetida à cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose, pH 4,0. As frações com atividade de α-galactosidase, eluídas com um gradiente de NaCl (0-0,8M), foram reunidas, concentradas por ultrafiltração, originando a α-galactosidase semi-purificada. A α-galactosidase foi purificada 12,4 vezes e o rendimento do processo de purificação foi de 13,5%. Atividade máxima de α-galactosidase foi detectada em pH 5-6 a 50 °C. A enzima manteve-se em torno de 100% da atividade original após pré- incubação por 3 h, a 35 e 40 °C, mas somente 50% da atividade original foi mantida após pré-incubação a 45 °C. K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose determinados pelo método do duplo-recíproco foram de 0,30 mM, 0,63 mM e 6,16 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade rafinose, seguido de ρNPGal, estaquiose e melibiose. Galactose, rafinose, melibiose, CuSO 4 , SDS e CAC-1l 2 atuaram como inibidores da atividade da enzima parcialmente purificada. Resultados do tratamento do leite de soja com a enzima mostraram redução de 72,3% de estaquiose e 89,2% de rafinose após um período de incubação de 6h, a 40 °C. Com o objetivo de aumentar o rendimento do processo de purificação, visando futuras aplicações em ensaios biológicos, um segundo protocolo foi estabelecido. O extrato enzimático obtido, como já descrito, foi submetido à crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio (20-50% de saturação) e cromatografia de filtração gélica em Sephadex G-100. A α-galactosidase foi semi purificada em quatro etapas, com índice de purificação de 21,33 vezes e recuperação de 44% da atividade enzimática. Em conclusão, observamos que a adição de α -galactosidase ao extrato de soja hidrolisou uma fração significativa dos carboidratos não digeríveis, estaquiose e rafinose, podendo diminuir a flatulência causada por esses oligossacarídeos e assim aumentar o uso desta fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal. Além disso, essa enzima apresenta características cinéticas compatíveis com as exigências para sua utilização em processos industriais, visando a diminuição nos teores dos oligossacarídeos de rafinose. / The ingestion of legume seeds, like soy and derived products, results in unpleasant symptoms, which limits its consumption. Among the unpleasant symptoms, flatulence is the major one, which results from the anaerobic metabolism of α-1,6-galactosides of raffinose (RO: Raffinose oligosaccharides) generally presents in legume seeds. Removal of those sugars from soy seeds or soybean derived products would have a positive impact in soy food consumption. Several processes for RO content reduction in soy products were described, however, enzymatic hydrolyze of RO by α-galactosidase seems to be the most promising. The objectives of this work were to text α -galactosidase the efficiency from germinated soy seeds to hydrolyze RO present in soybean milk. Soy seeds (Glycine max , cv CAC-1) were allowed to germinate for 60 h, at 27 °C. The enzymatic extract was obtained by seed trituration in a citrate /sodium phosphate, pH 5.0. Then the suspension was filtered, centrifuged and the resulting enzymatic crude extract used for α-galactosidase purification. First, the enzymatic extract was fractionated in a Aqueous Two-Phase System (ATPS) consisted of a 16 % (w/w) polyethyleneglycol (PEG 1500) solution, 16% (w/w) of sodium phosphate pH 5.0 and 12% (w/w) of NaCl. The enzyme present in the upper phase of the ATPS was dialyzed and loaded onto a CM-Sepharose Fast Flow ionic exchange column, pH 4.0. The fractions with activity of α- galactosidase, were eluted with a gradient of NaCl (0-0.8M), they were pooled together, concentrated by ultra filtration, producing α-galactosidase partially purified. α-Galactosidase was partially purified in two stages. Purification index was 12.4 times with enzymatic activity recovery of 13.5%. Maximum α- galactosidase activity was detected in pH range of 5-6 and 50 °C. The enzyme maintained near 100% of original activity after pre-incubation for 3h at 35 and 40 °C, but only 50% of original activity after pre-incubation at 45 °C. K M app values for hydrolyze of ρNPGal, melibiose and rafinose was of 0.30, 0.63 and 6.16 mM, respectively. The enzyme was able to hydrolyze better rafinose, followed by ρNPGal, stachyose and melibiose. Galactose, raffinose, melibiose, CuSO 4 , SDS and CAC-1l 2 inhibited the enzyme activity. Soybean milk treated with α-galactosidase showed reduction of 72.3 and 89.2% in the stachyose and raffinose contents, respectively, after incubation for 6h at 40oC. In order to increasing the purification process efficiency, seeking future application in biological assays, a second protocol was established. Enzymatic extract was submitted to cryoprecipitation, acid precipitation and fractionation with ammonium sulphate (20-50% of saturation) and filtrated by gel chromatography. The extract was loaded onto Sephadex G-100 column. α-Galactosidase was partially purified in four stages. Purification index was 21.33 times with enzymatic activity recovery of 44%. In conclusion, we observed that the addition of α-galactosidase to soybean extract hydrolyzed a significant fraction of the carbohydrates non digestible, rafinose oligosaccharides, that can reduce the flatulence caused by those oligosaccharides and also can increase the use of this protein vegetable source in the human and animal feeding. Besides, that enzyme presents compatible kinetic characteristics for use in industrial processes, with the objective to reduce rafinose oligosaccharides content. / Dissertação importada do Alexandria

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Orientador: Glaucia Maria Postore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:17:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_MareciMendesde_D.pdf: 1394335 bytes, checksum: aeb99b8a1fe68ffc5a8b6d83ce4b6809 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Os galactooligossacarídeos são produzidos a partir da lactose por ação da B-galactosidase com atividade de transgalactosilação. São carboidratos não digeríveis, sendo resistentes às enzimas digestivas e fermentados por bifidobactérias. Os benefícios da ingestão de galactooligossacarídeos são de elevar a população de bifidobactérias no cólon e por efeito antagônico, suprimir a atividade de bactérias putrefativas e reduzir a formação de produtos tóxicos por fermentação. O microrganismo Scopulariopsis sp acumulou grande quantidade de B-galactosidase por fermentação semi-sólida e a enzima foi produzida constitutivamente. A enzima obtida foi fracionada com sulfato de amônio, acetona e etanol, sendo a precipitação com sulfato de amônio a que apresentou melhores resultados. O extrato enzimático foi caracterizado bioquimicamente, apresentando um pH ótimo de 4,5 e temperatura ótima de 65°C, e a estabilidade enzimática foi em pH 5,0 e 50°C. A enzima apresentou atividade de transgalactosilação quando avaliada por cromatografia de papel. A b-?galactosidase extracelular de Scopulariopsis sp foi semi-purificada e caracterizada. A enzima foi semi-purificada 13 vezes com um rendimento de aproximadamente 14%. O peso molecular da enzima foi estimado por filtração em gel em torno de 98 KDa. Algumas características da enzima foram determinadas usando o-nitrofenil-??galactopiranosideo (ONPG) como substrato. O pH e temperatura ótimos de atividade foram em torno de 4,5 e 60°C, respectivamente. A enzima foi estável em 40°C por 24 horas e pH 5,0. Os valores de Km e Vmax para ONPG foram 2,28mM e 123?moles/mL/min, respectivamente. Os cátions Fe+2, Fe+3 e Mn+2 ativaram a enzima e N-bromosuccinimida inibiu sua atividade. A atividade de transgalactosilação da ??galactosidase foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência. A temperatura ótima para atividade de galactosiltransferase foi entre 35 e 45°C e o efeito do pH foi mínimo em alta concentração de lactose; a concentração de enzima para síntese de GOS foi 4-6 U/mL. Quando uma solução de lactose a 40% (p/v) em 0,1 M de tampão acetato de sódio pH 4,5 a 45°C foi incubada com 6 U/mL de ?-galactosidase, a enzima converteu 30% da lactose em galactooligossacarídeos. Foi utilizado planejamento fatorial completo de 2 níveis para estudar o efeito da enzima (4,0 e 8,0 U/mL), pH (5,0 e 7,0) e temperatura (35°C e 45°C) na formação enzimática de galactooligossacarídeos a partir da lactose. Uma diminuição da concentração de enzima e temperatura, e um aumento do valor de pH resultou uma maior produção de galactooligossacarídeos. O produto obtido em maior quantidade foi identificado com 4'galactosil-lactose por cromatografia líquida de alta eficiência / Abstract: Galactooligosaccharides are produced frem lactose by the action of B?-galactosidases which have transgalactosylation activity. They are non-digestible carbohydrates, which are resistant to gastrointestinal digestive enzymes and are fermented by bifidobacteria. The benefits of galactooligosaccharide ingestion arise from increased population of bifidobacteria in the colon which, by their antagonistic effect, suppress the activity of putrefactive bacteria and reduce the formation of toxic fermentation products. The strain of Scopulariopsis accumulated large amounts of the ??galactosidase by semi-solid fermentation and the enzyme was produced constitutively. The enzyme obtained was fractionated with ammonium sulphate, acetone and ethanol, the precipitation with ammonium sulphate showed better results. The enzymatic extract was biochemically characterized, showing an optimum pH of 4.5 and optimum temperature of 65°C, and the enzymatic stability was at pH 5.0 and 50°C. The enzyme showed transgalactosylation activity, when it was evaluated by paper chromatography. Extracellular ??galactosidase from Scopulariopsis sp was semi-purified. The enzyme was a semi-purified 13-fold with a yield of about 14%. The molecular weight of the enzyme was estimated to be about 98 KDa by gel filtration. Some enzyme characteristics were determined using o-nitrophenyl-??galactopyranoside (ONPG) as substrate. The pH and temperature optimum of the activity were about 4.5 and 60°C, respectively. The enzyme was stable at 40°C for 24 hours and pH 5.0. The Km and Vmax values for ONPG were 2,28mM and 123llmoles/mUmin, respectively. The cations Fe+2, Fe+3 and Mn+2 activated the enzyme and N- bromosuccinimide inhibited activity. Transgalactosylation activity of the ??galactosidase was evaluated by high pressure liquid chromatography. The optimum temperature for galactosyltransferase activity was in the range of 35 to 45°C and the pH effect was minimal at high lactose concentration; the enzyme concentration for GOS synthesis was 4-6 U/mL. When 40% (w/v) lactose solution (in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 4.5, 45°C) was incubated with 6 U/mL of ??galactosidase, the enzyme converted 30% of the lactose in galactooligosaccharides. Two-Ievel full-factorial design experiments were designed to study effects of enzyme (4.0 and 8.0 U/mL), pH (5.0 and 7.0) and temperature (35°C e 45°C) on enzymatic formation of galactooligosaccharides from lactose. A decrease of enzyme concentration and temperature and an increase of pH value resulted in a higher galactooligosaccharides production. The major product was identified as 4'galactosyl-lactose by high performance liquid chromatography / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Ranulfo Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-20T18:52:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flores_SimoneHickmann_M.pdf: 3479929 bytes, checksum: 5c22c3b142d6f7436af633378a5e4c36 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Soro de queijo integral e/ou desproteinado por acidificação e aquecimento podem ser utilizados como meio de cultura para produção de lactase de Erwinia aroideae NRRL B-132. A maior atividade de lactase obtida em fermentação de soro de queijo desproteinado (434,10 UI/m1) foi com 55 g/l de lactose, em doze horas de fermentação em erlenrneyer com produção de 1,9 g/l de massa celular seca. A suplememtação do meio de cultura com 5g/1 de asparagina aumentou em 15% a atividade da enzima intracelular e 202% a atividade da enzima extracelular. A temperatura ótima de incubação da enzima para hidrólise de ONPG foi 45°C e pH na faixa de 7,5 a 8,0. Em fermentador de 6 litros variou-se a temperatura de fermentação (25, 27, 30, 32 e 35°C) mantendo-se a taxa de aeração em 1 vvm e rotação de 350 rpm. Obteve-se maior atividade de lactase quando foi utilizado soro de queijo integral. A 30°C a produção em lactase extracelular foi maior e a 32°C houve maior produção de lactase intracelular. Utilizou-se o modelo matemático de Michaelis-Mentem para carac~erizar cineticamente a enzima, obtendo-se o valor para K.m de 3,46, 3,62, 3,85 e 0,60: mM para as temperaturas de 20, 23, 25 e 27°C ,respectivamente. A energia de ativação para K.m, determinada pelo modelo de Arrhenius foi 3.84 Kcal/mol. A inativação da enzima nas temperaturas de 45, 47, 49 e 50°C seguiu cinética de primeira ordem com constante de inativação Kd de 23,20, 47,60, 60,20 e 90,90 mM, respectivamente, e energia de ativação para a desnaturação Ed 51,50 KcaVmol. A enzima apresentou baixa estabilidade quando quando pré-incubada em pH diferente do ótimo por 20 minutos. / Abstract: Production of intra and extracellular /3-galactosidase by Erwinia aroidea grown in cheese whey was studied. Preliminary experiments with edenrneyers and desproteinized cheese whey showed the optimallactose concentration of 5.5% when the lactase activity achieved 434.10 VI/ml and cellular dried mass' 1.9048 g/l for 12 hours culture. Optimals temperature and pH for ONPG hidrolysis was 45°C and 7.5, respectively. Medium culture suplementation with asparagine (5g/l) caused an increase of 15% in intracellular enzyme activity and of 202% in extracellular enzyme activity. Fermentation experi1:nents were carried out in 6 liters fermenter; it was used integral and deproteinized cheese whey under temperatures of 25, 27, 30, 32 and 35° C, 350 rpm and 1 vvm for 12 hours culture. When integral cheese whey was used the largest activity was achieved compared with the deproteinized cheese whey. The production of extracellular enzyme was greater at 30°C and the largest production of intracellular enzyme was obtained at 32°C. Enzyme inibition by temperature ocçured above 32°C. Glucose in culture medium caused enzyme carbon catabolite repression. Kinectis parameters was obtained through Michaelis-Mentem model ; Km for ONPG was 3.46 mM, 3.62 mM, 3.85 mM and 0.5960 mM at 20, 23, 25 and 27°C, respectively. The activation energy for ONPG hidrolysis was 3.84 Kcallmol °K. In stability study, it was obtained Kd values of 23.20 mM, 47.60 mM, 60.20 mM and 90.90 mM at 45, 47, 49 and 50°C, respectively. The activation energy for denaturation was 51.50 Kcal/mol °K. Enzyme low pH stability was observed and this fact means that it must be used around the optimum value (7.5 - 8.0). / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

No lúmen do intestino médio da larva de Tenebrio molitor existem 4 β-glicosidases (denominadas 1, 2, 3a e 3b), que não estão presentes na comida do animal. Elas foram purificadas usando-se técnicas de eletroforese e cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. A β-Glicosidase 1 (Mr 59.000) é instável a 30°C mas é estabilizada na presença do substrato. Ela praticamente não tem atividade sobre galactosídeos e cliva di- e oligossacarídeos. A enzima possui apenas 1 sítio ativo que apresenta 4 subsítios para ligação de glicose. Seu papel fisiológico deve ser o da clivagem de oligo- e principalmente dissacarídeos. A β-Glicosidase 2 (Mr 67.000) é muito instável a 30°C e hidrolisar com maior eficiência galactosídeos sintéticos, cliva muito mal lactose e é incapaz de clivar glucosídeos. Ela apresenta dois sítios ativos sendo que um deles cliva MUβDgal e lactose, que é ativado por Triton X-100, enquanto o outro não é ativado pelo detergente e hidrolisa NPβDgal e NPβDfuc. O papel fisiológico para esta enzima não está claro, mas imagina-se que ela esteja envolvida na digestão de galcatolipídeos. As β-Glicosidases 3a e 3b (Mr 59.000) parecem ser isoformas, uma vez que elas têm parâmetros cinéticos semelhantes, perfis de eluição, de peptídeos gerados por clivagem proteolítica, em HPLC idênticos e a mesma seqüência de aminoácidos para um peptídeo interno comum. Um anticorpo específico produzido contra a β-Glicosidase 3a reconhece a β-Glicosidase 3b, mas não reconhece as β-Glicosidases 1 e 2. Dois clones foram obtidos usando esse anticorpo para selecionar uma biblioteca de cDNA obtida dos rnRNAs do intestino médio de Tenebrio molitor. O resultado final mostrou um cDNA de 1.570 pb codificando para uma proteína madura de 485 aminoácidos. As proteínas codificadas pelos dois cDNAs têm somente 4 aminoácidos de diferentes e podem corresponder às β-Glicosidases 3a e 3b. As seqüências mostraram uma alta similaridade com proteínas da família 1 de glicosídeo hidrolases e codificam todos os peptídeos seqüenciados a partir da clivagem das β-Glicosidases 3a e 3b purificadas. Através de imunocitolocalização usando o anticorpo que reconhece as β-Glicosidases 3a e 3b, foi mostrado que essas são secretadas na parte posterior do intestino médio por uma via exocítica. Essas enzimas tem quatro subsítios para a ligação da glicose e podem hidrolisar di- e oligossacarídeos, alquil glicosídeos e glicosídeos tóxicos de plantas. Experimentos de competição entre substratos, mostraram que elas têm só um sítio ativo responsável para a hidrólise de todos os substratos. Seu papel deve ser principalmente a digestão intermediária de hemiceluloses e celulose. / In the midgut lumen of Tenebrio molitor larvae there are 4 β-glycosidases (named 1, 2, 3a and 3b), not present in the animal food. They were purified with electrophoresis, ion exchange and hydrophobic chromatographies. β-glycosidase 1 (relative molecular weight - Mr 59,000) is unstable at 30°C but is stabilized by substrates. The enzyme hydrolyses di- and oligoglucosides and has a residual activity against galactosides. It has 4 subsites for glucose binding in the active site and its physiological role is the hydrolysis of oligo- and mainly disaccharides. β-glycosidase 2 (Mr 67,000) is unstable at 30°C and hydrolyses efficiently only synthetic galactosides, has poor activity against lactose and is unable to use glucosides as substrates. This enzyme has two active sites. One of them is activated by Triton X-100 and hydrolyses MUβDgal. The other active site is not activated by the detergent and act upon NPβDgal and NPβDfuc. The physiological role ofthis enzyme may be the digestion of galactolipids. The β-glycosidases 3a and 3b (Mr 59,000) are likely isoforms, since they have similar kinetic parameters, identical HPLC peptide elution patterns after proteolytic cleavage and the same amino acid sequence of an internal peptide. A specific antibody raised against β-glycosidase 3a recognizes β-glycosidase 3b, but not β-glycosidase 1 and 2. Two clones were obtained screening a cDNA library, trom Tenebrio molitor midgut mRNA, with this antibody. The final result showed a cDNA of 1,570 pb coding for 485 amino acids in mature protein. The protein sequences showed high similarity with family 1 glycoside hydrolases and have the same amino acid sequence determined for peptides obtained after proteolytic hydrolysis of β-glycosidase 3a and 3b. The immunocytolocalization with this antibody showed that β-glycosidase 3a and 3b are secreted by exocytosis of small vesicles present in posterior midgut. These enzymes have four subsites for glucose binding and can hydrolyse di- and oligosaccharides, alkyl glucosides and toxic plant glucosides. Substrate competition experiments showed that they have only one active site responsible for the hydrolysis of all substrates. Their role may be mainly the intermediate digestion of hemicelluloses and cellulose.

Orientadores: Francisco Maugeri Filho, Susana Juliano Kalil / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T02:58:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manera_AnaPaula_D.pdf: 2066521 bytes, checksum: 108d932fdf16225bc7cd32688323bd02 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Galacto-oligossacarídeos (GOS) são carboidratos não digeríveis por humanos, produzidos a partir da lactose por ação da enzima ?-galactosidase. São considerados ingredientes prebióticos e possuem propriedades favoráveis à saúde dos consumidores. Este trabalho teve como objetivo o estudo da produção de GOS a partir de células permeabilizadas de Kluyveromyces marxianus CCT 7082. A primeira etapa foi a otimização das condições de cultivo da levedura para a produção da enzima ?-galactosidase empregando como substratos os subprodutos agroindustriais, soro de queijo e água de maceração de milho, obtendo 1400 U/gcel em 24 h de fermentação. Em seguida estudou-se a permeabilização das células da levedura. Foram testados sete agentes permeabilizantes: etanol, isopropanol, butanol, acetona, brometo de cetiltrimetilamônio, Tween 80 e Triton X-100, tendo sido selecionado o isopropanol, para a etapa de otimização do processo de permeabilização, onde se avaliou o efeito da relação biomassa/isopropanol e da temperatura. Na caracterização da enzima, a ß-galactosidase das células permeabilizadas apresentou pH ótimo de 6,6 e temperatura ótima de 50°C, sendo esta mais estável no pH 7,0 e na temperatura de 30ºC. A energia de desnaturação foi 81,6 Kcal/mol. A cinética enzimática da enzima seguiu o modelo de Michaelis-Menten. O estudo da síntese de GOS, através de delineamentos experimentais, empregando as células permeabilizadas, resultou em 83 g/L de GOS. O emprego de fluidos pressurizados como meio reacional de reações enzimáticas podem favorecer a solubilidade dos compostos, as transferências de massa das reações, e aumentar a atividade e estabilidade de enzimas, assim sendo, estudou-se o comportamento da atividade enzimática da enzima das células permeabilizadas tratadas nessas condições. Foi realizado um delineamento composto central para cada fluido (n-butano, propano, CO2), sendo observado um aumento na atividade residual, em todos os ensaios dos delineamentos, de 110 a 211% dependendo do fluido. O tratamento com n-butano resultou na maior estabilidade da enzima: após 3 semanas de armazenamento a 10°C a enzima tratada manteve 96% de sua atividade. Estas células tratadas a alta pressão foram aplicadas na síntese de GOS em reator batelada a pressão atmosférica. Obteve-se aproximadamente 75 g/L de GOS para os três fluidos pressurizados e para as células permeabilizadas sem tratamento. Porém, a quantidade necessária de enzima (em gramas de células) para se obter a mesma atividade enzimática, foi bem menor para as enzimas tratadas a alta pressão, tendo em vista o aumento da atividade enzimática após o tratamento. Na etapa seguinte, estudou-se a síntese de GOS em reator batelada empregando como meio reacional fluidos pressurizados (n-butano, propano, CO2). Realizou-se um delineamento composto central para cada fluido, obtendo-se entre 65 e 83,4 g/L de GOS, dependendo do meio reacional. De acordo com os resultados deste trabalho, usando células de K. marxianus CCT 7082, pôde-se definir a metodologia empregando as células permeabilizadas, tratadas a alta pressão com n-butano e síntese em reator batelada a pressão atmosférica como a mais promissora para a produção de GOS / Abstract: Galactooligosaccharides (GOS) are humans non-digestible carbohydrates, produced from lactose by the action of the enzyme ?-galactosidase. They are considered prebiotic ingredients and have beneficial properties to the health of consumers. This work aimed the study of galacto-oligosaccharide production from permeabilized cells of Kluyveromyces marxianus CCT 7082. The first step was to optimize the yeast culture conditions in order to produce the ?-galactosidase enzyme, employing as substrates by-products from agriculture industries, such as cheese whey and corn steep liquor, it were obtained 1400 U/g in 24 h of fermentation. The next step was to study the yeast cell permeabilization. Seven permeabilizant agents were tested: ethanol, isopropanol, butanol, acetone, cetyl-trimethylammonium bromide, Tween 80 and Triton X-100. Isopropanol was selected for the optimization step of the permeabilization process, where the effect of the biomass/isopropanol ratio and the temperature on cell permeabilization were evaluated. Afterward, the ?-galactosidase from permeabilized cells was characterized presenting the optimum pH of 6.6 and the optimum temperature 50°C. The enzyme was more stable at pH 7.0 and 30°C temperature. The denaturation energy was 81.6 Kcal/mol. The enzyme kinetics followed Michaelis-Menten model. The GOS synthesis, studied through experimental designs, employing the permeabilized cells, resulted in 83 g/L of GOS. The use of pressurized fluids as a reactional medium for enzymatic reactions can help the components solubility and the mass transferences of the reactions and to increase the enzymes activity and stability. Therefore, the behavior of the enzymatic activity of the permebialized cell enzymes, treated with pressurized fluids, was studied. A central composite design was performed for each pressurized fluid, and it was observed an increase on residual activity for all pressurized fluids, in all designs essays, from 110 a 211%, depending on the fluid. The enzyme treated with n-butane resulted in the highest enzyme stability. After 3 weeks of storage at 10°C the enzyme kept 96% of activity. These cells treated at pressure were employed at GOS synthesis in batch reactor at atmospheric pressure. Around 75 g/L of GOS were obtained for all three pressurized fluids, as well as for the enzyme without treatment. However, the amount of the enzyme needed (in g of cells) to obtain the same enzymatic activity was lower in the case of the enzymes treated at high pressure, due to the increase of enzymatic activity after the treatment. In the next step of the work, the GOS synthesis was studied in batch mode, using as a reactional medium pressurized fluids (n-butane, propane, CO2). A central composite design for each pressurized fluid was carried out, obtaining between 65 g/L and 83 g/L of GOS, depending on reactional medium. According to the results of this work, using cells of K. marxianus CCT 7082, it can be defined that the methodology of permeabilized cells, treated at high pressure with n-butane and synthesis in atmospheric pressure reactor, is the most promising one for GOS production / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

No lúmen do intestino médio da larva de Tenebrio molitor existem 4 β-glicosidases (denominadas 1, 2, 3a e 3b), que não estão presentes na comida do animal. Elas foram purificadas usando-se técnicas de eletroforese e cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. A β-Glicosidase 1 (Mr 59.000) é instável a 30°C mas é estabilizada na presença do substrato. Ela praticamente não tem atividade sobre galactosídeos e cliva di- e oligossacarídeos. A enzima possui apenas 1 sítio ativo que apresenta 4 subsítios para ligação de glicose. Seu papel fisiológico deve ser o da clivagem de oligo- e principalmente dissacarídeos. A β-Glicosidase 2 (Mr 67.000) é muito instável a 30°C e hidrolisar com maior eficiência galactosídeos sintéticos, cliva muito mal lactose e é incapaz de clivar glucosídeos. Ela apresenta dois sítios ativos sendo que um deles cliva MUβDgal e lactose, que é ativado por Triton X-100, enquanto o outro não é ativado pelo detergente e hidrolisa NPβDgal e NPβDfuc. O papel fisiológico para esta enzima não está claro, mas imagina-se que ela esteja envolvida na digestão de galcatolipídeos. As β-Glicosidases 3a e 3b (Mr 59.000) parecem ser isoformas, uma vez que elas têm parâmetros cinéticos semelhantes, perfis de eluição, de peptídeos gerados por clivagem proteolítica, em HPLC idênticos e a mesma seqüência de aminoácidos para um peptídeo interno comum. Um anticorpo específico produzido contra a β-Glicosidase 3a reconhece a β-Glicosidase 3b, mas não reconhece as β-Glicosidases 1 e 2. Dois clones foram obtidos usando esse anticorpo para selecionar uma biblioteca de cDNA obtida dos rnRNAs do intestino médio de Tenebrio molitor. O resultado final mostrou um cDNA de 1.570 pb codificando para uma proteína madura de 485 aminoácidos. As proteínas codificadas pelos dois cDNAs têm somente 4 aminoácidos de diferentes e podem corresponder às β-Glicosidases 3a e 3b. As seqüências mostraram uma alta similaridade com proteínas da família 1 de glicosídeo hidrolases e codificam todos os peptídeos seqüenciados a partir da clivagem das β-Glicosidases 3a e 3b purificadas. Através de imunocitolocalização usando o anticorpo que reconhece as β-Glicosidases 3a e 3b, foi mostrado que essas são secretadas na parte posterior do intestino médio por uma via exocítica. Essas enzimas tem quatro subsítios para a ligação da glicose e podem hidrolisar di- e oligossacarídeos, alquil glicosídeos e glicosídeos tóxicos de plantas. Experimentos de competição entre substratos, mostraram que elas têm só um sítio ativo responsável para a hidrólise de todos os substratos. Seu papel deve ser principalmente a digestão intermediária de hemiceluloses e celulose. / In the midgut lumen of Tenebrio molitor larvae there are 4 β-glycosidases (named 1, 2, 3a and 3b), not present in the animal food. They were purified with electrophoresis, ion exchange and hydrophobic chromatographies. β-glycosidase 1 (relative molecular weight - Mr 59,000) is unstable at 30°C but is stabilized by substrates. The enzyme hydrolyses di- and oligoglucosides and has a residual activity against galactosides. It has 4 subsites for glucose binding in the active site and its physiological role is the hydrolysis of oligo- and mainly disaccharides. β-glycosidase 2 (Mr 67,000) is unstable at 30°C and hydrolyses efficiently only synthetic galactosides, has poor activity against lactose and is unable to use glucosides as substrates. This enzyme has two active sites. One of them is activated by Triton X-100 and hydrolyses MUβDgal. The other active site is not activated by the detergent and act upon NPβDgal and NPβDfuc. The physiological role ofthis enzyme may be the digestion of galactolipids. The β-glycosidases 3a and 3b (Mr 59,000) are likely isoforms, since they have similar kinetic parameters, identical HPLC peptide elution patterns after proteolytic cleavage and the same amino acid sequence of an internal peptide. A specific antibody raised against β-glycosidase 3a recognizes β-glycosidase 3b, but not β-glycosidase 1 and 2. Two clones were obtained screening a cDNA library, trom Tenebrio molitor midgut mRNA, with this antibody. The final result showed a cDNA of 1,570 pb coding for 485 amino acids in mature protein. The protein sequences showed high similarity with family 1 glycoside hydrolases and have the same amino acid sequence determined for peptides obtained after proteolytic hydrolysis of β-glycosidase 3a and 3b. The immunocytolocalization with this antibody showed that β-glycosidase 3a and 3b are secreted by exocytosis of small vesicles present in posterior midgut. These enzymes have four subsites for glucose binding and can hydrolyse di- and oligosaccharides, alkyl glucosides and toxic plant glucosides. Substrate competition experiments showed that they have only one active site responsible for the hydrolysis of all substrates. Their role may be mainly the intermediate digestion of hemicelluloses and cellulose.