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Structural and Mechanistic Studies of alpha-galactosidase A and Pharmacological ChaperonesGuce, Abigail Ida 01 February 2010 (has links)
Human α-galactosidase (α-GAL; EC 3.2.1.22) is a lysosomal enzyme that hydrolyzes of terminal alpha-linked galactosyl residue of glycosphingolipids. Deficiencies in α-GAL leads to Fabry disease, which is characterized by the build-up of globotriaosylceramide and other neutral substrates in cells, ultimately leading to a multi-systemic organ failure in patients. Hundreds of distinct mutations have been found in the α-GAL gene of Fabry disease patients. One current treatment for Fabry disease is Enzyme Replacement Therapy (ERT), which restores the missing α-GAL function. An alternative treatment, called Pharmacological Chaperone Therapy (PCT), utilizes a small molecule substrate analogue, 1-deoxygalactonojirimycin (DGJ). In order to better understand molecular basis of Fabry disease, this work addresses structural and mechanistic studies of the α-GAL glycoprotein. First, we have determined crystal structures of each stage in the catalytic mechanism of the α-GAL enzymatic reaction. These studies reveal a novel strained conformation of the sugar when it is covalently bound to the enzyme. Second, we examine the molecular mechanism of chaperoning by pharmacological chaperones. A combination of biochemical and biophysical approaches reveals that the high potency of the DGJ chaperone is due to an interaction with α-GAL residue D170. Third, we have investigated mutant α-GAL proteins for their response to pharmacological chaperones, leading to a set of structure-based rules for predicting the effect of pharmacological chaperone on every Fabry disease patient. Fourth, we use rational design approaches to interconvert the specificity of α-GAL into that of a related enzyme, α-N-acetylgalactosaminidase (α-NAGAL). Structural and enzymatic experiments show that the engineered enzyme contains new substrate specificity, as predicted by the design. The structural and mechanistic details we present in this thesis provide better understanding of the catalysis of the human α-galactosidase enzyme as well as define the molecular basis for pharmacological chaperone therapy in Fabry patients. Since α-GAL is one of the best studied lysosomal storage disease, it might be used as a model to better understand other lysosomal storage diseases and as well as other diseases related to misfolded proteins, including Alzheimer's and Parkinson's diseases.
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Investigating the structure, function and regulation of Ruminococcus gnavus E1 [alpha]-galactosidasesCervera -Tison, Marine 22 November 2011 (has links)
Ruminococcus gnavus E1 appartient au groupe des Firmicutes, l’un des deux groupes dominants du microbiote intestinal humain. Les a-galactosidases sont des glycosides hydrolase (GH) actives sur des substrats contenant des galactoses liés en a. Elles sont très largement distribuées dans tous les domaines du vivant, bactéries, champignons, plantes et animaux, mais sont absentes du tractus digestif humain. Ces travaux portent sur les caractéristiques enzymatiques et la régulation de l’expression de deux -galactosidase, Aga1 et Aga2, de R. gnavus E1. L’analyse bioinformatique de leur environnement génétique respectif indique une organisation simple pour Aga1 tandis qu’Aga2 est organisée en opéron. Elles ont été exprimées en système hétérologue chez E. coli, purifiées et leurs propriétés biochimiques ainsi que leurs spécificités de substrat ont été analysées. Le profil de croissance de la souche indique une préférence pour des substrats complexes (raffinose et mélbiose) faisant intervenir les a-galactosidase pour leurs utilisations ainsi que leur assimilation. / Ruminococcus gnavus E1 belongs to the Firmicutes, one of the two dominant groups in the human gut microbiota. a-galactosidases are glycoside hydrolases (GH) active on a-galactoside containing substrates. They are widely distributed through all the domains of life: bacteria, fungi, plants, and animals, but are absent from the human gastro-intestinal tract.Here we report the enzymatic characteristics and regulation of expression for two GH36 -galactosidases, Aga1 and Aga2, from R. gnavus E1. Bioinformatics analysis of their respective genetic environment showed a different organisation, Aga1 having a simple organisation while Aga2 is organised as part of an operon. They were heterologously expressed in Escherichia coli, purified to homogeneity and their biochemical properties and substrate preferences comparatively analysed. The growth pattern of the strain in minimum media demonstrates a preference for complex substrates (melibiose and raffinose) that require the expression of the a-galactosidases for their utilisation and assimilation
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Development and characterization of novel nitric oxide-releasing probes for magnetic resonance imagingCzerniewski, Alexandre Adam. January 2007 (has links)
While providing non-invasive tissue detection, magnetic resonance imaging (MRI) presently possesses limited sensitivity for protein target recognition. This limitation was addressed for the target beta-galactosidase (beta-gal) by constructing three beta-gal-specific MRI probes. The probes are based on a bipartite design in which a vasoactive moiety known as a diazeniumdiolate (NONOate) is bound to a specifier, specifically galactose. Upon galactose' interaction with beta-gal, the NONOate is cleaved from galactose, and actively generates nitric oxide (NO). The released NO leads to microvascular permeability changes in surrounding tissues affecting localized T1 measurements. These changes serve as a quantitative index of beta-gal detection. The three beta-gal-specific NO-releasing probes constructed include GALPYRNONO, GALPIPNONO and a 'bi-functional' probe, which is similar to the first two but with glucose additionally incorporated so that the third probe may easily cross cellular membranes. Synthesis and characterization of this novel class of MRI probes are described in this work. / Keywords: non-invasive detection, magnetic resonance imaging (MRI), nitric oxide (NO), diazeniumdiolates (NONOates), NO-releasing compounds, novel MRI probes, molecular targets, protein targets, specifier, vasoactive, vasodilation, microvascular permeability, tissue localization, bipartite systems, bifunctional probes, blood-brain barrier, cell membrane trafficking, saccharide-bound NONOates, sugar diazeniumdiolates, glycosylated diazeniumdiolates, galactose, beta-galactosidase, glucose, glucose transporters, thermal & photolytic degradation, half-life optimization, Griess test, rat serum, stability.
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Silica based materials for the encapsulation of β-Galactosidase / Encapsulation de β-Galactosidase dans des matériaux silicatesPavel-Licsandru, Ileana-Alexandra 29 November 2017 (has links)
L’ingénierie des compléments alimentaires solides offre plusieurs avantages dans la formulation industrielle des produits alimentaires, en termes de production, stockage, et manipulation. Pour ces raisons, l’objectif de cette thèse était d’élaborer des ‘cargos’ bio-réactifs, permettant l’encapsulation d’une enzyme exogène capable de réaliser la réaction d’hydrolyse des molécules de lactose. Aujourd’hui il est établi que les symptômes caractéristiques de l’intolérance au lactose sont associés à une carence en lactase dans le gros intestine. Ainsi, fournir au corps humain de la lactase est l’application ciblée par ce travail, par la conception de matériaux siliciques comme support d’encapsulation. En général, les types de cargos développés doivent surmonter les conditions gastriques pour libérer l’enzyme dans le gros intestine. La silice poreuse amorphe est un matériau inorganique non-toxique qui assure une bonne protection dans des conditions acides et permet une libération contrôlée au pH légèrement basique du colon. L’utilisation de silice amorphe poreuse permet à coût réduit d’obtenir une structure intrinsèque contrôlée (forme, taille particulaire, diamètre du pore) et une chimie de surface modifiable. En accord avec les objectifs principaux, quatre stratégies d’encapsulation bio-adaptées ont été étudiées comme de potentiels voies pour la production de compléments alimentaires solides d’intérêt pour le traitement de l’intolérance au lactose : (i) immobilisation de l’enzyme par adsorption dans des matériaux siliciques meso-macroporeux pré-synthétises, (ii) immobilisation de l’enzyme sur des particules de silice faiblement poreuses recouvertes par des liposomes, (iii) encapsulation de l’enzyme dans des nanoparticules de lipides solides (SLNs), (iv) encapsulation de l’enzyme dans une matrice de biopolymère recouvert d’une coque de silice mésoporeuse / The engineering of solid dietary supplements provides several advantages in the industrial formulation of food products, in terms of its production, storage and handling. Thereby, the goal of this doctoral work is to design bio-responsive carriers for the encapsulation of an exogenous enzyme able to catalyze the hydrolysis of lactose towards simple sugar molecules. In fact, there is a consensus that the onset of symptoms characteristic of lactose intolerance are associated with lactase deficiency in the small intestine. Providing the organism with exogenous lactase is the underlying application targeted by this work through the design of silicabased materials for encapsulation. The different types of bio-carriers developed had to overcome the simulated gastric conditions in order to release active enzyme molecules in the small intestine. Amorphous porous silica is a very good and non-toxic component affording protection versus acidic conditions, while providing controlled release. This inorganic material approved by the US Food and Drug Administration (FDA) has a relatively low cost, and presents a controlled structure (shape, size, pore diameter), as well as tunable surface chemistry. In agreement with the main objectives, four bio-adapted encapsulation strategies were investigated as potential routes to produce solid dietary supplements for lactose intolerance treatment: (i) physical entrapment of the enzyme in pre-synthesized meso-macroporous silica materials, (ii) physical entrapment of the enzyme in low porosity silica particles coated by liposomes, (iii) encapsulation of the enzyme into thermosensitive solid lipid nanoparticles (SLNs) (iv) encapsulation of the enzyme into a biopolymer matrix coated in a mesoporous silica shell
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Formação e deposição da parede celular em sementes de cafe durante o desenvolvimento da semente / Cell wall formation and deposition in coffee seeds developmentSilva, Clovis Oliveira 31 August 2006 (has links)
Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T20:11:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Silva_ClovisOliveira_D.pdf: 20554186 bytes, checksum: aa882a38d30a8d939c085c5dfd50f5db (MD5)
Previous issue date: 2006 / Resumo: No presente trabalho são efetuadas comparações entre a composição dos polissacarídeos de parede celular de grãos verdes de café colhidos de variedades diferentes de Coffea arabica e C. canephoraem que os frutos foram colhidosem umestágio específico de maturação (somente frutos avermelhados) com grãos verdes de cafés denominados conilon e arábica que são diretamente utilizados como matéria prima para a produção de café solúvel. Observou-se que no caso dos grãos colhidos em um estágio específico, as diferenças entre os conteúdos de pectinas e hemicelulosessão mínimas, enquanto para os grãos utilizados na indústria há maior rendimento de polissacarídeos (hemiceluloses) como um todo e há também uma diferença entre conilon e arábica. Umavez que se sabe que esta composição varia ao longo do processo de desenvolvimento do fruto, especula-se que o modo de colheita, que para no café colhido no campo inclui certa parcela de grãos verdes juntamente com frutos maduros, possa influenciar na composição final dos polissacarídeos nas sementes de café / Abstract: In the present work, comparisons. among the composition of cell wall polysaccharides of green coffee seeds were made with material collected from varieties of Coffea arabica and Coffea canephora in which fruits were harvested at the same developmental stage (red fruits) with green coffee beans from two varieties (arabica and conilon) used as raw material for production of soluble coffee. We observed that for seeds collected from red fruits, the differences found between pectins and hemicelluloses were minimal, whereas for the seeds used as raw material for industry conilon and arabica differed. As it is knownthat cell wall composition varies in the seeds during fruit development, it is speculated hat the harvesting mode, which in the field includes green beans along with the red mature fruits, might influence the final composition of the polysaccharides in coffee seeds / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural
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Synthese von Galactooligosacchariden in Süß- und SauermolkeFischer, Christin 16 August 2021 (has links)
Die vorliegende Arbeit hatte vorrangig zum Ziel, die enzymatische Synthese von prebiotischen Galactooligosacchariden (GOS) in Süß- und Sauermolke unter Nutzung verschiedener Enzymquellen zu evaluieren. Aufgrund des tendenziell weltweit steigenden Molkenaufkommens besteht großes Interesse, eine möglichst ganzheitliche Wertschöpfung dieses teilweise ungenutzten Rohstoffs zu generieren. Eine Möglichkeit, um dies zu realisieren, wäre die Herstellung einer GOS-haltigen Molke und eine entsprechende Weiterverarbeitung zu GOS-haltigen Lebensmitteln. Durch die generell hohe Temperatur- und pH-Toleranz von GOS sind vielfältige Applikationsmöglichkeiten gegeben.
Neben den kommerziell verfügbaren β-Galactosidasen aus Aspergillus oryzae und Kluyveromyces lactis wurden Enzyme aus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (kurz: L. bulgaricus) und Cryptococcus laurentii im Labormaßstab hergestellt und charakterisiert. Mit beiden Enzymen konnten höhere GOS-Ausbeuten in niedrig konzentrierten Lactoselösungen (Puffer als auch Molke) erhalten werden als mit den beiden kommerziellen Enzymen. Während die β-Galactosidase aus K. lactis stark vom umgebenden Medium beeinflusst wird, so zeigen alle anderen Enzyme eine gute Übertragbarkeit der Ergebnisse von Puffer auf das Substrat Süß- bzw. Sauermolke. Die höchste Transgalactosylierungsaktivität weist das Enzym aus C. laurentii mit Ausbeuten von ca. 50 % (inkl. GOS-Disaccharide) auf. Bei Verwendung der L. bulgaricus-Lactase können die Gesamtausbeute als auch die GOS-Zusammensetzung in Abhängigkeit von der gewählten Synthesetemperatur gezielt beeinflusst werden.
Des Weiteren wurde der Einfluss einer parallel zur Synthese stattfindenden Glucose-Entfernung durch enzymatische Oxidation untersucht. Trotz tendenziell begünstigter Synthese von Tri- und höheren Oligosacchariden konnte die Ausbeute mit A. oryzae nicht signifikant gesteigert werden. Die Kopplung mit K. lactis führte zu einer signifikant verringerten Synthese von GOS-Disacchariden, wodurch die Ausbeute insgesamt sank. Der Einsatz von Glucose-Oxidase und Katalase ist demnach nur bei β-Galactosidasen empfehlenswert, welche vorrangig Tri- und kaum Disaccharide synthetisieren.
Der Einsatz mehrerer β-Galactosidase-Enzyme stellte sich als vielversprechend heraus. In Abhängigkeit von den jeweils kombinierten Enzymen konnte die Ausbeute teilweise gesteigert werden. Positiv erwies sich eine sequentielle Kombination von A. oryzae und K. lactis im Sinne der Steigerung der Gesamtausbeute und der parallele Einsatz von A. oryzae und C. laurentii im Sinne der Erhöhung der Strukturdiversität der GOS-Mischung.:Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII
TABELLENVERZEICHNIS XIII
1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1
2 STAND DES WISSENS 4
2.1 Molke: Aufkommen, Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten 4
2.2 β-Galactosidasen 7
2.2.1 Aufbau und Eigenschaften 7
2.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren in Milch und Molke 8
2.2.3 Einfluss von Glucose und Galactose 9
2.2.4 Kommerzielle β-Galactosidase-Präparate 11
2.3 Galactooligosaccharide 12
2.3.1 Definition und Syntheseweg 12
2.3.2 Einflussgrößen auf die Reaktion 14
2.3.2.1 Enzymquelle 14
2.3.2.2 Lactosekonzentration 16
2.3.2.3 Reaktionsbedingungen 17
2.3.2.4 Einfluss von Glucose und Galactose 21
2.3.3 GOS-Synthese in Milch und Molke 22
2.3.4 GOS-Synthese mit Lactobacillus sp. 26
2.3.5 GOS-Synthese mit Cryptococcus laurentii 26
2.3.6 GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 27
2.3.7 Möglichkeiten der Glucose-Entfernung 27
2.3.8 Kommerziell erhältliche GOS-Produkte 28
2.3.9 Eigenschaften und Anwendung 30
2.3.10 Modifizierte GOS-Strukturen und GOS-Alternativen 32
3 MATERIAL UND METHODEN 40
3.1 Materialien 40
3.1.1 Verwendete Enzyme 40
3.1.2 Verwendete Mikroorganismen 40
3.1.3 Verwendete Molkeproben 40
3.1.4 Verwendete Geräte 40
3.2 Bestimmung der Inhaltsstoffe von Molke 40
3.3 Mikroorganismenkultivierung und Enzymgewinnung 41
3.3.1 Biochemische Analysenmethoden 41
3.3.2 Herstellung der Rohextrakte aus Lactobacillus sp. 41
3.3.3 Kultivierung im Labormaßstab 42
3.3.3.1 Lactobacillus bulgaricus LB4 42
3.3.3.2 Cryptococcus laurentii 43
3.3.4 Kultivierung im Fermentormaßstab (L. bulgaricus LB4) 43
3.4 Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität 43
3.4.1 β-Galactosidase 43
3.4.2 Glucose-Oxidase 44
3.4.3 Katalase 44
3.4.4 Berechnung der Enzymaktivität 45
3.5 Enzymcharakterisierung 45
3.5.1 Temperatur- und pH-Optimum 45
3.5.2 Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren 46
3.5.3 Enzymstabilität 46
3.6 Galactooligosaccharid-Synthese 47
3.6.1 Verwendung von kommerziellen β-Galactosidasen 47
3.6.2 Verwendung von β-Galactosidase aus Lactobacillus bulgaricus LB4 47
3.6.3 Verwendung von Cryptococcus laurentii-Zellen 47
3.6.4 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 48
3.6.5 Kopplung mehrerer β-Galactosidasen 48
3.7 Galactooligosaccharid-Analytik 49
3.8 Statistische Auswertung 50
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51
4.1 Zusammensetzung der Molken 51
4.2 Charakterisierung der β-Galactosidasen 52
4.2.1 Temperatur- und pH-Optimum 52
4.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren 55
4.2.3 Stabilität in Puffer und Molke 57
4.3 Synthese von Galactooligosacchariden 61
4.3.1 Synthese mit β-Galactosidase aus K. lactis 61
4.3.1.1 Synthese in Puffer 61
4.3.1.2 Synthese in Süßmolke 64
4.3.1.3 Synthese in Sauermolke 66
4.3.2 Synthese mit β-Galactosidase aus A. oryzae 67
4.3.2.1 Synthese in Puffer 67
4.3.2.2 Synthese in Süßmolke 69
4.3.2.3 Synthese in Sauermolke 70
4.3.3 Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 73
4.3.3.1 Synthese in Puffer 73
4.3.3.2 Synthese in Süßmolke 76
4.3.4 Synthese mit C. laurentii-Zellen 78
4.3.4.1 Synthese in Puffer 78
4.3.4.2 Synthese in Sauermolke 80
4.3.5 Vergleich der untersuchen Enzyme und Substrate 83
4.3.6 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 88
4.3.6.1 Charakterisierung von Glucose-Oxidase und Katalase 88
4.3.6.2 Einfluss simultaner Glucose-Entfernung auf die GOS-Ausbeute 90
4.3.6.3 Schlussfolgerungen 95
4.3.7 Kombination mehrerer β-Galactosidasen 95
4.3.7.1 Kopplung von A. oryzae und K. lactis 95
4.3.7.2 Kopplung von A. oryzae und C. laurentii 100
4.3.7.3 Schlussfolgerungen 105
4.4 Untersuchungen zur β-Galactosidase-Synthese mit L. bulgaricus LB4 106
4.4.1 Nährmedienumstellung auf koscher-/halal-zertifizierte Bestandteile 106
4.4.2 Kultivierung im Fermentormaßstab 111
5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 114
6 LITERATURVERZEICHNIS 118
7 ANHANG 140
7.1 Anhang zu Kapitel 2 140
7.2 Anhang zu Kapitel 3 165
7.2.1 Verwendete Geräte 165
7.2.2 Zusammensetzung MRS-Medium 166
7.2.3 Wachstum von C. laurentii 167
7.2.4 Anfangslactosekonzentrationen 167
7.2.5 Katalaseaktivität 168
7.2.6 Vergleich GOS-Disaccharidanalytik 169
7.3 Anhang zu Kapitel 4 170
7.3.1 Temperaturabhängigkeit von verschiedenen β-Galactosidasen 170
7.3.2 Aktivatoren und Inhibitoren 171
7.3.3 Grafiken zur β-Galactosidase-Stabilität 173
7.3.4 Katalase-Stabilität 182
7.3.5 Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 183
7.3.6 Grafiken zur GOS-Synthese mit kommerziellen β-Galactosidasen 184
7.3.7 Grafiken zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 188
7.3.8 Daten zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus C. laurentii 190
7.3.9 Vergleich der maximalen GOS-Ausbeute in Puffer und Molke 191
7.3.10 Grafik zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase/GOX/KAT 192
7.3.11 Grafiken zur GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 193
7.3.12 Grafiken zur Kultivierung von L. bulgaricus LB4 194 / The prior aim of the present work was to study the synthesis of prebiotic galactooligosaccharides (GOS) in sweet and acid whey by using various enzyme origins. Worldwide, an increase in whey production can be observed, thus a complete usage of this partially wasted resource is preferable. This could be implemented by producing a GOS containing whey and its subsequent processing to GOS containing foods. Due to the high temperature stability over a wide pH range, manifold food applications are possible.
Besides the commercial available β-galactosidases from Aspergillus oryzae and Kluyveromyces lactis, enzymes from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (short: L. bulgaricus) and Cryptococcus laurentii were produced on the laboratory scale and characterized accordingly. With both enzymes, higher GOS yields in low lactose solutions (buffer as well as whey) were achieved compared to the two commercial enzymes. While the β-galactosidase from K. lactis was strongly influenced by the surrounding environment, all other tested enzymes showed a good transferability of the results from buffer to sweet and acid whey, respectively. The enzyme from C. laurentii exhibited the highest affinity to transgalactosylation, the yield being about 50 % (including GOS disaccharides). When using the L. bulgaricus lactase, total GOS yield as well as GOS composition can be adjusted via the synthesis temperature.
Furthermore, the effect of glucose depletion during GOS synthesis using enzymatic oxidation was examined. Although a tendency towards the synthesis of tri- and higher oligosaccharides was observed, GOS yield by A. oryzae was not significantly enhanced. The combination with the K. lactis enzyme led to a significantly reduced synthesis of GOS disaccharides, resulting in a decreased total GOS yield. Thus, the use of glucose oxidase and catalase is only beneficial for β-galactosidases, which have a preference for synthesizing trisaccharides, but less disaccharides.
The use of more than one β-galactosidase has shown to be promising. Depending on the respective enzyme combinations, it was partially possible to enhance the GOS yield. Positive results in terms of increasing total GOS yield were obtained using a consecutive coupling of A. oryzae and K. lactis, while in terms of enhancing the structural diversity of the GOS mixture, a simultaneous combination of A. oryzae und C. laurentii led to the best results.:Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII
TABELLENVERZEICHNIS XIII
1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1
2 STAND DES WISSENS 4
2.1 Molke: Aufkommen, Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten 4
2.2 β-Galactosidasen 7
2.2.1 Aufbau und Eigenschaften 7
2.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren in Milch und Molke 8
2.2.3 Einfluss von Glucose und Galactose 9
2.2.4 Kommerzielle β-Galactosidase-Präparate 11
2.3 Galactooligosaccharide 12
2.3.1 Definition und Syntheseweg 12
2.3.2 Einflussgrößen auf die Reaktion 14
2.3.2.1 Enzymquelle 14
2.3.2.2 Lactosekonzentration 16
2.3.2.3 Reaktionsbedingungen 17
2.3.2.4 Einfluss von Glucose und Galactose 21
2.3.3 GOS-Synthese in Milch und Molke 22
2.3.4 GOS-Synthese mit Lactobacillus sp. 26
2.3.5 GOS-Synthese mit Cryptococcus laurentii 26
2.3.6 GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 27
2.3.7 Möglichkeiten der Glucose-Entfernung 27
2.3.8 Kommerziell erhältliche GOS-Produkte 28
2.3.9 Eigenschaften und Anwendung 30
2.3.10 Modifizierte GOS-Strukturen und GOS-Alternativen 32
3 MATERIAL UND METHODEN 40
3.1 Materialien 40
3.1.1 Verwendete Enzyme 40
3.1.2 Verwendete Mikroorganismen 40
3.1.3 Verwendete Molkeproben 40
3.1.4 Verwendete Geräte 40
3.2 Bestimmung der Inhaltsstoffe von Molke 40
3.3 Mikroorganismenkultivierung und Enzymgewinnung 41
3.3.1 Biochemische Analysenmethoden 41
3.3.2 Herstellung der Rohextrakte aus Lactobacillus sp. 41
3.3.3 Kultivierung im Labormaßstab 42
3.3.3.1 Lactobacillus bulgaricus LB4 42
3.3.3.2 Cryptococcus laurentii 43
3.3.4 Kultivierung im Fermentormaßstab (L. bulgaricus LB4) 43
3.4 Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität 43
3.4.1 β-Galactosidase 43
3.4.2 Glucose-Oxidase 44
3.4.3 Katalase 44
3.4.4 Berechnung der Enzymaktivität 45
3.5 Enzymcharakterisierung 45
3.5.1 Temperatur- und pH-Optimum 45
3.5.2 Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren 46
3.5.3 Enzymstabilität 46
3.6 Galactooligosaccharid-Synthese 47
3.6.1 Verwendung von kommerziellen β-Galactosidasen 47
3.6.2 Verwendung von β-Galactosidase aus Lactobacillus bulgaricus LB4 47
3.6.3 Verwendung von Cryptococcus laurentii-Zellen 47
3.6.4 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 48
3.6.5 Kopplung mehrerer β-Galactosidasen 48
3.7 Galactooligosaccharid-Analytik 49
3.8 Statistische Auswertung 50
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51
4.1 Zusammensetzung der Molken 51
4.2 Charakterisierung der β-Galactosidasen 52
4.2.1 Temperatur- und pH-Optimum 52
4.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren 55
4.2.3 Stabilität in Puffer und Molke 57
4.3 Synthese von Galactooligosacchariden 61
4.3.1 Synthese mit β-Galactosidase aus K. lactis 61
4.3.1.1 Synthese in Puffer 61
4.3.1.2 Synthese in Süßmolke 64
4.3.1.3 Synthese in Sauermolke 66
4.3.2 Synthese mit β-Galactosidase aus A. oryzae 67
4.3.2.1 Synthese in Puffer 67
4.3.2.2 Synthese in Süßmolke 69
4.3.2.3 Synthese in Sauermolke 70
4.3.3 Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 73
4.3.3.1 Synthese in Puffer 73
4.3.3.2 Synthese in Süßmolke 76
4.3.4 Synthese mit C. laurentii-Zellen 78
4.3.4.1 Synthese in Puffer 78
4.3.4.2 Synthese in Sauermolke 80
4.3.5 Vergleich der untersuchen Enzyme und Substrate 83
4.3.6 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 88
4.3.6.1 Charakterisierung von Glucose-Oxidase und Katalase 88
4.3.6.2 Einfluss simultaner Glucose-Entfernung auf die GOS-Ausbeute 90
4.3.6.3 Schlussfolgerungen 95
4.3.7 Kombination mehrerer β-Galactosidasen 95
4.3.7.1 Kopplung von A. oryzae und K. lactis 95
4.3.7.2 Kopplung von A. oryzae und C. laurentii 100
4.3.7.3 Schlussfolgerungen 105
4.4 Untersuchungen zur β-Galactosidase-Synthese mit L. bulgaricus LB4 106
4.4.1 Nährmedienumstellung auf koscher-/halal-zertifizierte Bestandteile 106
4.4.2 Kultivierung im Fermentormaßstab 111
5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 114
6 LITERATURVERZEICHNIS 118
7 ANHANG 140
7.1 Anhang zu Kapitel 2 140
7.2 Anhang zu Kapitel 3 165
7.2.1 Verwendete Geräte 165
7.2.2 Zusammensetzung MRS-Medium 166
7.2.3 Wachstum von C. laurentii 167
7.2.4 Anfangslactosekonzentrationen 167
7.2.5 Katalaseaktivität 168
7.2.6 Vergleich GOS-Disaccharidanalytik 169
7.3 Anhang zu Kapitel 4 170
7.3.1 Temperaturabhängigkeit von verschiedenen β-Galactosidasen 170
7.3.2 Aktivatoren und Inhibitoren 171
7.3.3 Grafiken zur β-Galactosidase-Stabilität 173
7.3.4 Katalase-Stabilität 182
7.3.5 Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 183
7.3.6 Grafiken zur GOS-Synthese mit kommerziellen β-Galactosidasen 184
7.3.7 Grafiken zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 188
7.3.8 Daten zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus C. laurentii 190
7.3.9 Vergleich der maximalen GOS-Ausbeute in Puffer und Molke 191
7.3.10 Grafik zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase/GOX/KAT 192
7.3.11 Grafiken zur GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 193
7.3.12 Grafiken zur Kultivierung von L. bulgaricus LB4 194
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Development and characterization of novel nitric oxide-releasing probes for magnetic resonance imagingCzerniewski, Alexandre Adam. January 2007 (has links)
No description available.
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Analysis of phenolic compounds by dint of GDH-biosensors and immunoassaysRose, Andreas January 2003 (has links)
In den letzten Jahren gerieten phenolische Substanzen, wie z.B. Chlor-, Nitrophenol oder Alkylphenolethoxylate aufgrund ihrer Toxizität sowie ihres kanzerogenen und endokrinen Potentials in das Interesse der Öffentlichkeit. Diese Substanzen gelangen in großen Mengen, z.B. aus industriellen Prozessen (Papier-, Kunststoff-, oder Lederindustrie) oder als Abbauprodukte von Pflanzenschutzmitteln in die Umwelt.<br />
<br />
Ziel dieser Arbeit war es, einfache biochemische Bestimmungsmethoden für verschiedene phenolische Umweltschadstoffe auf Basis biochemischer Erkennungselemente zu entwickeln. Diese sollten als Screeningmethoden in der Vor-Ort-Analytik einsetzbar sein. Die Anwendung sollte kostengünstig und einfach durchzuführen sein, so dass die Messung kein hochwissenschaftliches Personal erfordert. Daher stand im Hintergrund der Arbeit die Integration der Analysenmethode in ein kompaktes Handgerät.<br />
<br />
Zu diesem Zweck wurde ein Biosensor entwickelt der zur direkten Messung und in Kombination mit einem Immunoassay einsetzbar ist:<br />
<br />
1.) Elektrochemischer Biosensor<br />
Ein elektrochemischer Biosensor stellt die Verbindung zwischen einer Elektrode und der biologischen Komponente dar. Als Messprinzip wurde die Amperometrie gewählt. Hierbei wird die Präsenz des nachzuweisenden Stoffes durch die angelegte Spannung am Sensor visualisiert, da beim Vorhandensein ein Stromfluss gemessen wird.<br />
<br />
Um die Signalintensität zu erhöhen können Enzyme als Katalysatoren genutzt werden, die in der Lage sind die Rückreaktion der Elektrodenreaktion zu realisieren. In diesem Fall wurde Glucose-Dehydrogenase (GDH) verwendet, die oxidierte phenolische Verbindungen reduzieren kann. Zusammen mit der Oxidation an der Sensoroberfläche bildet sich ein Verstärkungszyklus aus, der das ursprüngliche Signal vielfach erhöht.<br />
<br />
Wir waren in der Lage, GDH durch Einbetten in ein Polymerennetzwerk auf der Oberfläche einer gedruckten Platin-Dickschicht-Elektrode zu immobilisieren. Als Resultat erhielten wir einen sehr empfindlichen und äußerst stabilen Biosensor. Seine schnelle Ansprechzeit ermöglicht den Einsatz in automatisierten Fließsystemen zur Messung großer Probenzahlen. Der Einsatz in einem manuell betriebenen Handgerät konnte ebenfalls realisiert werden und brachte nur geringe Beeinträchtigungen in bezug auf die Empfindlichkeit der Messung. Die erfolgreiche Implementierung des Biosensors in das Handgerät wurde in Rahmen eines internationalen Workshops in Barcelona, anhand der Überprüfung der Reinigungsleistung von Klärwerken, gezeigt.<br />
<br />
2.) Kombination mit Immunoassays<br />
Der Einsatzbereich der GDH-Biosensoren lässt sich durch die Kombination mit anderen Techniken erweitern, wobei der Sensor zur Visualisierung der Nachweisreaktion dient. In diesem Fall kann der Sensor zur Bestimmung der Enzymaktivität von ß?Galactosidase (ßGal) verwendet werden. Der Nachweis geringster Enzymmengen wurde realisiert. Die ßGal wird zur Markierung eines Analytanalogen in Immunoassays verwendet, um die Bindung von Antikörper und Analytmolekül sichtbar zu machen. Im Immunoassay bildet sich ein Gleichgewicht zwischen Antikörper, unmarkiertem Analyt und markiertem Analytanalog (Tracer) aus. Über die Bestimmung der Enzymaktivität kann man die Analytkonzentration in der Probe errechnen.<br />
<br />
Wir haben unseren GDH-Biosensor erfolgreich mit zwei Techniken kombiniert. Zum Einen mit einem Assay zur Bestimmung von Nitrophenol, der in einem automatisiertem Fließsystem realisiert wurde. Hier wird die Mischung aus Antikörpern, Analyt und Tracer über eine Säule gegeben und gespült. Die gebundenen Bestandteile werden durch den GDH-Biosensor quantifiziert.<br />
<br />
Zum Anderen wurde ein Kapillarimmunoassay entwickelt, der in das Handgerät integriert werden kann. Dabei wird der Antikörper direkt an der Kapillare fixiert. Die Probe wird mit Tracer vermischt und in die Kapillare gegeben. Dort bildet sich das Gleichgewicht aus und weitere Probenbestandteile werden im Spülschritt eliminiert. Die Analytkonzentration wird durch die Bestimmung des gebunden Tracers (Aktivität der ßGal) mit Hilfe des GDH-Biosensors realisiert. / The development of fast and reliable biochemical tools for on-site screening in environmental analysis was the main target of the present work. Due to various hazardous effects such as endocrine disruption and toxicity phenolic compounds are key analytes in environmental analysis and thus were chosen as model analytes.<br />
<br />
Three different methods were developed:<br />
<br />
For the enzymatic detection of phenols in environmental samples an enzyme-based biosensor was developed. In contrast to reported work using tyrosinase or peroxidases, we developed a biosensor based on glucose dehydrogenase as biorecognition element. This biosensor was devoted for an application in a laboratory flow system as well as in a portable device for on-site measurements.<br />
<br />
This enzymatic detection is applicable only for a limited number of phenols due to substrate specificity of the enzyme. For other relevant compounds based on a phenolic structure (i.e. nitrophenol, alkylphenols and alkylphenol ethoxylates) immunological methods had to be developed. The electrochemical GDH-biosensor was used as the label detector in these immunoassays.<br />
<br />
Two heterogeneous immunoassays were developed where ßGal was used as the label. An electrochemical method for the determination of the marker enzyme activity was processed. The separation step was realized with protein A/G columns (laboratory flow system) or by direct immobilization of the antibodies in small disposable capillaries (on-site analysis). <br />
<br />
All methods were targeted on the contemporary analysis of small numbers of samples.
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Ligands d'acides nucléiques et fluorophores dérivés de benzothiazoles : synthèse et applications biologiques / Nucleic acid ligands and benzothiazole-based fluorophores : synthesis and biological applicationsSafir Filho, Mauro 14 December 2018 (has links)
L’interdisciplinarité est désormais inhérente à la recherche scientifique. L’essor des recherches dans le domaine médical a notamment favorisé cette interdisciplinarité. C'est dans ce contexte que s'inscrivent les travaux présentés dans ce manuscrit. En effet, ce dernier vise à la production de nouveaux outils adaptés à des problématiques des sciences de la vie. Ce manuscrit traite de spectroscopie de la fluorescence et de chimie des acides nucléiques. Il est divisé en deux sections : Dans la partie I, nous présentons de nouveaux fluorophores push-pull très brillants, non toxiques et pouvant être utilisé en cultures cellulaires. Ces composés, basés sur des motifs benzothiazoles, peuvent être modulés structurellement afin d'obtenir les propriétés photophysiques souhaitées. D'ailleurs, pour ces composés, une relation structure-propriétés photophysiques a été établie. Ensuite, en utilisant ces fluorophores, nous avons conçu de nouvelles sondes fluorescentes pour suivre l’activité enzymatique de la β-galactosidase. Cette dernière étant un marqueur de la sénéscence cellulaire, nous avons utilisé nos sondes pour détecter la sénescence, in vitro, par des méthodes de microscopie de fluorescence et de cytométrie en flux. La partie II de ce manuscrit est consacrée à la chimie des acides nucléiques. Tout d'abord nous y décrivons la préparation et l'évaluation de nouveaux ligands d’ARN ciblant le domaine IIId de l'IRES du VHC. Ces ligands présentent d'une part, un motif permettant de faire un triplet de base avec la séquence IIId afin d'apporter de la spécificité, et d'autre part, des fonctions aminées afin de stabiliser le triplet par interactions électrostatiques avec les phosphodiesters de IIId. Enfin, la dernière partie concerne le développement d'une nouvelle stratégie permettant la fonctionnalisation post-synthèse d'acides nucléiques en position anomère. Pour ce faire, nous avons conçu des plateformes phosphoramidites qui, une fois incorporées dans des brins oligonucléotidiques, peuvent être impliquées dans diverses réaction de glycosidation. / Interdisciplinary is an obvious feature of scientific research. Notably, the continuously expanding researches in the medical field fostered this interdisciplinarity. Within this context, the work presented here deals with fluorescence spectroscopy and nucleic acid chemistry and aims at providing new tools suited for applications in life sciences. This manuscript presents two sections. In Part I, we developed novel series of highly bright and non-toxic push-pull fluorophores, compatible with cellular applications. In fact, we describe new benzothiazole-based fluorophores that can be structurally modulated to provide dyes with tunable photophysical properties. Their structure-photophysics relationship is also reported. Next, using these fluorophores, we produced new fluorescent probes to monitor the enzymatic activity of the β-galactosidase. Of note, since β-galactosidase is a marker of cellular senescence, we also used our probes for the detection of early stages of cellular senescence using fluorescence microscopy and flow cytometry analysis. Part II of this manuscript is devoted to the chemistry of nucleic acids. First, we describe the preparation and evaluation of novel RNA ligands targeting the IIId domain of the HCV IRES. These ligands can make a base triplet with the IIId sequence to provide specificity, and harbour amino functions to stabilize the triplet by electrostatic interaction with the phosphodiesters of IIId. Finally, the last part concerns the development of a new strategy allowing the post-synthetic functionalization of nucleic acids at the anomeric position. To do this, we designed new phosphoramidite platforms that, once incorporated into oligonucleotide strands, can be involved in various glycosidation reactions.
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Onkolytische Virotherapie : Virus-vermittelte Expression von MCP-1 oder ß-Galaktosidase in Vaccinia-Virus-kolonisierten Tumoren führt zu einer erhöhten Tumorregression / Oncolytic virotherapy : The virus encoded coexpression MCPI and beta galactosidase in vaccinia virus colonized tumor xenografts resulted in enhanced tumor rejectionSeubert, Carolin January 2010 (has links) (PDF)
Ungeachtet der enormen Entwicklung in Krebsdiagnostik und -Therapie in den letzten Jahren, sind vollständige Heilungsaussichten weiterhin gering und die aktuellen Behandlungsmethoden oftmals mit schwerwiegenden Nebeneffekten verbunden. Aufgrund dessen sind alternative Behandlungsmethoden unbedingt erforderlich und führten zu einer zunehmenden Bedeutung des Vaccinia-Virus als onkolytisches Virus in der Krebstherapie. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei mögliche Therapieansätze zur Verstärkung der onkolytischen Effekte in humanen Tumormodellen untersucht. Die Kombination einer gene-directed enzyme prodrug Therapie (GDEPT) mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus GLV 1h68 sollte zur Selektivitätssteigerung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren, cytotoxisch-aktiven Drugs führen. Darüber hinaus diente das für MCP-1 codierende Vaccinia-Virus GLV-1h80, zielend auf eine Cytokin-vermittelten Immuntherapie, als Vektor zur spezifischen Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks. Im Zuge der GDEPT wurde in dieser Arbeit ein, durch enzymatische Deglykosylierug aktivierbares Prodrug, basierend auf dem cytotoxischem Antibiotikum Duocarmycin SA verwendet. Durch eine Infektion mit GLV-1h68 und einer resultierenden Expression des aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase, sollte eine Umwandlung des Prodrugs in ein cytotoxisches Drug erfolgen. In vitro Infektionsstudien zeigten ein nahezu identisches Replikationsverhalten des Vaccinia-Virus GLV-1h68 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h43 in humanen GI-101A-Brustkrebszellen. Die Expression der beiden Reporter-Gene Ruc-GFP sowie ß-Galaktosidase konnten auf Protein-Ebene und mittels RT-PCR nach Infektion mit GLV-1h68 nachgewiesen werden. GLV-1h43-Infektion von GI-101A-Zellen führte zu GFP-Expression, jedoch nicht zur Expression des Enzyms ß Galaktosidase. Untersuchung der Enzym-Aktivität in Zelllysaten und Zellkultur-Überständen zeigten nach Infektion mit GLV 1h68 steigende Menge zellulär assoziierter und freier ß-Galaktosidase. Des Weiteren wurde durch Koinkubation von GI-101A-Zellen mit Virus-freien, ß Galaktosidase-haltigen Zelllysaten bzw. –überständen und Prodrug eine Aktivierung des Prodrugs durch das Virus codierte Enzym nachgewiesen. Diese Koinkubation führte zur Abtötung der Zellen. Nach Inkubation mit Proben mock- oder GLV 1h43-infizierter Zellen konnte keiner Veränderung der Proliferationsrate von GI-101A-Zellen gefunden werden. Kombinierte Behandlung von GI 101A-Zellen mit Viren des Stammes GLV 1h68 und Prodrug führte zu starken Synergieeffekten bei der Abtötung der Zellen und wies einen Bystander Effekt der Kombinationstherapie nach. Dieser konnte in 4 weiteren humanen und 2 Hunde-Brustkrebszellen bestätigt werden. Der erzielte Bystander-Effekt zeigt, dass es nach Virus-induzierter ß-Galaktosidase-Expression in GLV 1h68-infizierten Zellen zu einer enzymatischen Spaltung des Prodrugs in das cytotoxische seco-Analogon des Antibiotikums Duocarmycin SA kommt. Durch die Membrangängigkeit des Drugs konnte auch in angrenzenden uninfizierten Zellen eine Wirkung erzielt werden. Anhand von Expressionsanalysen an Apoptose-assoziierten Proteinen, wie PARP und Caspasen, wurde eine Wirkung des Prodrugs über den intrinsischen Apoptose-Signalweg nachgewiesen. In athymischen Nude-Mäusen durchgeführte Replikationsanalysen und X-Gal-Färbungen GLV 1h68 infizierter Tumore nach Prodrug-Behandlung zeigten, dass GLV-1h68 ungeachtet der simultanen Behandlung mit Prodrug im Tumorgewebe repliziert und es nicht zur Anreicherung lacZ-negativer Virusmutanten kommt. Es konnten, durch Prodrug-Behandlung und einer simultanen Expression aktiver ß Galaktosidase, starke synergistische Effekte und eine signifikante Steigerung der Tumorregression erzielt werden. Da die Kombinationstherapie zu keinerlei Unterschieden in Gewicht und Gesundheitszustand behandelter Versuchstiere führte, konnte eine systemische Toxizität außerhalb des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Verschiedene Zelllinien weisen Unterschiede in ihrer Sensitivität gegenüber der onkolytischen Aktivität von Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf. Während einige Zelllinien trotz Virus-Behandlung unverändertes Proliferationsverhalten zeigen (non- oder poor-responder), führt diese Behandlung in anderen Zelllinien zu einer vollständigen Tumorregression (responder). In Anbetracht dieser Unterschiede wurden in dieser Arbeit die Effekte einer induzierten Expression des murinen Chemokins MCP-1 in GI-101A-Tumoren (responder) und HT29-CBG-Tumoren (poor-responder) untersucht. MCP-1 zeichnet sich durch seine chemotaktischen Eigenschaften gegenüber mononukleärer Zellen aus und führt zu pleiotropen Tumor-Effekten. Replikationsstudien am Virus GLV-1h80 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h68 zeigten, dass aus der Expression des Fremd-Gens mcp-1 sowohl in vitro als auch in vivo keinerlei negativen Effekte auf das Replikationsverhalten in humanen GI-101A- und HT29-CBG-Zellen resultieren. Durch Real-time Monitoring der GFP-Expression im Tumorgewebe lebender Tiere konnte zunächst eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende Signalstärke beobachtet werden, welche dann 42 dpi an Intensität verlor. Toxizität und schädliche Nebeneffekte durch Infektion mit den beiden rVACV konnten anhand der viralen Titer in den Organen der Maus ausgeschlossen werden. Die Titer wiesen auf eine ausschließlich auf das Tumorgewebe begrenzte Replikation der Viren nach Injektion in Tumor-tragende Tiere hin. Die Expression des Chemokins MCP-1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in GLV-1h80-inifzierten Zellen und im Tumorgewebe GLV 1h80-injizierter Mäuse nachgewiesen. Nach Infektion mit GLV-1h80 konnte eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression gezeigt werden. Dabei wurde zudem deutlich, dass nicht nur eine GLV-1h80-Infektion in vivo zu einer Zunahme der intratumoralen MCP-1-Expression führte, sondern eine Vaccinia-Virus-Infektion allein einen Anstieg des Chemokins zu bewirken vermag. Eine Quantifizierung durch ELISA machte Konzentrationsunterschiede von MCP-1 zwischen den Tumormodellen GI-101A und HT29-CBG deutlich. Sowohl in vitro als auch in vivo führte ein GLV-1h80-Infektion zu deutlich niedrigeren Konzentrationen im HT29-CBG-Kolon-Adenokarzinommodell. Ein Nachweis murinen MCP-1 in Blutseren Tumor-tragender Tiere zeigte eine für therapeutische Effekte erwünschte systemische Freisetzung des intratumoral durch die Infektion mit GLV-1h80 gebildeten Chemokins MCP-1. Durch immunhistologische Untersuchungen GLV-1h80-infizierter Zellen und Tumoren konnte diese, mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression bestätigt werden. Die funktionelle Aktivität des rekombinanten Proteins wurde anhand TNF-α-spezifischer ELISA-Analysen überprüft. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression dieses proinflammatorischen Cytokins in GI-101A-Tumoren nach Infektion mit GLV-1h80. Dagegen konnte keine Steigerung der Expression im HT29-CBG-Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Nachweis des durch proinflammatorische Immunzellen exprimierten Oberlflächenproteins CD14 zeigte ebenfalls einen Anstieg nach Infektion mit GLV-1h80. Auch diese veränderte Expression blieb im poor-Responder-Modell HT29-CBG aus. Die steigende intratumorale Expression der beiden Proteine in GI-101A-Tumoren nach GLV 1h80-Infektion lässt auf eine Zunahme pro-inflammatorischer Immunzellen, basierend auf einer Virus-induzierten MCP-1-Expression schließen. Ein Monitoring der Tumorprogression nach Implantation von GI 101A-Zellen und Injektion der rVACV GLV-1h80 und GLV-1h68 bzw. einer PBS-Injektion führte nach einer anfänglichen Zunahme des Tumorwachstums schließlich bei beiden Viren zu einer Tumorregression. Jedoch konnte durch die GLV-1h80-vermittelte MCP-1-Expression eine Verstärkung der onkolytischen Effekte erzielt werden, welche sich durch eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens zeigte. Im HT29-CBG-Modell führten die therapeutischen Effekte durch rVACV GLV-1h80 zwar zu keiner Regression des Tumors, jedoch zeigte sich auch in diesem humanen Tumormodell eine Verstärkung der onkolytischen Effekte nach GLV-1h80-Infektion im Vergleich zu einer GLV 1h68-Behandlung. Durch die GLV-1h80-induzierte Expression des Chemokins MCP-1 konnte somit eine Hemmung des Tumorwachstums auch im poor-Responder-Modell HT29-CBG erzielt werden. Sowohl die Verwendung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren Prodrugs im Zuge einer GDEPT, als auch die Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks durch Expression des Chemokins MCP-1 führten in dieser Arbeit zu positiven Synergismus-Effekten in der onkolytischen Virustherapie. Durch künftige Konstruktion eines rVACV, welches sowohl die Expression des Chemokins MCP-1, als auch des prodrug-aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase im Tumorgewebe induziert, könnte in Kombination mit einer Prodrug-Behandlung eine zusätzliche Verstärkung der Effekte erzielt und möglicherweise eine erfolgreiche Virustherapie in bisher schwach ansprechenden poor- bzw. non-Responder-Modellen ermöglicht werden. / Irrespective of enormous developments in cancer diagnostics and therapy in the last few years, complete recovery from cancer still occurs rarely. Moreover, conventional therapy is attendant on unspecific side effects. Consequently, novel, well-tolerated and more efficient therapies are required in order to reduce the number of cancer-related deaths. Among several strategies to improve currently applied treatments, the use of oncolytic viruses may turn out to be a highly promising therapeutic approach. In this thesis two different therapeutic approaches were investigated to enhance oncolytic effects of vaccinia virus in human xenografts. First, the lacZ-carrying oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 was used in combination with a ß-galactosidase activatable prodrug to increase selectivity of a cytotoxic drug. Second, based on a cytokine-mediated immunotherapy, MCP-1-encoding vaccinia virus GLV-1h80 was used as a vector with a specific impact on the intratumoral chemokine network. In the first approach, an enzymatic activatable prodrug, based on a cytotoxic seco-analogue of the antibiotic duocarmycin SA was used for gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT). An activation of the cytotoxic prodrug was to be achieved by infection with GLV 1h68 and the resulting expression of the prodrug activating enzyme ß-galactosidase. Cell culture experiments revealed a comparable replication rate of GLV-1h68 and of the control virus strain GLV-1h43 lacking the lacZ gene insert. Expression of the reporter genes Ruc-GFP and ß-galactosidase after infection of GI-101A cells with GLV-1h68 was proven on the protein level and by RT-PCR. Infection of cells with GLV-1h43 resulted in GFP-expression only, confirming the absence of lacZ in GLV-1h43. Analysis of ß-galactosidase concentrations in cell lysates and supernatants revealed an increase of the enzyme during infection of GLV 1h68. Activation of the prodrug by the virus-encoded enzyme was achieved by co incubation of GI-101A-cells with virus-depleted, ß-galactosidase-containing cell lysates or supernatants and prodrug. This co-incubation resulted in killing of GI-101A cells. Conversely, incubation with samples obtained from mock- or GLV-1h43-infected cells and prodrug did not change overall survival of GI-101A-cells. In order to find out whether an additional effect could be achieved in neighboring uninfected cells, called bystander effect, GLV-1h68-infected cells were treated with prodrug. This experiment demonstrated strong synergistic effects in terms of cell killing. Similar results were obtained with 4 other human and with 2 canine breast cancer cell lines. The achieved bystander effect reveiled that upon GLV-1h68 infection the virus-mediated ß-galactosidase-expression resulted in enzymatic cleavage of the prodrug and release of the cytotoxic drug. Furthermore it proved the ability of the activated drug to penetrate cell membranes. Expression analysis on apoptosis-associated proteins, e.g. PARP and caspases, revealed induction of apoptosis via the intrinsic pathway after prodrug activation in GLV-1h68-infected cells. In vivo replication analysis and X-Gal staining of GLV 1h68-infected tumors revealed that GLV-1h68 can replicate within tumor tissue and no enrichment of mutants in lacZ occured, regardless of simultaneous prodrug treatment. Thus, prodrug treatment and expression of ß galactosidase resulted in synergistic effects leading to significantly enhanced tumor regression. Since no sign of malaise or weight loss was observed in prodrug-treated mice when compared to the respective control mice, we concluded that no toxic side effects occurred and active ß-galactosidase released from the tumor was negligible. Different human cell lines reveal varied sensitivity to the oncolytic activity of vaccinia virus GLV-1h68, some cell lines continue growth (non- or poor-responder), while others show complete regression (responder). Considering these differences, the second aspect of this thesis was the analysis of the chemokine MCP-1 in GI-101A-xenografts (responder) and in the poor-responding HT29-CBG tumors. MCP-1 is characterized by chemotactic properties against mononuclear cells and has pleiotropic effects on cancer. Replication studies on GLV 1h80 and the control virus strain GLV-1h68 revealed that expression of the inserted mcp-1-gene had no negative effects on viral replication in vitro as well as in vivo in human GI-101A- or HT-29 CBG-cells. Real-time monitoring of GFP-expression in tumors of infected mice showed increasing amounts of GFP in tumors during the infection process until 21 dpi, followed by a decrease in intensity to 42 dpi. By determining the viral titers in organs of infected mice, toxicity and harmful side effects resulting from infection with both virus strains were excluded. The viral titers demonstrate, that viral replication occurs exclusively in tumor tissue. Expression of MCP-1 in GLV-1h80-infected cells and tumors was detected on transcriptional as well as on translational level. The concentration of the chemokine increased during infection of GLV-1h80. Additionally, the increase of intratumoral MCP-1-concentrations was not only limited on GLV-1h80-infected tumors. On the contrary, vaccinia virus infection itself resulted in increasing amounts of this chemokine. Quantifying MCP-1-expression by ELISA assay revealed differences in concentrations between tumors derived from GI-101A and HT-29-CBG cells. In case of the HT-29-CBG coloncarcinoma, infection with GLV-1h80 resulted in lower concentrations of MCP 1 in vitro as well as in vivo. Confirmation of murine MCP-1 in blood samples of tumor-bearing mice revealed a systemic release of intratumoral MCP-1 predicated on the infection with GLV-1h80. This systemic release is required for therapeutic effects. The increased expression of MCP-1 in GLV-1h80-infected cells and tumors during infection was verified by immunohistochemical analysis. Functional activity of the recombinant protein was checked by a TNF-α-specific ELISA assay, demonstrating increased expression of this proinflammatory cytokine in GI-101A tumors after infection with GLV-1h80. In contrast, no increase was observed in HT-29 CBG tumors. Likewise, the quantification of proinflammatory expressed surface protein CD14 showed higher concentrations in GI-101A-tumors after GLV-1h80-infection. Again, this increase was missing in xenografts of poor-responder HT-29-CBG. The increased expression of these two proteins in GI-101A xenografts after GLV-1h80-infection suggested an accumulation of proinflammatory immune cells, resulting from virus-mediated MCP 1-expression. Moreover, monitoring of tumor progression after implantation of GI-101A cells revealed an initially swelling of the tumors, followed by enhanced tumor regression after infection with GLV-1h80, as well as after GLV 1h68-infection. However, GLV-1h80-mediated MCP-1 expression resulted in an enhancement of oncolytic effects, followed by significant reduced tumor volumes compared to GLV-1h68-colonized tumors. In case of HT-29-CBG tumors MCP-1 induced indeed no regression of tumors. However, even in this poor-responding tumors oncolytic effects could be amplified by GLV 1h80 infection. Hence, inhibition of tumor growth in poor-responder model HT-29-CBG could be achieved by GLV-1h80-induced expression of the chemokine MCP-1. Taken together, both, the use of a ß galactosidase activatable prodrug in GDEPT and the modulation of the intratumoral chemokine network by expression of MCP-1 resulted in positive synergistic effects during oncolytic virus therapy. Future construction of a recombinant VACV, co expressing the prodrug-activating enzyme ß galactosidase as well as MCP-1 in tumor tissue has the potential to induce even stronger synergistic effects and might also lead to a more efficient treatment of up to now poor- or non-responding tumors.
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