Les biofilms bactériens sont des communautés répandues, dans lesquelles la densité cellulaire élevée, la diffusion réduite et la structure hétérogène favorisent les contacts physiques et métaboliques entre les bactéries et induisent de nouveaux comportements par rapport aux microorganismes individuels. [Si] la plupart des connaissances actuelles sur la formation du biofilm et le métabolisme découlent des études réalisées dans les modèles bactériens aérobies pathogènes et environnementaux, […] il existe peu d'informations sur la formation de biofilm dans des anaérobies strictes en général et des anaérobies commensaux associés à l'hôte de la gastro-microbiota intestinal en particulier. […] Nous avons utilisé des tests de biofilm in vitro statiques et dynamiques combinés avec des approches génétiques et transcriptomiques pour étudier les mécanismes moléculaires de la formation de biofilm et du métabolisme dans un prothèses intestinales Bacteroides thetaiotaomicron. Notre écran initial sur 35 souches de B.thetaiotaomicron […] a révélé une capacité généralisée de cette espèce à former un biofilm. Cependant, la production de biofilm semblait réprimée […] dans le VPI 5482 de type sauvage de référence et cela nous a poussé à développer les travaux de thèse selon deux axes principaux : l'identification de conditions induisant la formation de biofilm in vitro dans VPI 5482 et l'identification et la caractérisation de mutants transposons avec augmentation de la capacité du biofilm par rapport à WT VPI 5482. Après avoir testé divers composés qui sont pertinents pour l'environnement intestinal, nous avons montré que les sels biliaires […], induisent la formation de biofilm chez VPI 5482 et nous avons utilisé le RNAseq pour identifier les fonctions impliquées dans la formation de biofilm induite par le sel biliaire. Les résultats de RNAseq montrent que les bactéries dans le biofilm augmentent l'expression des gènes impliqués dans la glycosylation de la surface cellulaire et présentent un modèle d'expression spécifique des opéron de synthèse capsulaire, suggérant que les polysaccharides de surface cellulaire pourraient jouer un rôle clé lors de la formation du biofilm dans B. thetaiotaomicron. Nous avons ensuite utilisé la mutagenèse du transposon pour révéler les facteurs d'adhérence impliqués dans la formation du biofilm en présence de sels biliaires, ce qui a conduit à l'identification d'un opéron non caractéristique (BT3560-2) impliqué putativement dans le transport de micronutriments dépendant de TonB. Même si les cibles des systèmes de transport identifiés par mutagenèse et RNAseq sont […] inconnues, leur caractérisation supplémentaire peut conduire à l'identification des voies réglementaires qui régissent la formation du biofilm. En utilisant la mutagenèse du transposon pour débloquer l'adhérence dans le pauvre biofilm B. thetaiotaomicron VPI 5482, nous avons identifié deux loci - un putatif V Mfa1 pili operon BT3148-7 et un opérat de synthèse de capsule 4 (CPS4) impliqué dans la formation de biofilm indépendamment des sels biliaires. Sur la base de l'homologie structurale avec les pilins mfa1, BT3148 et BT3147 constituent vraisemblablement une structure pilus qui requiert une troncature C-terminale de la pilule BT3147 de la tige prédite pour l'allongement et l'augmentation conséquente de la formation du biofilm. La microscopie électronique continue combinée à la détection d'immunoglole du pilus putatif devrait élucider complètement le mécanisme de formation de biofilm médié par BT3148-7. Le deuxième facteur de biofilm identifié indépendant de la bile est la capsule 4 (CPS4). Comme la suppression du CPS4 à l'état sauvage a conduit à une forte production de biofilm, nous avons émis l'hypothèse que le CPS4 pourrait masquer une adhésine putative. / Bacterial biofilms are widespread communities, in which high cell density, reduced diffusion and heterogeneous structure favor physical and metabolic contacts between bacteria and induce novel behaviors as compared to individual microorganisms. Most of the current knowledge about biofilm formation and metabolism is derived from the studies performed in pathogenic and environmental aerobic bacterial models, by contrast, there is little information on biofilm formation in strict anaerobes in general, and host-associated commensal anaerobes of the gastro-intestinal microbiota in particular. In this project we used static and dynamic in vitro biofilm assays combined with genetic and transcriptomic approaches to study molecular mechanisms of biofilm formation and metabolism in a prominent gut commensal Bacteroides thetaiotaomicron. Our initial screen on 35 B. thetaiotaomicron strains collected from various academic and clinical collections revealed a widespread ability of this species to form biofilm. However, biofilm production seemed repressed or masked in the reference wild type VPI 5482 and this prompted us to develop the thesis works along two main axis: the identification of conditions inducing in vitro biofilm formation in VPI 5482 and the identification and characterization of transposon mutants with increased biofilm capacity compared to WT VPI 5482. Having tested various compounds that are relevant to gut environment, we showed that bile salts – an important environmental clue for gut microbiota, induce biofilm formation in VPI 5482 and we used RNAseq to identify functions involved in bile salt-induced biofilm formation. RNAseq results show that bacteria in biofilm increase the expression of genes involved in glycosylation of cell surface and exhibit a specific expression pattern of capsular synthesis operons, suggesting that cell surface polysaccharides could be playing a key role during biofilm formation in B. thetaiotaomicron. We then used transposon mutagenesis to reveal adhesion factors involved in biofilm formation in presence of bile salts, which led to identification of an uncharacterized operon (BT3560-2) putatively involved in TonB-dependent transport of micronutrients. Even though the targets of the transport systems identified via mutagenesis and RNAseq are yet unknown, their further characterization may lead to identification of regulatory pathways that govern biofilm formation. Using transposon mutagenesis to unlock adhesion in the poor biofilm-former B. thetaiotaomicron VPI 5482, we identified two loci – a putative type V Mfa1 pili operon BT3148-7 and capsule synthesis operon 4 (CPS4) involved in biofilm formation independently of bile salts. Based on structural homology with mfa1 pilins, BT3148 and BT3147 likely constitute a pilus structure that requires C-terminal truncation of the predicted stalk pilin BT3147 for elongation and consequent increase in biofilm formation. Ongoing electron microscopy combined with immunogold detection of the putative pilus should fully elucidate the BT3148-7-mediated biofilm formation mechanism.

<p>Interindividualne razlike u sastavu i aktivnosti crevne mikroflore mogu uticati na metabolizam lekova kao i na njihov konačan terapijski odgovor. Simvastatin je lek iz grupe statina i karakteri&scaron;e ga izuzetno mala rastvorljivost u vodi, mala bioraspoloživost (&lt;5%) i velike interindividualne razlike u terapijskom odgovoru čiji uzroci nisu u potpunosti obja&scaron;njeni. Poslednjih godina velika pažnja se posvećuje ispitivanjima žučnih kiselina u razvoju novih farmaceutskih formulacija zbog svoje uloge u solubilizaciji i modifikaciji prodora lekova kroz biolo&scaron;ke membrane. Zbog svega navedenog, u fokusu na&scaron;eg istraživanja su bile potencijalne interakcije između simvastatina, probiotskih bakterija i žučnih kiselina o kojima se vrlo malo zna, a od izuzetne su važnosti, zbog mogućeg uticaja na farmakokinetske i farmakodinamske osobine simvastatina, pa samim tim i na konačan terapijski odgovor kod pacijenta.Cilj istraživanja je bio da se ispita prodor i metabolizam simvastatina u probiotskim bakterijama kao i uticaj različitih žučnih kiselina na transport ovog leka u bakterijske ćelije. Takođe, cilj je bio da se ispita uticaj soli žučnih kiselina na distribucioni koeficijent simvastatina, kao i interakcije žučnih kiselina sa simvastatinom na nivou transportnih proteina probiotskih bakterija kako bi se objasnila priroda očekivanih interakcija.Identifikacija i kvantifikacija uzoraka vr&scaron;ena je metodom tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom (LC-MS/MS). Kori&scaron;ćenjem programskih paketa VolSurf+ i Molinspiration, za identifikovane metabolite su izračunati molekulski deskriptori koji opisuju fizičko-hemijske i farmakokinetske osobine molekula. Određivanje distribucionog koeficijenta vr&scaron;eno je Shake-flask metodom. Interakcije žučnih kiselina sa simvastatinom na nivou transportnih proteina probiotskih bakterija ispitane su doking studijama pomoću SwissDock programa. Prilikom dvadesetčetvoročasovne inkubacije sa probiotskim bakterijama uočen je statistički značajan pad koncentracije simvastatina u ekstracelularnom sadržaju. Ukupan sadržaj simvastatina, kao zbir ekstracelulamog i intracelularnog sadržaja, je tokom čitavog ispitivanog perioda bio statistički značajno niži u odnosu na kontrolnu grupu bez probiotika navodeći na zaključak da se deo simvastatina tokom vremena metabolisao pod dejstvom enzima ispitivanih bakterija. Detektovano je i identifikovano 8 metaboličkih produkata simvastatina. Na osnovu izračunatih vrednosti molekulskih deskriptora, očekuje se da će metabolit M-452, koji predstavlja hidroksilovani produkt simvastatinske kiseline, pokazati najbolje rezultate u pogledu fizičko-hemijskih osobina i bioraspoloživosti u biolo&scaron;kom sistemu. Žučne kiseline nisu dovele do statistički značajne modifikacije transporta simvastatina u/iz probiotskih bakterija. Ipak, u nekim vremenskim tačkama primećena je ne&scaron;to veća koncentracija leka u ekstracelulamom prostoru u grupama sa žučnim kiselinama. Ove razlike se mogu delimično objasniti rezultatima određivanja distribucionog koeficijenta koji su pokazali da ispitivane žučne kiseline dovode do statistički značajnog smanjenja distribucionog koeficijenta simvastatina usled povećanja rastvorljivosti u vodenoj fazi. Rezultatima doking studija procenjeno je da ispitivane žučne kiseline imaju veći afinitet prema čak 80% multidrug transportera ispitivanih bakterija u odnosu na simvastatin &scaron;to govori o mogućnosti ostvarivanja interakcija žučnih kiselina sa ovim lekom na nivou transportnih proteina probiotskih bakterija. Na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da probiotske bakterije imaju ogroman uticaj na sudbinu simvastatina u biolo&scaron;kom sistemu. Uzimajući u obzir činjenicu da probiotske bakterije ulaze u sastav normalne crevne flore i da svaki organizam poseduje specifičan bakterijski sastav, trebalo bi posvetiti vi&scaron;e pažnje ispitivanju njegovog uticaja na farmakokinetiku lekova. Neophodna su dalja in vivo ispitivanja kako bi se utvrdila potencijalna farmakolo&scaron;ka aktivnost identifikovanih metabolita simvastatina nastalih pod dejstvom enzimske aktivnosti probiotskih bakterija. Povećanje rastvorljivosti simvastatina pomoću žučnih kiselina otvara mogućnost za dalja istraživanja u cilju razvoja novih farmaceutskih formulacija sa pobolj&scaron;anom bioraspoloživosti i farmakokinetskim osobinama.</p> / <p>Interindividual differences in the composition and activity of the gut microflora may affect the metabolism of drugs as well as their final therapeutic response. Simvastatin is drug from the group of statins and has extremely low water solubility, low bioavailability (&lt;5%) and high interindividual differences in therapeutic response whose causes are not fully understood. In recent years, great attention has been paid to studies of bile acids in the development of new pharmaceutical formulations because of their role in the drug solubilization and modification of drug transport through biological membranes. Accordingly, interactions between simvastatin, probiotic bacteria and bile acids were the focus of our research due to great importance and potential influence on the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of simvastatin, and therefore the final therapeutic response in the patients. The aim of the study was to investigate the simvastatin transport and metabolism in probiotic bacteria as well as the effect of various bile acids on drug transport into the bacterial cell. Additonally, the aim was to investigate the influence of bile salts on the distribution coefficient of simvastatin, and the interactions of bile acids with simvastatin at the level of probiotic transport proteins in order to elucidate the nature of expected interactions. Identification and quantification of samples were performed with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Molecular descriptors that describe the physico-chemical and pharmacokinetic properties of identified metabolites were calculated using the software packages VolSurf+ and Molinspiration. Determination of the distribution coefficient was performed using Shake-flask method. Interaction of bile acids with simvastatin at the level of bacterial transport proteins were studied using docking studies with SwissDock program. During the twenty-four hours of incubation with probiotic bacteria, simvastatin concentrations in the extracellular contet showed a statistically significant decrease. The total amount of simvastatin, as the sum of the extracellular and intracellular amount, during the whole study period, was significantly lower in comparison with control group without probiotics, suggesting that the part of simvastatin was metabolized by the enzymatic activity of studied bacteria. Accordingly, eight metabolic products of simvastatin were detected and identified. Based on the calculated values of molecular descriptors, it is expected that the metabolite M-452, which is the hydroxylated product of simvastatin acid, will show the best results in terms of physico-chemical properties and bioavailability in biological system. Bile acids did not show a significant influence on simvastatin transport into probiotic bacteria. However, in some time points, slightly higher drug concentrations in the extracellular medium in groups with bile acids were observed. These differences can be partly explained by the results of the determination of the distribution coefficients which showed that investigated bile acids lead to a statistically significant decrease in simvastatin distribution coefficient due to increased solubility in the aqueous phase. The results of docking studies estimated that studied bile acids have stronger affinities for the 80% of bacterial multidrug transporters compared to simvastatin indicating the possibility of achieving the interactions of bile acids with simvastatin at the level of transport proteins of probiotic bacteria. Based on the obtained results it could be concluded that probiotic bacteria have great influence on the fate of simvastatin in a biological system. Taking into account the fact that probiotic bacteria are the normal part of gut microflora and that each individual has specific bacterial fingerprint, more attention should be paid on studying its influence on drug pharmakocinetics. Further in vivo studies are required in order to determine potential pharmacological activity of identified simvastatin metabolites. Increased water solubility of simvastatin with bile acids may open the possibility for further investigations with the aim of development of new pharmaceutical formulation with improved bioavailability and pharmacokinetic properties.</p>

Introdução: A derivação gástrica em Y de Roux (DGYR) é considerada um bom modelo cirúrgico para estudar mecanismos associados à perda de peso e remissão de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) em pacientes obesos. Após DGYR, variações na microbiota intestinal podem ocorrer. Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil da microbiota intestinal nos períodos pré e pós-operato?rio, precoce e tardio, de pacientes obesas diabéticas submetidas à DGYR, e estudar sua associação com variáveis clínicas, antropométricas, de ingestão alimentar e remissão total de DM2. Métodos: O perfil da microbiota intestinal foi avaliado em amostras fecais obtidas de mulheres obesas com DM2 no momento pré-operatório - basal (n=25), três meses (n=20) e 12 meses (n=14) após DGYR através do sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S (16SRNA) com equipamento Illumina MiSeq. Nos três períodos foram coletados dados de ingestão alimentar, composição corporal e marcadores bioquímicos. O diagnóstico de remissão total de DM2 foi obtido após 12 meses de cirurgia, respeitando os critérios da American Diabetes Association (ADA). Resultados: Três meses após DGYR foi observado aumento (n=9) e decréscimo (n=1) de gêneros bacterianos e aumento da riqueza da microbiota intestinal, em relação aos apresentados no momento basal (p <- 0,05). Nenhuma alteração na abundância da microbiota intestinal foi observada entre 3 e 12 meses após a cirurgia (p >,05). No entanto, em relação ao momento pré-operatório, a razão Firmicutes/Bacteroidetes diminuiu após 12 meses da cirurgia (p < 0,037). Houve aumento na riqueza da microbiota que se associou à maior ingestão de fibras e menor ingestão de gorduras (p <- 0,05), em todos os tempos. Ao longo do período pós-operatório, as variáveis metabólicas gerais mostraram melhora, acompanhadas pela redução significativa de peso corpóreo e massa de gordura. Pacientes com remissão total de DM2 (RTDM) (57%) apresentaramno período pré-operatório aumento de três gêneros de bactérias intestinais e diminuição de dois gêneros, comparado aos doentes sem RTDM. Conclusões: Após DGYR, houve alterações quanto à composição do perfil da microbiota intestinal de mulheres obesas diabéticas e aumento da riqueza bacteriana. Os hábitos alimentares também influenciaram a modificação da microbiota fecal. A diferença pré-operatória de gêneros bacterianos encontrada em pacientes com remissão total do DM2 sugere a possibilidade de uso de marcadores microbianos na seleção de pacientes que podem se beneficiar desse efeito metabólico da cirurgia bariátrica / Background: Roux-en-Y gastric bypass (RYGB) is considered a good surgical model to study mechanisms associated with weight loss and remission of type 2 diabetes mellitus (DM2) in obese patients. After RYGB, variations in intestinal microbiota may occur. Objective: To evaluate the profile of the intestinal microbiota in the preoperative and postoperative periods, early and late, of obese diabetic patients submitted to the RYGB, and study the association with clinical, anthropometric, food intake and total remission of DM2. Methods: The intestinal microbiota profile was evaluated in faecal samples obtained from obese women with DM2 before (n = 25), three months (n = 20) and 12 months (n = 14) after RYGB, by extracting ribosomal RNA 16S and sequencing in Illumina MiSeq. Data on food intake, body composition and biochemical markers were collected in the same periods. The diagnosis of total remission of DM2 was obtained after 12 months of surgery, respecting the criteria of the American Diabetes Association (ADA). Results: Three months after DGYR, there was an increase (n = 9) and a decrease (n = 1) in bacterial genus and an increase in intestinal microbiota richness compared to basal (p <= 0.05). No change in intestinal microbiota abundance was observed between 3 and 12 months after surgery (p > 0.05). However, in relation to baseline, the Firmicutes / Bacteroidetes ratio decreased after 12 months of surgery (p < 0.037). There was an increase in the richness of the microbiota that was associated to the higher fiber intake and lower fat intake (p <= 0.05). Over the postoperative period, the general metabolic variables showed improvement, accompanied by a significant reduction in body weight and loss of fat mass. Patients with total remission of DM2 (TRDM) (57%) in the preoperative period, had an increase in tree genus of bacteria and a decrease in two genera of bacteria compared with patients without a total remission of DM2. Conclusions: After RYGB, changes occur in the intestinal microbiota profile of diabetic obese women, in terms of composition and increase of bacterial richness. Feeding habits also influenced the fecal microbiota modification. The difference in bacterial genus found in patients with total remission of DM2 suggests the potential possibility of using microbial markers to select patients who may benefit from this metabolic effect of bariatric surgery

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e ainda hoje representa um grande problema de saúde pública tendo infectado mais de oito milhões de pessoas. A patogênese da cardiomiopatia chagásica ainda não é completamente compreendida. A inflamação no miocárdio é intensa em relação ao número de parasitos presentes e também se observa um dano progressivo em outros órgãos como esôfago e cólon em 30% a 40% dos casos em que se diagnosticou a doença. Alguns estudos começaram a mostrar que a resposta imunológica a um parasita pode depender da microbiota intestinal; porém, ainda não existem estudos com a tecnologia de sequenciamento de nova geração (NGS) que descrevam a microbiota intestinal em doença de Chagas. É possível que uma pequena alteração do peristaltismo intestinal, decorrente da infecção por T. cruzi possa alterar a colonização de algumas bactérias as quais podem causar mudanças na reatividade do sistema imune como aumentar a resposta autoimune, gerando maior dano ao coração. OBJETIVO: Este trabalho objetivou descrever a microbiota intestinal de acordo com a forma clínica da doença de Chagas, através da amplificação do gene 16s RNA ribossomal e avaliar seu papel na patogênese da doença. MÉTODO: Foram selecionados 114 indivíduos, sendo 30 portadores da forma cardíaca da doença, 11 com a forma digestiva (megacólon), 32 com a indeterminada e 31 indivíduos saudáveis (controles). De cada um deles, foram coletadas amostras de fezes para a análise da microbiota por meio de técnicas de sequenciamento de nova geração Ion Torrent. Os resultados obtidos foram analisados pelo software QIIME para determinar a população de bactérias presentes nas amostras. A análise estatística foi realizada utilizando-se os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney U-test. RESULTADOS: A frequência relativa do filo Verucomicrobia foi significantemente menor no grupo cardíaco em comparação ao grupo controle e as outras formas clínicas: indeterminada e digestiva. Apesar da abundância relativa desse filo ser menor do que 1%, a diferença observada se manteve significante, mesmo após a correção de Bonferroni. CONCLUSÕES: Nosso estudo sugere que uma menor proporção do filo Verrucomicrobia possa estar relacionada ao processo inflamatório na forma cardíaca; porém, ainda pouco se conhece sobre este grupo de bactérias e seus componentes, que nos permita afirmar o seu efetivo papel na forma cardíaca da doença de Chagas / INTRODUCTION: Chagas disease is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi (T.cruzi) and still represents a major public health problem with more than eight million people infected. Chagas cardiomyopathy pathogenesis is still not completely understood. Inflammation in the myocardium is intense in relation to the number of parasites present and progressive damage is also observed in other organs such as the esophagus and colon in 30% to 40% of the cases. Some studies are beginning to show that the immune response to a parasite may depend on the intestinal microbiota. However, there are no studies using NGS technology that describes the intestinal microbiota of Chagas disease. It is possible that a small change in intestinal peristalsis due to T cruzi infection may alter the colonization of some bacteria. These changes could cause changes in the reactivity of the immune system such as increasing the autoimmune response causing greater damage to the heart. OBJECTIVE: This study aimed to describe the intestinal microbiota according to the clinical form of Chagas disease, through amplification of the 16s ribosomal RNA gene and to evaluate its role in the pathogenesis of the disease. METHODS: A total of 114 individuals were selected, 30 of cardiac form of the disease, 11 with the digestive form (megacolon), 32 with indeterminate form and 31 healthy individuals (controls). Stool samples were collected and analysed for the microbiota using Ion Torrent sequencing technique. The results were analyzed by the QIIME software to determine the population of bacteria present in the samples. Statistical was performed using Kruskal-Wallis non-parametric test and Mann-Whitney U-test. RESULTS: The relative frequency of the Verrucomicrobia phylum was significantly lower among the cardiac group when compared to control, indeterminate and digestive form. Our study suggest that the phylum Verrucomicrobia may play a role in the miocardio inflammation process in Chagas disease, however little is known about these bacteria to infer the mechanism

O microbioma intestinal tem sido associado à sepse, causada por infecção, apresentando respostas imunológicas exacerbadas. O peptídeo antimicrobiano CRAMP atua na imunidade inata com característica ambígua, ora pró-inflamatória ora anti-inflamatória. Nesse estudo, a sepse foi induzida por modelo de ligadura e punção cecal (CLP) e, através de RT-qPCR, o DNA de amostras fecais de camundongos selvagens e deficientes em CRAMP foi analisado. A expressão de Alfa-defensina 5 e Beta-defensina 1 foi investigada em RT-qPCR. Técnicas de imunofluorescência, Elisa e Milliplex, foram utilizadas na quantificação de citocinas - IL-1Beta, IL-6, IL-10, MCP-1 e TNF-Alfa -, e Alfa-defensina 7 e Beta-defensina 1. Os resultados mostraram a intensificação da resposta imune, diante da sepse, com alterações pró-inflamatórias de IL-1Beta, IL-6, MCP-1 e TNF-Alfa e anti-inflamatória de IL-10. A Beta-defensina 1 teve expressão aumentada, enquanto a produção foi mantida ou reduzida nos tecidos, após CLP. A liberação de Alfa-defensina 7 foi ampliada no pulmão de animais selvagens durante a sepse, enquanto a expressão de Alfa-defensina 5 foi reduzida no íleo e cólon. A relação entre o microbioma intestinal e a sepse evidenciou-se com o crescimento da espécie Escherichia coli, enquanto o CRAMP apresentou associação com a espécie Bacteroides vulgatus. Novos estudos permitiram mais conhecimento sobre a interação entre sepse e microbioma intestinal, potencializando o uso de biomarcadores e nova terapêutica na recuperação intestinal, tal como transplante microbiológico fecal / The intestinal microbiome has been associated with sepsis, caused by infection, presenting exacerbated immune responses. The antimicrobial peptide CRAMP acts on innate immunity with ambiguous features, pro-inflammatory and anti-inflammatory. In this study, sepsis was induced by cecal ligation and puncture (CLP) model and, through RT-qPCR, the DNA of fecal samples from wild type and CRAMP-deficient mice was analyzed. Expression of Alpha-defensin 5 and Beta-defensin 1 was investigated in RT-qPCR. Immunofluorescence techniques, Elisa and Milliplex, were used to quantify cytokines - IL-1Beta, IL-6, IL-10, MCP-1 and TNF-Alpha -, and Alpha-defensin 7 and Beta-defensin 1. The results showed the enhancement of the immune response to sepsis with proinflammatory alterations of IL-1Beta, IL-6, MCP-1 and TNF-Alpha and anti-inflammatory IL-10. CRAMP and Beta-defensin 1 peptides had increased expression, while production was maintained or reduced in tissues after CLP. The release of Alpha-defensin 7 was amplified in the lungs of wild type animals during sepsis, while expression of Alpha-defensin 5 was reduced in the ileum and colon. The relationship between the intestinal microbiome and sepsis was evidenced by the growth of Escherichia coli, while CRAMP was associated with Bacteroides vulgatus. New studies have allowed more knowledge about the interaction between sepsis and intestinal microbiome, potentializing the use of biomarkers and new therapy in intestinal recovery, such as fecal microbiological transplantation

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e ainda hoje representa um grande problema de saúde pública tendo infectado mais de oito milhões de pessoas. A patogênese da cardiomiopatia chagásica ainda não é completamente compreendida. A inflamação no miocárdio é intensa em relação ao número de parasitos presentes e também se observa um dano progressivo em outros órgãos como esôfago e cólon em 30% a 40% dos casos em que se diagnosticou a doença. Alguns estudos começaram a mostrar que a resposta imunológica a um parasita pode depender da microbiota intestinal; porém, ainda não existem estudos com a tecnologia de sequenciamento de nova geração (NGS) que descrevam a microbiota intestinal em doença de Chagas. É possível que uma pequena alteração do peristaltismo intestinal, decorrente da infecção por T. cruzi possa alterar a colonização de algumas bactérias as quais podem causar mudanças na reatividade do sistema imune como aumentar a resposta autoimune, gerando maior dano ao coração. OBJETIVO: Este trabalho objetivou descrever a microbiota intestinal de acordo com a forma clínica da doença de Chagas, através da amplificação do gene 16s RNA ribossomal e avaliar seu papel na patogênese da doença. MÉTODO: Foram selecionados 114 indivíduos, sendo 30 portadores da forma cardíaca da doença, 11 com a forma digestiva (megacólon), 32 com a indeterminada e 31 indivíduos saudáveis (controles). De cada um deles, foram coletadas amostras de fezes para a análise da microbiota por meio de técnicas de sequenciamento de nova geração Ion Torrent. Os resultados obtidos foram analisados pelo software QIIME para determinar a população de bactérias presentes nas amostras. A análise estatística foi realizada utilizando-se os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney U-test. RESULTADOS: A frequência relativa do filo Verucomicrobia foi significantemente menor no grupo cardíaco em comparação ao grupo controle e as outras formas clínicas: indeterminada e digestiva. Apesar da abundância relativa desse filo ser menor do que 1%, a diferença observada se manteve significante, mesmo após a correção de Bonferroni. CONCLUSÕES: Nosso estudo sugere que uma menor proporção do filo Verrucomicrobia possa estar relacionada ao processo inflamatório na forma cardíaca; porém, ainda pouco se conhece sobre este grupo de bactérias e seus componentes, que nos permita afirmar o seu efetivo papel na forma cardíaca da doença de Chagas / INTRODUCTION: Chagas disease is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi (T.cruzi) and still represents a major public health problem with more than eight million people infected. Chagas cardiomyopathy pathogenesis is still not completely understood. Inflammation in the myocardium is intense in relation to the number of parasites present and progressive damage is also observed in other organs such as the esophagus and colon in 30% to 40% of the cases. Some studies are beginning to show that the immune response to a parasite may depend on the intestinal microbiota. However, there are no studies using NGS technology that describes the intestinal microbiota of Chagas disease. It is possible that a small change in intestinal peristalsis due to T cruzi infection may alter the colonization of some bacteria. These changes could cause changes in the reactivity of the immune system such as increasing the autoimmune response causing greater damage to the heart. OBJECTIVE: This study aimed to describe the intestinal microbiota according to the clinical form of Chagas disease, through amplification of the 16s ribosomal RNA gene and to evaluate its role in the pathogenesis of the disease. METHODS: A total of 114 individuals were selected, 30 of cardiac form of the disease, 11 with the digestive form (megacolon), 32 with indeterminate form and 31 healthy individuals (controls). Stool samples were collected and analysed for the microbiota using Ion Torrent sequencing technique. The results were analyzed by the QIIME software to determine the population of bacteria present in the samples. Statistical was performed using Kruskal-Wallis non-parametric test and Mann-Whitney U-test. RESULTS: The relative frequency of the Verrucomicrobia phylum was significantly lower among the cardiac group when compared to control, indeterminate and digestive form. Our study suggest that the phylum Verrucomicrobia may play a role in the miocardio inflammation process in Chagas disease, however little is known about these bacteria to infer the mechanism

Introdução: A derivação gástrica em Y de Roux (DGYR) é considerada um bom modelo cirúrgico para estudar mecanismos associados à perda de peso e remissão de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) em pacientes obesos. Após DGYR, variações na microbiota intestinal podem ocorrer. Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil da microbiota intestinal nos períodos pré e pós-operato?rio, precoce e tardio, de pacientes obesas diabéticas submetidas à DGYR, e estudar sua associação com variáveis clínicas, antropométricas, de ingestão alimentar e remissão total de DM2. Métodos: O perfil da microbiota intestinal foi avaliado em amostras fecais obtidas de mulheres obesas com DM2 no momento pré-operatório - basal (n=25), três meses (n=20) e 12 meses (n=14) após DGYR através do sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S (16SRNA) com equipamento Illumina MiSeq. Nos três períodos foram coletados dados de ingestão alimentar, composição corporal e marcadores bioquímicos. O diagnóstico de remissão total de DM2 foi obtido após 12 meses de cirurgia, respeitando os critérios da American Diabetes Association (ADA). Resultados: Três meses após DGYR foi observado aumento (n=9) e decréscimo (n=1) de gêneros bacterianos e aumento da riqueza da microbiota intestinal, em relação aos apresentados no momento basal (p <- 0,05). Nenhuma alteração na abundância da microbiota intestinal foi observada entre 3 e 12 meses após a cirurgia (p >,05). No entanto, em relação ao momento pré-operatório, a razão Firmicutes/Bacteroidetes diminuiu após 12 meses da cirurgia (p < 0,037). Houve aumento na riqueza da microbiota que se associou à maior ingestão de fibras e menor ingestão de gorduras (p <- 0,05), em todos os tempos. Ao longo do período pós-operatório, as variáveis metabólicas gerais mostraram melhora, acompanhadas pela redução significativa de peso corpóreo e massa de gordura. Pacientes com remissão total de DM2 (RTDM) (57%) apresentaramno período pré-operatório aumento de três gêneros de bactérias intestinais e diminuição de dois gêneros, comparado aos doentes sem RTDM. Conclusões: Após DGYR, houve alterações quanto à composição do perfil da microbiota intestinal de mulheres obesas diabéticas e aumento da riqueza bacteriana. Os hábitos alimentares também influenciaram a modificação da microbiota fecal. A diferença pré-operatória de gêneros bacterianos encontrada em pacientes com remissão total do DM2 sugere a possibilidade de uso de marcadores microbianos na seleção de pacientes que podem se beneficiar desse efeito metabólico da cirurgia bariátrica / Background: Roux-en-Y gastric bypass (RYGB) is considered a good surgical model to study mechanisms associated with weight loss and remission of type 2 diabetes mellitus (DM2) in obese patients. After RYGB, variations in intestinal microbiota may occur. Objective: To evaluate the profile of the intestinal microbiota in the preoperative and postoperative periods, early and late, of obese diabetic patients submitted to the RYGB, and study the association with clinical, anthropometric, food intake and total remission of DM2. Methods: The intestinal microbiota profile was evaluated in faecal samples obtained from obese women with DM2 before (n = 25), three months (n = 20) and 12 months (n = 14) after RYGB, by extracting ribosomal RNA 16S and sequencing in Illumina MiSeq. Data on food intake, body composition and biochemical markers were collected in the same periods. The diagnosis of total remission of DM2 was obtained after 12 months of surgery, respecting the criteria of the American Diabetes Association (ADA). Results: Three months after DGYR, there was an increase (n = 9) and a decrease (n = 1) in bacterial genus and an increase in intestinal microbiota richness compared to basal (p <= 0.05). No change in intestinal microbiota abundance was observed between 3 and 12 months after surgery (p > 0.05). However, in relation to baseline, the Firmicutes / Bacteroidetes ratio decreased after 12 months of surgery (p < 0.037). There was an increase in the richness of the microbiota that was associated to the higher fiber intake and lower fat intake (p <= 0.05). Over the postoperative period, the general metabolic variables showed improvement, accompanied by a significant reduction in body weight and loss of fat mass. Patients with total remission of DM2 (TRDM) (57%) in the preoperative period, had an increase in tree genus of bacteria and a decrease in two genera of bacteria compared with patients without a total remission of DM2. Conclusions: After RYGB, changes occur in the intestinal microbiota profile of diabetic obese women, in terms of composition and increase of bacterial richness. Feeding habits also influenced the fecal microbiota modification. The difference in bacterial genus found in patients with total remission of DM2 suggests the potential possibility of using microbial markers to select patients who may benefit from this metabolic effect of bariatric surgery

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal tem sido alvo de diversos estudos moleculares, principalmente através da introdução de plataformas de sequenciamento de nova geração, devido à sua importância e amplo relacionamento com o hospedeiro humano. Entretanto, o armazenamento de amostras fecais antes da extração do DNA é crítico ao caracterizar a composição da microbiota intestinal. Com base nesses dados, o presente estudo buscou compreender os efeitos de diferentes métodos de armazenamento de amostras fecais para caracterizar a microbiota intestinal através do sequenciamento da nova geração, bem como estabelecer um método alternativo de conservação do material genético bacteriano nessas amostras, utilizando guanidina. MÉTODO: Foram coletadas amostras de fezes de 10 voluntários saudáveis. Cada amostra foi dividida em cinco alíquotas, uma alíquota extraída imediatamente após a coleta (fresca) e duas alíquotas submetidas ao congelamento, à temperaturas de -20°C e -80°C e extraídas após 48 horas. As outras duas alíquotas restantes foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4°C e extraídas após 48 horas. Para observar a presença de alterações na microbiota intestinal, durante um período de armazenamento maior das amostras de fezes, três amostras foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4ºC e extraídas após o período de 60 dias. A região hipervariável v4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada por PCR. Os amplicons gerados foram sequenciados utilizando a plataforma Ion PGM Torrent e os dados analisados utilizando o software QIIME. A determinação da significância estatística foi realizada utilizando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos níveis taxonômicos (filo, classe, família, ordem e gênero) entre amostras frescas analisadas e os métodos de armazenamento testados. As análises de coordenadas principais (PCoA) mostraram que as amostras se agruparam de acordo com os indivíduos analisados, tendo as amostras referentes a cada indivíduo agrupado-se com maior proximidade do que com outras amostras do mesmo grupo de armazenamento. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que o congelamento e o uso de guanidina para armazenamento de amostras de fezes, para a caracterização da microbiota intestinal, podem efetivamente preservar o material genético bacteriano nessas amostras ao longo de um período de 48 horas para amostras submetidas ao congelamento e durante 60 dias para amostras armazenadas em guanidina / INTRODUCTION: The gut microbiota has been the target of several molecular studies, mainly through the introduction of next generation sequencing platforms, due to its importance and wide relationship with the human host. However, the storage of fecal samples prior to DNA extraction is critical when characterizing the composition of the intestinal microbiota. Based on these facts, the present study aimed to understand the effects of different methods of storage of fecal samples to characterize the intestinal microbiota by next generation sequence, as well as establishing an alternative conservation method of the bacterial genetic material in these samples using guanidine. METHODS: Stool samples from 10 healthy volunteers were collected. Each collected sample was divided into five aliquots, one aliquot extracted immediately after collection (fresh) and two aliquots subjected to freezing at -20°C and -80°C temperatures and extracted after 48 hours. The others two remaining aliquots were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 48 hours. In order to observe the presence of alterations in the intestinal microbiota, during a longer storage period of the stool samples, three samples were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 60 day period. The v4 hypervariable region of bacterial and archeal 16S rRNA gene were amplified by PCR. The generated amplicons were sequenced using Ion PGM Torrent platform and the data analyzed using the software QIIME. Determination of statistical significance was performed using non-parametric Kruskal-Wallis test. RESULTS: No significant differences were found in any of the taxonomic levels (phylum, class, family, order and genus) between analyzed fresh samples and the others different storage methods. The principal coordinates analysis (PCoA) unweighted showed that the samples clustered based on the host each sample originated from, rather than by storage group. CONCLUSION: Our data suggest that both freezing and the use of guanidine to store stool samples for gut microbiota characterization can effectively preserve the bacterial genetic material in these samples over a 48 hours period for samples subjected to freezing and for up to 60 days for samples stored in guanidine

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal tem sido alvo de diversos estudos moleculares, principalmente através da introdução de plataformas de sequenciamento de nova geração, devido à sua importância e amplo relacionamento com o hospedeiro humano. Entretanto, o armazenamento de amostras fecais antes da extração do DNA é crítico ao caracterizar a composição da microbiota intestinal. Com base nesses dados, o presente estudo buscou compreender os efeitos de diferentes métodos de armazenamento de amostras fecais para caracterizar a microbiota intestinal através do sequenciamento da nova geração, bem como estabelecer um método alternativo de conservação do material genético bacteriano nessas amostras, utilizando guanidina. MÉTODO: Foram coletadas amostras de fezes de 10 voluntários saudáveis. Cada amostra foi dividida em cinco alíquotas, uma alíquota extraída imediatamente após a coleta (fresca) e duas alíquotas submetidas ao congelamento, à temperaturas de -20°C e -80°C e extraídas após 48 horas. As outras duas alíquotas restantes foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4°C e extraídas após 48 horas. Para observar a presença de alterações na microbiota intestinal, durante um período de armazenamento maior das amostras de fezes, três amostras foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4ºC e extraídas após o período de 60 dias. A região hipervariável v4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada por PCR. Os amplicons gerados foram sequenciados utilizando a plataforma Ion PGM Torrent e os dados analisados utilizando o software QIIME. A determinação da significância estatística foi realizada utilizando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos níveis taxonômicos (filo, classe, família, ordem e gênero) entre amostras frescas analisadas e os métodos de armazenamento testados. As análises de coordenadas principais (PCoA) mostraram que as amostras se agruparam de acordo com os indivíduos analisados, tendo as amostras referentes a cada indivíduo agrupado-se com maior proximidade do que com outras amostras do mesmo grupo de armazenamento. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que o congelamento e o uso de guanidina para armazenamento de amostras de fezes, para a caracterização da microbiota intestinal, podem efetivamente preservar o material genético bacteriano nessas amostras ao longo de um período de 48 horas para amostras submetidas ao congelamento e durante 60 dias para amostras armazenadas em guanidina / INTRODUCTION: The gut microbiota has been the target of several molecular studies, mainly through the introduction of next generation sequencing platforms, due to its importance and wide relationship with the human host. However, the storage of fecal samples prior to DNA extraction is critical when characterizing the composition of the intestinal microbiota. Based on these facts, the present study aimed to understand the effects of different methods of storage of fecal samples to characterize the intestinal microbiota by next generation sequence, as well as establishing an alternative conservation method of the bacterial genetic material in these samples using guanidine. METHODS: Stool samples from 10 healthy volunteers were collected. Each collected sample was divided into five aliquots, one aliquot extracted immediately after collection (fresh) and two aliquots subjected to freezing at -20°C and -80°C temperatures and extracted after 48 hours. The others two remaining aliquots were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 48 hours. In order to observe the presence of alterations in the intestinal microbiota, during a longer storage period of the stool samples, three samples were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 60 day period. The v4 hypervariable region of bacterial and archeal 16S rRNA gene were amplified by PCR. The generated amplicons were sequenced using Ion PGM Torrent platform and the data analyzed using the software QIIME. Determination of statistical significance was performed using non-parametric Kruskal-Wallis test. RESULTS: No significant differences were found in any of the taxonomic levels (phylum, class, family, order and genus) between analyzed fresh samples and the others different storage methods. The principal coordinates analysis (PCoA) unweighted showed that the samples clustered based on the host each sample originated from, rather than by storage group. CONCLUSION: Our data suggest that both freezing and the use of guanidine to store stool samples for gut microbiota characterization can effectively preserve the bacterial genetic material in these samples over a 48 hours period for samples subjected to freezing and for up to 60 days for samples stored in guanidine