Mitjançant les tècniques de hibridació in situ fluorescent (FISH) i de hibridació in situ fluorescent multiple (M-FISH) es van estudiar diferents sèries de pacients de leucèmia mieloide aguda (LMA) en el moment del seu diagnòstic, per tal d'identificar possibles alteracions genètiques, no observades prèviament per anàlisi citogenètica convencional (ACC). Així, al analitzar dos pacients que presentaven un material cromosòmic afegit al cariotip, es va detectar en ambdós casos, una trisomia parcial del cromosoma 11, la qual es produïa per una translocació desequilibrada de la regió 11q22~23 a 11qter. Aquesta alteració cromosòmica seria una nova anomalia recurrent associada a la duplicació parcial en tàndem del gen MLL. Alhora, en la sèrie de 40 pacients de LMA amb inv(16)(p13q22)/t(6;16)(p13;q22) s'han identificat mitjançant FISH dos casos de translocacions emmascarades associades a la inv(16)(p13q22), no descrites prèviament, t(10;16)(p13;q22)inv(16)(p13q22) i t(1;16)(p36;q22)inv(16)(p13q22). Pel què fa a la sèrie de 40 pacients de LMA amb cariotip normal estudiada, no s'ha identificat per FISH la prescència de la t(5;11)(q35;p15.5) a diferència de les sèries de LMA pediàtriques publicades recentment. La tècnica de hibridació genòmica comparada (CGH) es va utilitzar per la detecció de guanys i pèrdues de material genètic en la LMA, demostrant que l'alteració genètica desequilibrada més freqüent és la pèrdua parcial de regions cromosòmiques (54 %), les quals es loalitzen majoritàriament als cromosomes 5q, 7q, 7, 16q i 17p, essent també recurrents els guanys dels cromosomes 8 i 22. Els resultats de CGH van aportar informació útil per la identificació d'alteracions genètiques no identificades prèviament per ACC, identificant alteracions cromosòmiques més complexes, i ajudant a la caracterització de cromosomes marcadors, derivatius i materials cromosòmics afegits al cariotip. Els estudis complementàris de FISH i M-FISH van confirmar els perfils de CGH i van ajudar a proposar el cariotip final, sobretot en els casos de cariotip complex. Destacar que els resultats de CGH i M-FISH suggereixen que el subgrup de LMA <60 anys i cariotip normal, no es caracteritza per la presència significativa d'anomalies genètiques.Es van estudiar perfils d'expressió gènica, mitjançant cADN array, de gens relacionats amb el mecanisme d'apoptosis en pacients de LMA, ja que alteracions en l'apoptosis tenen efecte onogènic i poden donar resistència al tractament. Un total de 27 gens apoptòtics es trobaven desregulats, dels 205 gens inclosos en l'array. Es destaquen IGFBP3, IGFBP5, CLU, GADD45 i gens codificants per enzims de detoxificació per glutatió, com a nous gens implcats en l'alteració de les vies senyalització de l'apoptosis en LMA. Els resultats es van validar per QRT-PCR a temps real, obtenint una elevada correlació entre ambdues tècniques.La mateixa tècnica de QRT-PCR a temps real es va emprar per analitzar l'expressió dels gens HOXA9, DEK, CBL i CSF1R en una sèrie de 41 pacients de LMA. La desregulació d'aquests gens s'havia s'havia identificat en treballs publicats recentment per cADN array, on se suggeria que podrien ser gens importants pel desenvolupament de la LMA. En la sèrie estudiada es va confirmar la desregulació d'aquests gens, demostrant alhora diferents associacions significatives entre expressió gènica i paràmetres biològics: sotaexpressió de HOXA9 en LMA amb t(8;21)(q22;q22); sobreexpressió de DEK i HOXA9 en LMA sense expressió de CD34; sotaexpressió de CSF1R i HOXA9 en LMA-M2; sobreexpressió de CBL i CSF1R en LMA-M5 i sotaexpressió de CBL i pacients majors de 60 anys. / To identify genetic alterations not previously detected by conventional cytogenetic analysis (CCA), fluorescent in situ hybridization (FISH) and fluorescent in situ hybridization multiplex (M-FISH) were used to analyze several series of acute myeloid leukemia (AML) at the time of diagnosis. In 2 cases whose karyotype showed an unknown additional chromosomal material, we detected a partial trisomy of chromosome 11, from 11q22~23 to 11qter, as a result of an unbalanced chromosomal translocation. Partial tandem duplication of MLL gene were detected in both cases. Furthermore, in a series of 40 AML patients with inv(16)(p13q22)/t(6;16)(p13;q22), we identify two cases of masked translocation associated with inv(16)(p13q22), which were not described previously, t(10;16)(p13;q22)inv(16)(p13q22) and t(1;16)(p36;q22)inv(16)(p13q22). Moreover, we did not detected the t(5;11)(q35;p15.5) by FISH in a series of 40 AML patients with normal karyotype, which is in contrast with previously reported series of childhood AML patients. Comparative genomic hybridization (CGH) was used to detect gains and losses of chromosomal material in a series of 128 AML patients. The most frequent genetic alteration was the partial loss (54 %), frequently involving the 5q, 7q, 7, 16q and 17p chromosomal regions. Gains of chromosome 8 and 22 were also recurrent. CGH was useful to identify chromosomal alterations not previously detected by CCA, and it help to characterize marker chromosomes, derivative chromosomes and unknown additional chromosomal materials. Complementary FISH and M-FISH experiments confirmed CGH results and helped to proposed the final karyotype. Genetic alterations were not identify by using CGH and M-FISH in the series of AML patients younger then 60 years and normal karyotype.We investigated apoptotic gene expression profiles by cDNA array technique in a series of AML patients. Alterations in the apoptotic signaling pathways have oncogenic effect and could induce resistance to therapy. A total of 27/205 apoptotic genes presented an abnormal expression as compared to the reference. IGFBP3, IGFBP5, CLU, GADD45 and several genes of glutathione detoxification pathway were identified as new important genes in the pathogenesis of AML. Real time QRT-PCR was used to confirm the data obtained by cDNA array technique, which showed a good correlation.Real time QRT-PCR were also used to analyzed in a series of 41 AML patients the expression of HOXA9, DEK, CBL and CSF1R, which were reported to be aberrantly expressed in AML. We confirm the deregulation of these genes in AML as well as we described several associations between gene expression and hematological and clinical parameters: under-expression of HOXA9 in AML with t(8;21)(q22;q22); over-expression of DEK and HOXA9 in AML without CD34; under-expression of CSF1R and HOXA9 in AML-M2; over-expression of CBL and CSF1R in AML-M5; under-expression of CBL and patients older than 60 years.

Las anomalías cromosómicas están implicadas en la aparición de muchas enfermedades hereditarias, siendo también la principal causa de retraso mental y de pérdidas gestacionales. La pérdida, ganancia o reordenación de fragmentos cromosómicos de un tamaño similar, puede tener distintas consecuencias dependiendo del número y función de los genes que contengan. Los métodos clásicos de bandeo cromosómico han sido durante muchos años la única herramienta para la detección de anomalías cromosómicas tanto numéricas como estructurales. Gracias a estas técnicas se han podido identificar muchas anomalías cromosómicas asociadas a diferentes malformaciones congénitas, síndromes o cánceres colaborando eficazmente en la comprensión de la etiología de dichas patologías. No obstante, las alteraciones cromosómicas de un tamaño < 3-5 Mb o las reorganizaciones complejas son muy difíciles de identificar mediante las técnicas de bandas convencionales. Desde su inicio, hacia 1980, las técnicas de citogenética molecular basadas en la hibridación in situ fluorescente (FISH) y sus variantes tecnológicas, entre ellas la Hibridación Genómica Comparada (CGH) i la FISH-Multicolor (M-FISH), han permitido la detección e identificación precisa de un gran número de anomalías cromosómicas, como las microdeleciones, las reorganizaciones cromosómicas complejas y las reorganizaciones crípticas, que hasta ese momento pasaban desapercibidas. El objetivo principal de este trabajo ha sido profundizar en el papel que desempeñan regiones cromosómicas específicas, que al alterarse, originan fenotipos concretos mediante la aplicación conjunta de diferentes técnicas de citogenética molecular (CGH y FISH) y de citogenética convencional. Hoy en día, se conocen muy pocas regiones cromosómicas cuya alteración, por pérdida o duplicación, esté asociada a un síndrome clínico bien definido. Distintos estudios, incluido el presente, muestran que tanto la CGH, como la M-FISH, son dos técnicas que contribuyen eficazmente en la identificación de regiones cromosómicas específicas asociadas a fenotipos concretos. Esta información es de suma importancia para los biólogos moleculares como indicación de qué regiones del genoma deben considerar como "dianas" para identificar los genes implicados.En esta tesis además de la puesta a punto u optimización de las técnicas de M-FISH, CGH y HR-CGH para su aplicación al diagnóstico prenatal y postnatal, se han determinado las limitaciones tanto de las propias técnicas como de los softwares empleados. Ello nos ha permitido establecer nuevas correlaciones genotipo-fenotipo gracias a la identificación de 27 monosomías y trisomías autosómicas y gonosómicas, 15 cromosomas marcadores supernumerarios y 9 reorganizaciones complejas y/o crípticas. Al mismo tiempo, se ha establecido un protocolo para la identificación de marcadores cromosómicos mediante la utilización combinada de las técnicas de citogenética convencional, FISH y CGH. Por último, el análisis de los 77 puntos de rotura implicados en las anomalías cromosómicas estudiadas ha revelado que no se producen al azar y que fundamentalmente afectan a los cromosomas: 2, 7, 9, 15, 16, 18, X e Y. Las bandas más afectadas han sido: 9p23, 11q22.2, 14q11.2, 15q11.2, 15q15, 16p11.2, 18q22, 22q11.2, Xp22.3, Xq21.2, Yp11.3 e Yq12, evidenciando que las roturas cromosómicas se producen en bandas cromosómicas claras (80%) que corresponden a regiones del genoma con un mayor contenido genético. El análisis de estos puntos revela que coinciden en un 90% con regiones donde se ha descrito duplicaciones segmentarias. Este último hallazgo es de suma importancia y abre un nuevo campo de investigación.En resumen, esta tesis muestra la utilidad y aplicabilidad de la CGH y M-FISH, tanto en Diagnóstico Prenatal como Postnatal, al identificar tanto pequeños desequilibrios como reorganizaciones complejas y/o crípticas permitiendo establecer nuevas correlaciones genotipo-fenotipo que facilitaran en un futuro un consejo genético mucho más preciso. / Chromosomal abnormalities are involved in the appearance of many hereditary diseases representing the principal factor of mental retardation as well as miscarriages. The loss, gain or redistribution of chromosomal fragments with a similar size may have different consequences depending on the number and function of the respective genes.During lots of years conventional chromosomal banding techniques had been applied as a unique tool in order to detect numerical and structural chromosomal abnormalities. Thanks to those techniques a significant number of chromosome-related abnormalities associated with congenital malformations, diverse syndromes and cancer forms could be indeed identified consolidating on this way, even a better comprehension of the etiology of these pathologies. However, the chromosomal alterations with a size of < 3-5 Mb or complex reorganizations are rather difficult to be identified by conventional banding techniques. Since 1980 molecular cytogenetic techniques based on a fluorescence in situ hybridization (FISH) with its technologic variants as for instance the Comparative Genomic Hybridization (CGH) and the multicolour-FISH (M-FISH) made possible the exact detection and identification of numerous chromosomal abnormalities as there are microdeletions, complex chromosomal reorganizations as well as cryptic reorganizations which until that moment could not be recognized. The main objective of this work consisted of focussing the specific chromosomal regions which cause in case of alteration concrete phenotypes by means of a combined application of different molecular cytogenetic and conventional techniques (CGH and FISH). Nowadays we dispose of a very limited know how about chromosomal regions of which an alteration by deletion or duplication is associated with a well defined clinical syndrome. Different studies including the present one had showed that both procedures CGH and M-FISH are techniques able to identify efficiently specific chromosomal regions associated with specific phenotypes. This information is a quite important for molecular biologists as it reveals which regions of a genome can be considered as key regions within the definition of implicated genes.With this doctoral thesis, besides the improvement and/or optimisation of M-FISH, CGH and HR-CGH techniques relevant for prenatal and postnatal diagnosis, limitations had been determined on the one hand regarding the same techniques and on the other hand with respect to the software. That circumstance allowed us indeed to establish new genotype-phenotype correlations due to the identification of 27 autosomal and gonosomal monosomies and trisomies, 15 supernumerary marker chromosomes and 9 complex and/or cryptic reorganizations. At the same time a protocol could be established for the identification of supernumerary marker chromosomes by the combined application of the conventional cytogenetic techniques FISH and CGH.Finally the analysis of the 77 breakpoints implicated in the investigated chromosomal abnormalities unveiled that they had not been brought out accidentally and that they fundamentally affect the chromosomes: 2, 7, 9, 15, 16, 18, X and Y. On the other hand the bands more affected were 9p23, 11q22.2, 14q11.2, 15q15, 16p11.2, 18q22, 22q11.2, Xp22.3, Xq21.2, Yp11.3 and Yq12, showing that chromosome breaks are mainly located on clear chromosome bands (80%) corresponding to genome regions with a bigger genetic content. The analysis of these points reveals that a 90 % of them coincide with regions in which segmental duplications had been described. This last recognition represents an outstanding circumstance and initiates in a future a new serie of investigations.Summing up this doctoral thesis shows the utility and applicability of CGH and M-FISH as prenatal and postnatal diagnosis identifying as well slighter deviations as complex and cryptic reorganisations. It will equally allow us to establish new genotypic and phenotypic correlations making possible in a future a more exact genetic assessment.

Introducción: El tabaco tiene graves problemas para la salud del individuo ya que da lugar a la aparición de enfermedades como: pulmonar obstructiva crónica, cardiovascular o cáncer pero también tiene efectos adversos en el embarazo. Fumar durante la gestación tiene consecuencias como problemas de coagulación o accidentes obstétricos: embarazo extrauterino o placenta previa, y retraso de crecimiento. Recientemente se ha sugerido la existencia de una relación entre la exposición postnatal al tabaco y cáncer en niños, especialmente leucemia y linfomas. Diversos autores han detectado la presencia de metabolitos específicos del tabaco en líquido amniótico de gestantes fumadoras y en la orina de recién nacidos lo que sugiere un posible efecto genotóxico en etapas tempranas del desarrollo embrionario. Sin embargo, únicamente se han publicados dos estudios indirectos sobre el posible efecto genotóxico del tabaco en el embarazo.Objetivos: En este estudio se ha valorado el posible efecto genotóxico del hábito de fumar durante la gestación en las células de líquido amniótico. Para ello se ha analizado si se producía, o no, un incremento de inestabilidad cromosómica expresado en forma de las lesiones cromosómicas (gaps y roturas), y la presencia de anomalías cromosómicas estructurales. Así mismo, se ha analizado si existen regiones cromosómicas especialmente afectadas por la exposición al tabaco. Material y métodos: En este estudio prospectivo se han analizado un total de 50 muestras de líquido amniótico, procedentes de diagnóstico prenatal, subdivididas en dos grupos: 25 muestras de gestantes no fumadoras (C; controles) y 25 de gestantes fumadoras (F). Estas últimas consumían más de 10 cigarrillos al día, al menos durante 10 años, y continuaban fumando durante el embarazo. En total se requirieron 800 encuestas para seleccionar las gestantes de ambos grupos; 496 encuestas para encontrar 25 mujeres controles que no fueran fumadoras pasivas; y 175 entrevistas para conseguir las 25 gestantes fumadoras. Ninguna de las gestantes debia consumir alcohol, café ni té. La evaluación citogenética se realizó de acuerdo con los procedimientos convencionales, analizándose sólo metafases de alta calidad. Se estudiaron más de 100 metafases por muestra para detectar las lesiones cromosómicas mediante tinción secuencial uniforme-bandas G (Wright). Para caracterizar las anomalías cromosómicas estructurales, se cariotiparon como mínimo 25 metafases por muestra. Resultados: Para la comparación de los datos citogenéticos obtenidos en fetos de los dos grupos de gestantes se ha utilizado el método de ecuaciones estimado generalizado (GEE) . Se han observado importantes diferencias estadísticas entre (i) la proporción de metafases con inestabilidad cromosómica (F: 10.5% (262/2492); C: 8.0% (210/2637); P=0.0357), (ii) La proporción de lesiones cromosómicas (F: 15.7% (391/2492); C: 10.1% (267/2637); P=0.0450), y (iii) la proporción de anomalías cromosómicas estructurales (F: 12.1% (96/793); C: 3.5% (26/752); P=0.0015). El análisis estadístico de los 689 puntos de rotura implicados en lesiones y alteraciones cromosómicas estructurales mostró que la banda 11q23 fue la región cromosómica más afectada por el tabacoConclusiones: Nuestros resultados muestran un incremento de la inestabilidad cromosómica en células fetales (amniocitos) de gestantes que fuman más de 10 cigarrillos al día, durante más de 10 años y que continúan haciéndolo durante su embarazo. La banda 11q23 es especialmente sensible al efecto de los componentes del tabaco en células fetales. Se sabe que esta banda esta relacionada con procesos leucémicos ya que en ella se encuentran los genes ATM (cell prolymphocytic leukemia), PLZF (leukemia acute, promyelocytic; PLZF/RARA type), y MLL (leukemia, myeloid/lymphoid or mixed-lineage). Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que los componentes del tabaco, al atravesar la placenta, podría estar asociada a la aparición de procesos oncohematológicos pediátricos. Sin embargo, se requieren estudios epidemiológicos para determinar si, efectivamente, la descendencia de progenitores fumadores tiene incrementado el riesgo de padecer cáncer pediátrico. / Context: Tobacco increases the risk of systemic diseases, cancer, chronic obstructive pulmonary disease and it has adverse effects on pregnancy. Maternal smoking during pregnancy has many consequences both during an after pregnancy, such as infertility, coagulation problems, obstetric accidents such an extrauterine pregnancy or placenta previa and intrauterine growth retardation. A relationship between postnatal exposure to tobacco and childhood cancer, especially leukemia and lymphomas, has also been suggested. Tobacco contains a high number of mutagenic compounds. Recently , the presence of tobacco-specific metabolites has been described in fetal blood an cell-free amniotic fluid (transferred from the mother via placenta) and in newborns from women who smoke, suggesting a possible genotóxico effect of smoking during pregnancy However, only indirect data have been published on a possible genotoxic effect on pregnancy in humans. Objetives: In this study we assess the possible genotóxico effect of maternal smoking on amniotic fluid cells, based on the presence of an increased chromosomal instability expressed as chromosomal lesions (gaps and breaks) and structural chromosomal abnormalities. We also analyze whether any chromosomal regions are especially affected by exposure to tobacco in the fetus.Desing, Setting and Patients: In this prospective study, amniocytes were obtained by routine amniocentesis for prenatal diagnosis from 25 control and 25 women who smoke (>10 cigarettes/day for >10 years), who were asked to fill out the smoking questionnaire concerning their smoking habits. In total, 800 interviews were carried out. Four hundred ninety-six interviews were required to find the 25 nonsmokers who fulfilled the strict criteria set up in our protocol; 175 interviews were required to find the 25 mothers who had smoked 10 or more cigarettes daily for at least 10 years and who continued smoking during pregnancy. Cytogenetic evaluation was performed according to standard procedures. Only high-quality metaphases were analyzed in each case. (About 100 randomly selected metaphases uniformly stained). Later preparations were destained with methanol and incubated in 2xSSc, and stained with Wright-Giemsa stain to identify the bands where the lesions were located . To characterize structural chromosomal abnormalities at least 25 banded metaphases per patient were karyotyped .Breakpoints implicated in chromosome abnormalities were identified by G-banding.Results: Comparison of cytogenetic data between smoker (S) and control (C) groups, using the generalized estimating equation (GEE) method, showed statistical significance for (i) the proportion of metaphases with chromosome instability (S: 10.5% (262/2492); C: 8.0% (210/2637); P=0.0357), (ii) the proportion of chromosome lesions (S: 15.7% (391/2492); C: 10.1% (267/2637); P=0.0450), and (iii) the proportion of structural chromosome abnormalities (S: 12.1% (96/793); C: 3.5% (26/752); P=0.0015). Statistical analysis of the 689 breakpoints detected showed that band 11q23, which is a band commonly implicated in hematopoietic malignancies, was the chromosome region most affected by tobacco. Conclusions: Our findings show that smoking more than 10 cigarettes/day for at least 10 years and during pregnancy is associated with increased chromosome instability in amniocytes. Band 11q23, known to be involved in leukemogenesis, seems especially sensitive to genotoxic compounds contained in tobacco. This band contains the genes ATM (cell prolymphocytic leukemia), PLZF (leukemia acute, promyelocytic; PLZF/RARA type), and MLL (leukemia, myeloid/lymphoid or mixed-lineage). Thus, the transplacental exposure to tobacco could be associated with an increased risk of pediatric hematopoietic malignancies. Epidemiologic studies will be needed to determine whether the offspring of parents who smoke have an increased lifetime risk of cancer.

Una de les causes importants que s'associen a l'aparició de defectes congènits, retard mental i malformacions congènites, són les anomalies cromosòmiques. Les conseqüències fenotípiques depenen no tan sols de la grandària de fragment perdut, o guanyat, sinó dels gens que contenen. Per aquesta raó es importantissim determinar la regió cromosòmica implicada en l'alteració. Va esser a partir de l'any 1970, amb la introducció de les tècniques de bandeig cromosòmic, quant es van caracteritzar un gran nombre d'anomalies cromosòmiques. Els darrers anys s'ha produït un important avanç en la citogenètica amb la introducció de tècniques moleculars, com la FISH, CGH, MLPA entre d'altres, ja que permeten establir correlacions, molt més acurades, entre el fenotip i el genotip. L'objectiu principal d'aquest treball ha estat caracteritzar les anomalies cromosòmiques presents en individus amb malformacions congènites o infertilitat, mitjançant tècniques de citogenètica convencional i molecular. A més de comparar l'eficiència de les diferents tècniques emprades, valorar-ne les avantatges i limitacions. Per tal d'assolir aquest objectiu s'han estudiat 123 pacients, que presentaven malformacions congènites o infertilitat, mitjançant diferents tècniques de citogenètica convencional i moleculars com la CGH, HR-CGH, array-CGH, M-FISH, cenM-FISH, subcenM-FISH, BACs i MLPA.S'ha analitzat el tipus i freqüència d'alteracions cromosòmiques presents en aquests pacients. S'han caracteritzat: 26 monosomies parcials autosòmiques, 29 trisomies parcials autosòmiques, 9 monosomies parcials gonosòmiques, 6 trisomies parcials gonosòmiques, 4 reorganitzacions cromosòmiques complexes i 21 cromosomes marcadors supernumeraris petits. La identificació exacta d'aquestes anomalies cromosòmiques ens ha permès establir noves correlacions genotip-fenotip no descrites anteriorment a la bibliografia. Per últim, l'anàlisi de 116 punts de trencament implicats en aquestes anomalies cromosòmiques mostra que la distribució en l'ideograma humà no és a l'atzar, ja que la majoria d'ells es localitzen en les bandes-G-clares (62,2%), en regions del genoma riques en duplicacions segmentàries (81,9%) i no coincideixen amb bandes on s'ubiquen llocs fràgils (75%). També s'ha observat que les bandes cromosòmiques especialment afectades han estat la 11q23, 15q11.1, 15q26, Xp22.3 i Yq11.2. / Chromosomal abnormalities have been described as an important cause of congenital defects such as mental retardation and congenital malformations. Phenotipical consequences depend not only on size implied in the imbalance, also on genes located at this region. For this reason it is very important to determine chromosomal fragment implied in the alteration. Since 1970, when chromosomal banding techniques were described, a high number of chromosomal abnormalities have been characterised. In last years, cytogenetics have been improved with the introduction of molecular techniques, such as FISH, CGH, MLPA and others, since they allow more accurate genotype-phenotype correlations. The main aim of this work has been to characterise chromosomal abnormalities present in individuals with congenital malformations, or infertility, with conventional and molecular cytogenetic techniques. We established the advantages and disadvantages of the techniques and compared the efficiency. In order to achieve the main aim, we studied 123 patients with congenital malformations or infertility, with conventional and molecular cytogenetic techniques (CGH, HR-CGH, array CGH, M-FISH, cenM-FISH, BACs and MLPA). We analised the frequency and sort of chromosomal abnormalities in these patients. We could characterise: 26 parcial autosomic monosomies, 29 parcial autosomic trisomies, 9 partial gonosomic monosomies, 6 partial gonosomic trisomies, 4 complex chromosomal reorganisations and 21 small supernumerary marker chromosomes. The exact identification of these chromosomal abnormalities has allowed establishing new genotype-phenotype correlations not previously described in the literature. Finally, analysis of the 116 breakpoints implied in these chromosomal abnormalities show that their distribution is not random. The majority are localised in light G-Bands (62,2%), in bands with segmental duplications (81,9%) and there is no coincidence with fragile sites (75%). The higher rate breakpoints were located at 11q23, 15q11.1, 15q26, Xp22.3 and Yq11.2.

No description available.

Avui dia encara són moltes les persones que consulten els Serveis de Genètica Clínica per presentar malformacions congènites i/o retard mental. En aquests casos, cal establir un bon diagnòstic genètic així com realitzar una bona exploració clínica, ja que la comparació dels trets presents en pacients amb alteracions cromosòmiques idèntiques o similars permetrà detectar les anomalies clíniques comunes i, per tant, establir les correlacions genotip-fenotip. En aquest treball s'han analitzat 145 mostres de pacients que presentaven malformacions congènites i/o retard mental i infertilitat i amb un cariotip normal o anormal sense acabar de ser caracteritzat per citogenètica convencional. Les 145 mostres s'han dividit en cinc grups: GRUP A: 90 pacients amb cariotip normal i quadre clínic; GRUP B: 8 barons 46,XX; GRUP C: 10 pacients portadors d'anomalies cromosòmiques "aparentment" equilibrades; GRUP D: 18 pacients amb monosomies o trisomies parcials i el GRUP E: 19 pacients amb cromosomes marcador.S'han aplicat tècniques d'extracció d'ADN, de cultiu cel·lular, i d'obtenció d'extensions metafàsiques per analitzar les mostres. Amb l'ADN extret, s'han aplicat les tècniques de MLPA (P036B, P070, P106-B1), de CGH/HR-CGH (Nick translation kit) i d'aCGH (qChip Post de 60000 clons i xip de 19000 clons). A partir de les extensions metafàsiques, s'han aplicat diferents tècniques de FISH: locus específica, pintat cromosòmic, sondes de cromosomes artificials de bactèries, multipintat, multicolor centromèrica i de bandeig multicolor.L'aplicació d'una bateria de tècniques de citogenètica molecular ha permès confirmar la presència d'anomalies cromosòmiques al 7.8 % dels pacients del grup A i s'ha proposat un protocol d'actuació en un laboratori de diagnòstic clínic per aquest tipus de pacients. Respecte al grup B, s'ha evidenciat l'existència d'heterogeneïtat de material corresponent a la regió pseudoautosòmica XPAR1 que podria contribuir a la variabilitat fenotípica que presenten els barons 46,XX,SRY+. Pel que fa als resultats obtinguts al grup C, s'ha caracteritzat amb més precisió l'anomalia cromosòmica al 55% dels casos. L'estudi del grup D ha permès caracteritzar l'origen cromosòmic implicat en les diferents anomalies en tots els casos. A més, s'ha confirmat l'anomalia detectada per CGH/HR-CGH al 78 % dels casos i la FISH amb sondes BAC ha permès redefinir els punts de trencament implicats en l'anomalia cromosòmica en tots els casos en què ha estat aplicada. Finalment, respecte al grup E, la combinació de diferents tècniques de citogenètica molecular ha permès una identificació de l'origen del sSMC al 94.7% dels pacients. S'ha proposat també un protocol d'actuació en un laboratori de diagnòstic clínic i s'ha vist que l'origen cromosòmic més comú del marcador ha estat el cromosoma 15 (10 casos), seguit del cromosoma 8 (3 casos), 13/21 ó 14/22 (2 casos) i dels cromosomes 2 , 7 , 9 i 22 (1 cas).Paral·lelament, l'anàlisi dels punts de trencament implicats en les diferents anomalies cromosòmiques estudiades , ha revelat que la seva distribució al genoma no és a l'atzar, ja que la majoria es localitzen en les bandes clares (un 61%), que corresponen a regions amb major densitat gènica. També, que majoritàriament els punts de trencament coincideixen amb bandes riques en duplicacions segmentàries (DSs) i en regions on s'han descrit variacions en el número de còpies (CNVs) (un 83% i un 94% respectivament). A més a més, cap de les regions CNVs implicades als casos que presentaven un fenotip normal havia estat associada a alguna síndrome clínica a la literatura, mentre que entre el 18% i el 25% de les regions CNVs implicades en els punts de trencament dels pacients amb anomalies cromosòmiques i fenotip alterat, sí que havien estat associades a síndromes clíniques segons la literatura. / Nowadays there are many people who consult The Genetic Clinical Services because of congenital malformations and/or mental retardation. In these cases, it is essential to make a proper genetic diagnosis as well as a good clinical exploration in order to establish accurate genotype-phenotype associations.145 samples from patients presenting congenital malformations and/or mental retardation and infertility with a normal or an abnormal karyotype have been studied in this work. These samples have been classified in 5 different groups. Group A: 90 patients with a normal karyotype and clinical manifestations; Group B: 8 46,XX males; Group C: 10 patients with apparently balanced chromosomal abnormalities; Group D: 18 patients with partial monosomies or trisomies and Group E: 19 carriers of supernumerary marker chromosomes (sSMC).DNA extraction protocols, cell culture and metaphase spreads have been applied in order to analyze all these samples. MLPA (P036B, P070, P106-B1 kits), CGH/HR-CGH (Nick translation kit) and/or aCGH (qChip Post of 60000 clones and a chip of 19000 clones) techniques were applied from extracted DNA. To confirm these results, different FISH techniques (MFISH, cenMFISH and subcenMFISH) have been used over metaphase spreads.The use of a variety of molecular cytogenetic techniques has allowed the identification and confirmation of chromosomal anomalies in 7.8% of the patients from group A. Besides, a protocol of proceedings has been suggested to use in private clinical laboratories in such cases. In reference to group B, this battery has shown that the pseudoautosomal region XPAR1 can be very heterogeneous in these patients, and this heterogeneity might contribute to the phenotypic variability of 46,XX,SRY+ males. Referring to group C, a more accurate identification of the chromosomal anomaly has been obtained in 55% of cases. The study of patients from group D has allowed the identification of the chromosomal origin of the anomaly in all the cases. The CGH/HR-CGH results have been confirmed in 78% of these patients. Besides, FISH with BAC probes has demonstrated to be a very useful tool in order to identify the break points involved in all the chromosomal anomalies analyzed. Finally, in reference to group E, this battery of techniques has allowed the identification of the origin of SMC in 94.7% of cases. Another protocol of proceedings has been suggested to use in private clinical laboratories in such cases. The marker chromosomes more frequently analyzed in this work derived from chromosomes 15 (10 cases), 8 (3 cases), 13/21 or 14/22 (2 cases) and 2, 7, 9 and 22 (1 case each).On the other side, the analysis of all the break points involved in the chromosomal anomalies studied in this series of patients has revealed that their distribution along the human genome is not random, since the 61% were located in white bands, which are gene-rich. Besides, they do also tend to locate in DSs-rich bands and in regions where CNVs have been described (83% and 94% respectively). Furthermore, none of the CNVs involved in phenotypic normal cases had been described as pathogenic previously , whereas over the 18%-25% of the CNVs identified at the break points in patients with an abnormal phenotype had been associated with clinical syndromes according to the literature.

La descripció i explicació de la variació genètica dins i entre poblacions, l’objectiu de la genètica de poblacions des del seu origen, s’ha vist frenat durant dècades degut a la impossibilitat tècnica de mesurar directament la variació genètica de les poblacions. La present era genòmica, amb el creixement explosiu de genomes sequenciats alimentat per les tecnologies de seqüenciació de nova generació, han obert el camí a la present època daurada de l’estudi de la variació genètica a escala genòmica. La genètica de poblacions ja no és una ciència amb mancances empíriques, si no que és més que mai un camp de recerca on les eines bioinformàtiques per mineria de dades i gestió de grans volums de dades, models estadístics i evolutius, i noves tècniques moleculars de generació de seqüències, queden totes integrades en una empresa interdisciplinària. Com a conseqüència d’aquest avenç, una nova disciplina ‘òmica’ ha aparegut: La Genòmica de Poblacions. Però, què és la Genòmica de Poblacions? Segons Charlesworth (2010), simplement és “un nou terme per un camp d’estudi tant antic com la pròpia Genètica”. Es tracta de “l’antic camp” de la Genètica de Poblacions, quan l’estudi de la quantitat i les causes de la variabilitat natural a les poblacions és fa des d’una prespectiva genòmica. Aquesta tesis és tant un estudi de genòmica de poblacions com un projecte bioinformàtic centrat en la visualització, descripció i anàlisis de la variació del DNA a tot el genoma, a partir de dades d’una població natural de l’organisme model Drosophila melanogaster. Les dades utilitzades s’han obtingut a la iniciativa internacional Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP) (Mackay et al. 2012). El DGRP ja seqüenciat els genomes complets de 158 (primera fase) i 205 (segona fase) línies consanguínies de D. melanogaster provinents d’una població natural a Raleigh (Estats Units). Un dels objectius principals del projecte va ser la creació d’un recurs de dades del polimorfisme genètic per a realitzar anàlisis de genòmica de poblacions. Les dades de seqüències del DGRP ens ha permès ralitzar un complet estudi de la variació a nivell genòmic a una població natural de D. melanogaster. Després de desenvolupar un complert accessible mapa públic del polimorfisme present en aquesta població, hem descrit els patrons de polimorfisme i divergència (tant de variants nucleotídiques com d’insercions i delecions, índels) al llarg dels braços cromosòmics. Observem un patró clar i consistent de diversitat genòmica al llarg dels autosomes tant per SNPs (varició d’un sol nucleótid) i índels: la diversitat es veu reduïda a les zones centromèriques en comparació a les no centromèriques, i també als telòmers. Aquest patró no s’observa al cromosoma X, on la diversitat és gairebé uniforme al llarg del cromosoma. Polimorfisme i recombinació es troben correlacionats al llarg dels braços cromosomis, però només en aquelles regions amb taxa de recombinació per sota 2cM Mb-1. La taxa de recombinació sembla ser la força principal responsable de donar forma als patrons de polimorfisme als cromosomes i el seu efecte sembla estar mediat pel seu impacte a la selecció lligada. Hem mapejat la petjada de la selecció natural a SNPs i índels a tot el genoma, observant una acció arreu de la selecció natural, tant per selecció adaptativa com purificadora. La selecció adaptativa actua preferentment a zones no centromèriques. La selecció natural actua diferent a insercions i delecions, sent les delecions seleccionades més intensament en contra per la selecció purificadora, fet que suporta la teoria de l’equilibri mutacional per a l’evolució de la mida del genoma. / The description and explanation of genetic variation within and between populations, the goal of population genetics since its origins, has been hampered by decades because of the technical inability to directly measure the genetic variation of populations. The present genome era, with the explosive growth of genome sequences fueled by the next-generation sequencing technologies, has lead us to the present golden age of the study of genetic variation at the genome scale. Population genetics is no longer an empirically insufficient science, but it is more than ever a research field where bioinformatics tools for data mining and management of large-scale dataset, statistical and evolutionary models, and advanced molecular techniques of mass generation of sequences are all them integrated in an interdisciplinary endeavor. As a consequence of this breakthrough, a new ‘omic’ discipline has emerged: Population Genomics. But, what is Population Genomics? For Charlesworth (2010), it's simply "a new term for a field of study as old as Genetics itself". It's the 'old field' of Population Genetics when studying the amount and causes of variability in natural populations in a genome-wide fashion. This thesis is both a population genomics study and a bioinformatics project centred on the visualization, description and analysis of the genome-wide DNA variation data from a natural population of model organism Drosophila melanogaster. The data used has been obtained by the international initiative The Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP) (Mackay et al. 2012). DGRP has sequenced the complete genomes of 158 (freeze 1) and 205 (freeze 2) inbred lines of Drosophila melanogaster from a single natural population of Raleigh (USA). A major goal of this project was to create a resource of common genetic polymorphism data to further perform population genomics analyses. The DGRP sequence data has allowed us to carry out a thorough study of genome-wide variation in a natural population of D. melanogaster. After developing a complete, public and accessible map of the polymorphism present in this population, we have described the patterns of polymorphism and divergence (nucleotide and indel variants) along chromosome arms. We observe a clear and consistent pattern of genome diversity along arms of the autosomic chromosomes both for SNP and indels: diversity is reduced on average in centromeric regions relative to non-centromeric regions, and at the telomeres. This pattern is not observed in the X chromosome, where diversity is almost uniform all along the chromosome. Polymorphism and recombination are correlated along chromosome arms, but only for those regions where recombination rate is below 2cM Mb-1. Recombination rate seems to be the major force shaping the patterns of polymorphism along chromosome arms and its effect seems to be mediated by its impact on linked selection. We have mapped the footprint of natural selection on SNP and indel variants throughout the genome, observing a pervasive action of natural selection, both adaptive and purifying selection. Adaptive selection occurs preferentially in non-centromeric regions. Natural selection acts differently between insertions and deletions, being deletions more strongly selected by purifying selection, which supports the mutational equilibrium theory for genome size evolution.

Els individus portadors de translocacions cromosòmiques equilibrades presenten un risc incrementat de produir gàmetes amb anomalies cromosòmiques, ja sigui per una segregació desequilibrada dels cromosomes reorganitzats o per la formació d’anomalies numèriques derivades de l’efecte intercromosòmic. Es desconeix si existeix una relació entre les anomalies derivades d’ambdós esdeveniments, que podria residir en l’aparició de fenòmens d’heterosinapsi entre els multivalents i altres cromosomes durant la profase I. D’altra banda, l’heterosinapsi s’ha relacionat amb canvis en l’arquitectura nuclear dels cromosomes en espermatozoides, que en última instància també podrien afectar la fertilitat dels individus portadors. Els objectius d’aquesta tesi han estat: i) Desenvolupar un mètode d’anàlisi seqüencial basat en tècniques d’hibridació in situ fluorescent (FISH) que permeti identificar anomalies cromosòmiques numèriques i determinar el mode de segregació dels cromosomes reorganitzats sobre els mateixos espermatozoides; ii) Caracteritzar els patrons de segregació de diferents reorganitzacions cromosòmiques en espermatozoides no seleccionats i en espermatozoides portadors d’anomalies numèriques; iii) Determinar si existeix una relació entre els diferents modes de segregació dels cromosomes reorganitzats i la producció d’espermatozoides amb anomalies numèriques; iv) Desenvolupar una tècnica d’anàlisi que permeti valorar la disposició tridimensional dels territoris cromosòmics en nuclis d’espermatozoides. S’han recollit mostres de semen de vuit individus portadors de translocacions recíproques, onze portadors de translocacions Robertsonianes i un portador d’una triple translocació. En la primera ronda de FISH seqüencial s’han detectat espermatozoides amb anomalies numèriques per cinc cromosomes no relacionats amb la reorganització. En la segona ronda s’han analitzat els productes de segregació dels cromosomes reorganitzats en els espermatozoides amb anomalies numèriques detectats prèviament, així com en espermatozoides no seleccionats. L’optimització del sistema d’anàlisi de la disposició dels territoris cromosòmics en el nucli espermàtic ha inclòs la selecció de nuclis segons el seu genotip, la captura d’imatges tridimensionals, la relocalització dels nuclis d’interès, el tractament digital de les imatges, la normalització de les dades i l’obtenció dels valors de posicionament dels centròmers en l’eix longitudinal i radial de l’espermatozoide. Els resultats de l’anàlisi de segregació en espermatozoides no seleccionats mostren una elevada homogeneïtat dels patrons de segregació entre portadors del mateix tipus de translocació, caracteritzats per una elevada freqüència dels modes de segregacions que impliquen la disjunció a pols cel·lulars oposats dels cromosomes amb centròmers homòlegs. Els resultats de segregació en espermatozoides aneuploides i diploides/múltiples disòmics mostren un patró de segregació alterat respecte els espermatozoides no seleccionats, on s’afavoreixen els modes de segregació desequilibrats, en detriment dels productes de segregació equilibrats. Els espermatozoides amb diferents tipus d’aneuploïdies i amb diferents cromosomes implicats, influeixen per igual al patró de segregació alterat. Els resultats sobre el posicionament tridimensional dels cromosomes han permès validar la metodologia desenvolupada, ja que s’ha obtingut informació sobre la localització preferent dels cromosomes estudiats en nuclis amb diferents genotips. Els resultats obtinguts demostren una associació entre la presència d’anomalies numèriques i un contingut desequilibrat dels cromosomes reorganitzats. L’acumulació d’anomalies cromosòmiques en els mateixos gàmetes pot ser atribuïble a un efecte bidireccional de l’heterosinapsi, que comportaria un canvi en la localització nuclear dels cromosomes afectats i una alteració en la formació dels quiasmes. Els problemes d’orientació dels cromosomes a la placa metafàsica poden provocar una aturada meiòtica prolongada, que en cas de no corregir-se, es podria resoldre a través de l’evasió del punt de control. Aquest fet afavoriria la producció de gàmetes que podrien acumular anomalies procedents de segregacions desequilibrades, a més d’aneuploïdies d’altres cromosomes. La tècnica desenvolupada per estudiar l’arquitectura nuclear dels espermatozoides permetrà determinar si les anomalies cromosòmiques presents en els gàmetes dels individus portadors de reorganitzacions cromosòmiques afecten l’organització nuclear global dels cromosomes i condicionen la seva fertilitat. / Carriers of chromosomal translocations present a high risk of producing chromosomally abnormal gametes, as a consequence of an unbalanced segregation of the rearranged chromosomes, or the presence of numerical chromosomal anomalies derived from an interchromosomal effect. It is not known whether there exists a relationship between anomalies produced by these two events, but it might be based on the occurrence of heterosynapsis at the meiotic prophase I between multivalents and other chromosomes. Moreover, heterosynapsis has been associated related to changes in the nuclear chromosome architecture in sperm, which may also affect the fertility of reorganization carriers. The objectives of this thesis have been: i) To develop a sequential fluorescence in situ hybridization (FISH) protocol in order to detect numerical chromosomal abnormalities and to establish the segregation mode of rearranged chromosomes in the same spermatozoa; ii) To establish the segregation pattern of different chromosomal rearrangements in random sperm and in sperm with numerical abnormalities; iii) To determine whether there exists a relationship between certain segregation modes and the occurrence of numerical chromosome abnormalities; iv) To develop a methodology to evaluate the tridimensional distribution of chromosome territories in sperm nuclei. Semen samples of eight carriers of reciprocal translocations, eleven carriers of Robertsonian translocations and one carrier of a three-way translocation have been included in the study. In the first sequential FISH round, numerical anomalies for five chromosomes unrelated to the rearrangements have been analysed. In the second round, a segregation analysis has been performed both in the numerically abnormal sperm detected in the first round as well as in randomly assessed sperm. The optimization of the analysis of chromosome territories in sperm nuclei has included: nuclei classification according to their genotype, 3D image recording, relocalization of selected nuclei, digital images editing, data normalization, and prediction of the preferred position of each hybridization signal along the longitudinal and radial axis of spermatozoa. The segregation patterns obtained in randomly assessed sperm show high homogeneity among carriers of the same translocation. These patterns involve high frequencies of segregation modes that entail disjunction to opposite cellular poles of chromosomes with homologous centromeres. Data obtained from segregation analysis in aneuploid and diploid/multiple disomic sperm show altered segregation patterns when compared to randomly assessed sperm, in which unbalanced segregation modes are favoured while balanced segregation products decrease. Aneuploid sperm with different types of chromosomal abnormalities or different chromosomes involved in the aneuploidy have the same effect over the altered segregation pattern. The results obtained in the analysis of chromosome territories allow for the validation of the developed methodology. It has allowed the prediction of the preferred positioning of analysed chromosomes in sperm nuclei with different genotypes. In conclusion, data obtained point out that indeed there exists a relationship between the presence of numerical chromosome abnormalities and an unbalanced segregation content in sperm. This accumulation of chromosome anomalies in the same gametes would be driven by a bidirectional effect of heterosynapsis, which could entail changes in the nuclear positioning of the affected chromosomes, as well as alterations in chiasmata formation. The chromosome misalignment at metaphase plate would cause a meiotic arrest. If unresolved, cells could eventually evade this checkpoint favouring the accumulation of both unbalanced segregation products and aneuploidies for other chromosomes in the same gametes. The developed methodology to study the sperm nuclear architecture can be potentially used in carriers of chromosomal rearrangements, in order to assess whether chromosomal abnormalities in sperm affect the global nuclear chromosome organization and disturb their fertility.

L’arsènic inorgànic es presenta com un carcinogen molt ben establert en humans. Milions de persones es troben exposades arreu del món, fonamentalment a través de l’aigua de consum contaminada per aquest compost. Encara que existeixen múltiples mecanismes d’acció pels quals l’arsènic pot exercir els seus efectes carcinògens, la generació de dany oxidatiu en el DNA a partir de les espècies reactives d'oxigen derivades de la seva biotransformació es presenta com un dels mecanismes importants a l’hora d’explicar l’aparició dels fenòmens tumorals associats amb la seva exposició. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta Tesi ha estat demostrar la connexió existent entre la presència de dany oxidatiu i la carcinogènesi associada a una exposició amb arsènic inorgànic. Per arribar a aquest objectiu s’ha implementat una estratègia innovadora de treball en el qual s’emulen les condicions d’exposició ambiental a les que es troben exposades les poblacions humanes. Concretament, aquesta estratègia es basa a desenvolupar un model d’exposició crònica in vitro a dosis subtòxiques d’arsènic inorgànic. A més, s’ha utilitzat un model cel·lular particular constituït per dues línies cel·lulars isogèniques de fibroblasts embrionaris de ratolí (MEF), una de les quals és deficient en la reparació de lesions oxidants del DNA que requereixen el mecanisme BER, exhibint un genotip knockout pel gen Ogg1, un dels gens principals de l’esmentada ruta de reparació del DNA. Al llarg d’aquest període d’exposició crònica a dosis de 0,5, 1 i 2 µM d’arsenit sòdic, es van avaluar diferents paràmetres en ambdues línies cel·lulars, els valors dels quals van ser comparats amb els corresponents controls temporals. Dits paràmetres mesuren els nivells acumulats de dany oxidatiu (8-OH-dG), la capacitat de reparar el dany en el DNA, l’estudi de possibles mecanismes d’adaptació i, finalment, l’adquisició d’un fenotip tumoral in vitro en ambdues línies cel·lulars al llarg d’un procés d’exposició arsenit sòdic del voltant 40 setmanes. Els resultats obtinguts donen suport a la hipòtesi reflectida en l’objectiu principal. Així, les línies cel·lulars Ogg1 deficients (MEF Ogg1 -/-) crònicament exposades a l’arsènic mostren una acumulació progressiva de dany oxidatiu en el DNA, mentre que l’increment d’aquest dany no es detecta en la línia salvatge. Paral·lelament, l’eficiència dels mecanismes de reparació del dany induït en el DNA es veu afectada en ambdues línies cel·lulars, manifestant-se així l’activitat cocarcinògena de l’arsènic. Pel que fa referència a l’adquisició del fenotip tumoral, trobem que l’arsènic és capaç d’induir un fenotip tumoral de manera primerenca en la línia deficient, el que indicaria que el dany oxidatiu en el DNA juga un paper fonamental en la carcinogènesi associada a l’exposició. Així, les cèl·lules Ogg1 -/- manifesten un fenotip tumoral al cap de 30 setmanes d’exposició, caracteritzat per canvis morfològics, un increment en proliferació cel·lular, el descontrol en estat de diferenciació, l’ increment en la secreció de metal·loproteïnases de la matriu extracel·lular, l’adquisició de la capacitat de créixer independent d’ancoratge, i la capacitat de promoure el creixement tumoral i la invasió. A manera de conclusió, aquesta Tesi demostra, principalment i per primera vegada, que el fons genètic referent al gen OGG1 i la inducció de 8-OH-dG són factors rellevant en el procés de carcinogènesi associada a l’arsènic. Indirectament, el treball posa de manifest el risc associat dels individus amb polimorfismes al gen OGG1, fent-los més susceptibles a l’aparició dels efectes genotòxics i carcinògens derivats de l’exposició. / Inorganic arsenic is presented as a very well established human carcinogen. Millions of people around the world are exposed to this compound mainly through contaminated drinking water. Although there are multiple mechanisms of action by which arsenic may exercise their carcinogenic effects, the generation of oxidative DNA damage from reactive oxygen species derived from its biotransformation is presented as one of the most important mechanisms explaining the associated cancer phenomena. In this context, the main objective of this thesis was to demonstrate the connection between the presence of oxidative damage and carcinogenesis, linked to inorganic arsenic exposure. In order to reach this objective, we have implemented an innovative strategy plan which emulated environmental conditions in which human populations are exposed. Specifically, this strategy is based on developing an in vitro model of chronic exposure to subtoxic inorganic arsenic doses. In addition, we used a particular cell model comprising two isogenic cell lines from mouse embryonic fibroblasts (MEF), being one of them deficient in the repair of oxidative DNA lesions that require the BER mechanism, showing a knockout genotype for Ogg1, one of the major genes of this DNA repair pathway. Throughout this period, cells were exposed to 0.5, 1 and 2 µM of sodium arsenite for 40 weeks. Different parameters were evaluated in both cell lines, the values of which were compared with the corresponding time-matched controls. These parameters were the accumulated levels of oxidative damage (8-OH-dG), the ability of repairing DNA damage, the mechanisms of adaptation and, finally, the acquisition of an in vitro tumor phenotype. Results supported the main hypothesis. Thus, Ogg1 deficient cell lines chronically exposed to arsenic showed a progressive accumulation of oxidative DNA damage, whereas that increase was not detected in its wildtype counterparts. Moreover, the efficiency of DNA repair mechanisms in repairing the induced damage was affected in both cell lines, manifesting the arsenic co-carcinogen activity. Taking into account the acquisition of the tumor phenotype, we found that arsenic can induce an early tumor phenotype in the deficient Ogg1 cell line, indicating that oxidative DNA damage plays a role in carcinogenesis associated with the exposure. Thus, Ogg1 - /- cells expressed a tumor phenotype after 30 weeks of exposure, characterized by morphological changes, an increase in cell proliferation, the lack of a correct differentiation status, the increase in secretion of extracellular matrix metalloproteinases, the acquirsition of the ability to grow independent of anchor, and the acquisition of the ability to promote tumor growth and invasion. In conclusion, this thesis shows for the first time that the genetic background of the reference gene OGG1 and the induction of 8-OH-dG are key factors in the arsenic-associated carcinogenesis. Indirectly, the work highlights the associated risk of individuals carrying OGG1 gene polymorphisms, as they are expected to be more susceptible to the genotoxic and carcinogenic effects of the exposure.

Williams-Beuren syndrome is a neurocognitive disorder with multisystemic manifestations of variable expressivity caused by a 1.55-1.83 Mb at chromosomal band 7q11.23. In this thesis project we have characterized the 7q11.23 deletion to refine the breakpoint location of the deletion, identify hospots and search for putative cis and trans-acting mechanisms involved. We have also characterized novel and previously reported metabolic alterations in a cohort of patients and explored its association with putative candidate genes using different mouse models and gene association analyses. Finally, we have increased the knowledge of cardiovascular disease by analyzing a complete and detailed database; as well as specific diagnostic procedures, including echocardiogram and ambulatory blood pressure monitoring. Hypertensive patients were treated with losartan with a reevaluation at 12 months after treatment. We have explored clinical-molecular associations with the cardiovascular phenotype, including an association analysis with possible genetic modifying factors / El síndrome de Williams-Beuren es un trastorno del neurodesarrollo causado por una deleción de 1.55-1.83 en la banda cromosómica 7q11.23. El síndrome de Williams-Beuren se caracteriza por manifestaciones multisistémicas de expresividad variable. En este proyecto de tesis hemos caracterizado la deleción 7q11.23 para determinar el punto de quiebre de la deleción, identificado puntos calientes y buscado posibles factores en cis y trans que puedan influir en la recombinación. Hemos descrito alteraciones metabólicas, previamente reportadas y nuevas, en una cohorte de pacientes y buscado su asociación con posibles genes candidatos mediante el uso de modelos murinos y estudios de asociación. Finalmente hemos descrito en mayor detalle el fenotipo cardiovascular mediante el análisis de una base de datos completa y detallada, así como el estudio de algunas herramientas diagnósticas incluyendo ecocardiograma y monitorización ambulatoria de la tensión arterial. Pacientes hipertensos fueron tratados con losartán y reevaluados un año después. Hemos explorado las correlaciones clínico-molecular del fenotipo cardiovascular e incluido estudios de asociación con posibles genes modificadores del fenotipo.