La integridad del DNA es un aspecto fundamental para la salud y el buen funcionamiento de nuestro organismo. Sin embargo, sabemos que el material genético es susceptible de ser dañado por numerosos agentes y/o procesos. Aunque la mayoría del daño que se produce en nuestro material genético es separado eficientemente, parte de él escapa a este proceso constituyendo uno de los sustratos para el potencial desarrollo de un proceso carcinogénico. En los últimos años, se han desarrollado con éxito nuevas metodologías capaces de evaluar el daño en el DNA, diseñándose técnicas que permiten medir directamente roturas de cadena simple (SSB) y de doble cadena (DSB) en el DNA. Entre ellas, el ensayo del cometa se ha convertido en una de las más populares para la evaluación de este tipo de daño. Aunque el ensayo del cometa se ha propuesto como una herramienta apropiada, todavía existen muchos aspectos que deben reconsiderarse, por lo que el objetivo principal de este trabajo de Tesis fue la optimización del ensayo del cometa como biomarcador de daño en el DNA y su aplicación tanto en radiobiología, mediante la construcción de una curva de calibración, como en la biomonitorización de dos cohortes de madres e hijos de dos localidades de Barcelona. Las metodologías del ensayo del cometa que se aplican en los diferentes laboratorios son variadas pero, sin duda alguna, la versión alcalina es la más utilizada. A pH >13, la técnica resulta más sensible para la detección de niveles bajos de daño, por lo que la hemos elegido como versión estándar. Se desarrollaron numerosos experimentos con modificaciones que optimizaron el ensayo en aspectos como: el soporte utilizado, que permitió la manipulación de un elevado número de muestras en un mismo ensayo; la utilización de enzimas de reparación para la detección de daño oxidativo, y la criopreservación para el almacenamiento masivo de muestras valorables mediante el ensayo. En cuanto a las aplicaciones, la construcción de una curva de calibración resulto ser un gran aporte ya que con ella se pudo establecer el daño genético basal de una población, en términos de roturas/109 Da de DNA. Además, se ha puesto de manifiesto que la radiosensibilidad individual puede ser medida con el ensayo de cometa, lo que respalda a la técnica como un buen indicador de inestabilidad genómica individual. Finalmente, en el área de la biomonitorización humana, se encontró una fuerte correlación, tanto en el daño basal como oxidativo, entre madres e hijos; aunque, no se pudo establecer fehacientemente una influencia significativa de ninguno de los factores de confusión considerados. Esto pone en evidencia los problemas asociados con la reciente inclusión del ensayo del cometa en los estudios de biomonitorización, por lo que surge la necesidad de desarrollar estudios específicos que tengan como objetivo principal la determinación de aquellos factores que puedan incidir significativamente en los niveles de daño en el DNA de poblaciones humanas. / The DNA integrity is a fundamental aspect for human health and for the suitable functions of our organism. However, the genetic material is susceptible to be damaged by many agents and processes. Although the majority of damage induced in our genetic material is repaired efficiently, a part of this damage escapes from this process and becomes one of the substrates for the potential development of a carcinogenic process. During the last years new methodologies have been developed to assess the DNA damage by performing techniques which allow to measure single strand breaks (SSB) and double strand breaks (DSB) directly. The comet assay has become one of the most popular approaches to evaluate this type of damage. Although this technique has been proposed as an appropriate tool, many aspects must be still reconsidered. For this reason, the aim of this Thesis was to contribute to the optimization of the comet assay as a biomarker of DNA damage and its application in radiology, by means of the construction of a calibration curve and, also, biomonitoring of two cohorts composed by mothers and newborns recruited from two hospitals of the Barcelona province.The methodologies of the comet assay, which are applied in the different laboratories, are variable but, with no doubt, the alkaline version is the most used. This technique is more sensitive to detect lower levels of damage at pH>13. For this reason, we have chosen it as the standard version to be used in our study. We have developed numerous experiments with modifications which have optimized the assay in three aspects: the type of support utilized, which allows the manipulation of many samples in the same experiment; the use of repair enzymes in order to detect the oxidative damage; and the cryopreservation to keep many samples which can be properly evaluated in the assay.As regards the applications, the construction of a calibration curve was an important contribution because, with its use we have been able to establish the basal genetic damage of the population, in terms of breaks /109 Da DNA. Moreover, it has been proposed that the individual radiosensitivity can be measured with the comet assay. This supportsthat this technique is a satisfactory indicator of individual genomic instability.Finally, in the area of human biomonitoring, we have found a strong correlation for both the DNA basal damage and oxidative damage between mothers and children; but we couldn't clearly establish a significant influence of any of the confusion factors that has been considered in this study. This evidence has revealed related problems with the recent use of comet assay in biomonitoring studies, and has resulted in the necessity to develop specific studies in order to determine these factors, which can influence significantly on the levels of DNA damage in human populations.

La insuficiencia renal crónica (IRC) es una patología que se caracteriza por la disminución de la función renal, con un filtrado glomerular (FG) menor de 60 mL/min 1,73 m2. En los pacientes con IRC existe una alta incidencia de enfermedades cardiovasculares y cáncer, que diversos autores atribuyen a una disminuida capacidad de reparación del DNA, a su disminuida capacidad antioxidante, así como a la evidente acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROS), y de productos de la glicación y lipoxidación avanzada (AGE/ALE). En este contexto los objetivos del presente estudio son, determinar si en los pacientes con IRC los niveles de daño genotóxico expresado como la frecuencia de binucleadas con micronúcleos (BNMN) en linfocitos de sangre periférica, son mayores que los obtenidos en un grupo control, así como si dichos pacientes muestran una sensibilidad especial a los efectos de la radiación ionizante. Asimismo, se pretende evaluar si dichos los parámetros se relacionan con la evolución de la patología y/o tratamiento con hemodiálisis (HD). En el presente trabajo se ha estudiado a una población total de 201 pacientes con IRC, en la que 98 se encuentran en tratamiento con HD convencional, y a una población control de 57 individuos sanos. De los pacientes en HD, 33 se muestrearon por segunda vez después de un año, para ver los efectos del tratamiento con HD. Como biomarcador de daño genómico se ha utilizado la frecuencia de micronúcleos en linfocitos de sangre periférica, siguiendo el protocolo de bloqueo de citocinesis con citocalasisna-B. Los valores de radiosensibilidad se obtuvieron después de irradiar las muestras con 0,5 Gy. El análisis estadístico se realizo con el programa SPSS 17,0; se normalizó la variable de BNMN mediante la transformación de log10, se llevo a cabo un análisis utilizando un modelo lineal general para ambos parámetros, así como regresiones lineales para evaluar la progresión de la IRC y el tiempo en HD, y se realizaron pruebas t para las comparaciones entre grupos. El nivel de significación estadística usado fue del 95%. Nuestros resultados indican que tanto la frecuencia de BNMN como la radiosensibilidad son mayores en los pacientes con IRC que en los controles. La frecuencia de BNMN (daño basal) se asocia con la progresión de la IRC, sin embargo la radiosensibilidad no. La frecuencia de BNMN disminuye en pacientes que se encuentran bajo tratamiento con HD, sin embargo la radiosensibilidad no se ve afectada por el tratamiento con HD. Por lo tanto, se concluye que los pacientes con IRC poseen inestabilidad genómica. Así, el daño genómico presente en los pacientes con IRC es el resultado de dos factores, la acumulación de agentes genotóxicos como las EROS y los AGE que se correlacionan con la evolución de la patología, y la inestabilidad genómica, que no se correlaciona con el desarrollo de la misma. / Chronic renal failure (CRF) is a disease that is characterized by the progressive loss of renal function, with a glomerular filtration rate (GFR) lower than 60 mL/min 1,73 m2. In patients with CRF there is a high incidence of cardiovascular disease and cancer, which several authors attribute to a low DNA repair capacity, low antioxidant capacity, as well as to the evident accumulation of reactive oxygen species (ROS), advanced glication and lipoxidation end products (AGE/ALE). In this context the objectives of the present study are, to determine if in the patients with CRF the levels of genomic damage expressed as binucleated cells with micronuclei frequency (BNMN) in peripheral blood lymphocytes, are higher than the levels obtained in a control group, and if these patients show a special sensitivity to the effects of ionizing radiation. Furthermore, we pretend to evaluate if these parameters are related to the evolution of the disease and/or to the treatment with hemodialysis (HD). In the present work a population of 201 patients with CRF has been studied, from which 98 are under conventional HD, as well as a control population of 57 healthy subjects. From the HD patients, 33 where sampled for a second time after one year, to evaluate the effects of the HD treatment. The genomic damage biomarker that has been used is the frequency of micronucleus in peripheral blood lymphocytes, following the cytocalasin-B cytokinesis-block protocol. Radiosensitivity values where obtained after the irradiation of the samples with 0.5 Gy. The statistical analysis was carried out with the SPSS 17.0 program; the BNMN variable was normalized by log10, an analysis was done using a general lineal model for both parameters, lineal regressions where done to evaluate if the progression of the CRF and the effects of time in HD, and the student t test was used to compare between groups. The statistical significance level used was 95 %. Our results indicate that the basal BNMN as well as the radiosensitivity are higher in CRF patients than in controls. The BNMN frequency (basal damage) is associated to the progression of CRF, however the radiosensitivity is not. The BNMN frequency is lower in patients under HD, however the radiosensitivity doesn’t seem to be affected by the HD treatment. Therefore, CRF patients have a genomic instability. Then, the genomic damage present in CRF is the result of two factors, the accumulation of genotoxic agents like the ROS or the AGE that correlate to the evolution of the disease, and the genomic instability, that doesn’t correlate with the development of the disease.

Esta Tesis Doctoral se centra en la evaluación de los niveles de daño genómico en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) y su relación con diferentes parámetros clínico-analíticos y el tratamiento sustitutivo. Se han estudiado un total de 364 pacientes de los cuales 121 sometidos a tratamiento de hemodiálisis (HD), 184 pacientes en diferentes estadios de insuficiencia renal que aún no se encuentran sometidos a terapia sustitutiva y 59 controles. Éstos pacientes constituyen una población con alta incidencia de diferentes patologías, como el cáncer y las patologías cardiovasculares que se relacionan con la inestabilidad genómica y también muestran elevados niveles de daño oxidativo, incluyendo daño en el DNA, posiblemente como consecuencia de una disminuida capacidad de reparar lesiones en el DNA. Los objetivos principales de este estudio fueron: 1) la evaluación del daño genómico en los pacientes con IRC mediante el ensayo del cometa (un ensayo con amplia aplicación en los estudios de biomonitorización de poblaciones, ensayos clínicos y en estudios de genotoxicidad). 2) la evaluación del daño oxidativo mediante el uso de enzimas de la familia de las enzimas reparadoras del DNA. 3) determinar posibles asociaciones entre los niveles de daño genómico y la evolución de la enfermedad renal. 4) comprobar cómo el tiempo en tratamiento de hemodiálisis y el cambio de la técnica de hemodiálisis influyen a los niveles de daño en el DNA. 5) comprobar la capacidad de reparar lesiones en el DNA de los pacientes sometidos a tratamiento sustitutivo, llevando a cabo un estudio de cinética de reparación. 6) estudiar la relación entre la mortalidad de los pacientes en hemodiálisis y los niveles de daño genómico. 7) identificar los factores involucrados en la génesis de la patología. En primer lugar, se evaluó el daño en el DNA de los pacientes con IRC y los controles. Posteriormente se realizó un estudio de cinética de reparación con 21 pacientes en tratamiento de HD. Los resultados de esta Tesis muestran que el daño en el DNA en los pacientes estudiados se encuentra significativamente elevado en comparación con los controles. El daño basal en el DNA aumenta con el desarrollo de la enfermedad y está negativamente relacionado con los valores del filtrado glomerular. Los niveles de daño oxidativo también se encuentran elevados en los pacientes con IRC en comparación con los controles. La elevada mortalidad en los pacientes con IRC en tratamiento de HD está relacionada con la elevada edad, con los niveles de la proteína C reactiva y con el tiempo en tratamiento sustitutivo. El tiempo en tratamiento de HD afecta a los niveles de daño en el DNA, así, los pacientes tratados por menos de un año muestran niveles de daño basal más bajos en comparación con los tratados por más de 3 años. Por otro lado el cambio de tratamiento de HD convencional a HD on-line resulta reducir significativamente el daño oxidativo, mientras que este cambio no se observa en los pacientes que han continuado sometidos a HD convencional. Las patologías presentes en la población estudiada, parecen no afectar a los niveles de daño en el DNA. Las diferencias en los niveles de daño en los pacientes en HD se deben a las diferencias en la capacidad de reparar y los pacientes con mayor tiempo en tratamiento de HD tienen mayor nivel de daño y menos capacidad de reparar. / This doctoral thesis focuses on evaluation the levels of genomic damage in patients with chronic renal failure (CRF) and its relationship with clinical and laboratory parameters and renal replacement therapy. We studied a total of 364 patients of whom 121 underwent hemodialysis (HD), 184 patients at different stages of kidney failure that are not yet subject to replacement therapy and 59 controls. These patients constitute a population with high incidence of various diseases such as cancer and cardiovascular diseases that are related to genomic instability and also show high levels of oxidative damage, including DNA damage, possibly due to a decreased ability to repair lesions in the DNA. The main objectives of this study were: 1) the assessment of genomic damage in patients with CKD using the comet assay (a test widely used in biomonitoring studies of populations, clinical trials and studies of genotoxicity). 2) the evaluation of oxidative damage using the enzymes from the family of DNA repair enzymes. 3) determine possible associations between the levels of genomic damage and renal disease progression. 4) determine how the time on hemodialysis and the change of the hemodialysis technique influence the levels of DNA damage. 5) test the ability to repair DNA damage in patients undergoing replacement therapy, conducted a study of kinetics of repair. 6) study the relationship between mortality of hemodialysis patients and the levels of genomic damage. 7) identify the factors involved in the genesis of the disease. First, we evaluated the DNA damage in patients with CRF and controls. Subsequently, a study of repair capacity with 21 patients on HD was performed. The results of this thesis show that the DNA damage in the patients studied is significantly higher compared with controls. The basal DNA damage increases with the development of the disease and is negatively related to the values of glomerular filtration rate. The levels of oxidative damage are also elevated in patients with CRF compared with controls. The high mortality in patients with CRF on HD treatment is associated with the high age, with levels of C-reactive protein and the replacement therapy. The HD treatment time affects the levels of DNA damage as well, patients treated for less than a year showed basal levels of damage lower compared with those treated for over 3 years. On the other hand, the change in treatment of conventional HD to HD on-line significantly reduces oxidative damage, while this change is not observed in patients who have continued to undergo conventional HD. The pathologies presented in the population, appear not to have an affect over the levels of DNA damage. Differences in damage levels in HD patients are due to differences in the ability to repair and patients with more time on treatment of HD have higher levels of damage and reduced repair capacity.

La exposición a xenobióticos durante el período prenatal puede tener implicaciones importantes sobre la salud del recién nacido, incidiendo en lo que puede ocurrir más adelante en su vida a nivel de ciertas enfermedades como asma, alérgias, retraso en el desarrollo neurológico, diabetes, enfermedades cardiovasculares y cáncer, entre otras. Por lo tanto, es necesario dotarnos de buenas herramientas para llevar a cabo análisis sistemáticos sobre el riesgo potencial en los niños, como consecuencia de estas exposiciones vía materna. El uso de biomarcadores de efecto genotóxico, evidencía los efectos tempranos de una sustancia tóxica sobre el material genético, siendo éste el primer paso de un variado conjunto de alteraciones de la salud. En nuestro estudio de biomonitorización, hemos utilizado el ensayo del cometa como biomarcador específico que nos permite evaluar los niveles de daño genético basal y oxidativo, así como la capacidad de reparación del DNA. Esto lo hemos podido aplicar a una población conformada por 200 parejas madres-hijos que fue reclutada entre Octubre de 2008 y Marzo de 2010 en el Hospital del Mar de Barcelona. Dado que los efectos de las exposiciones endógenas/exógenas a agentes genotóxicos, pueden verse modulados por la nutrición durante la fase de embarazo, en nuestro trabajo se han utilizado los patrones dietéticos de las madres durante el embarazo para evaluar los alimentos ingeridos en la dieta, y estimar su posible papel modulador. Además, hemos considerado a la dieta como un vehículo para ingerir distintos contaminantes ambientales con potencialidad genotóxica. Los resultados indican que los niveles del daño genético basal, los niveles de oxidación del DNA (purinas y pirimidinas oxidadas), al igual que la capacidad de reparación detectada en los linfocitos de cordón umbilical de los hijos, se encuentran correlacionados con los niveles de estos parámetros en los linfocitos de sangre de sus madres. La asociación positiva observada entre el daño genotóxico en el DNA de los linfocitos del cordón umbilical y el de las madres, sugiere la existencia de intercambios transplacentarios de los agentes involucrados en la inducción de lesiones en el DNA. Por otra parte, el ensayo del cometa es capaz de detectar alteraciones en el DNA causadas por la exposición endógena y/o exógena a compuestos genotóxicos o como resultado de la interacción con algunos factores como la edad, el indice de masa corporal, los micronutrientes, la temporada del parto, el género y otros factores ambientales. En este estudio, se ha demostrado también que los recién nacidos de mujeres expuestas a contaminantes potencialmente inductores de estrés oxidativo no presentan un mayor nivel de daño oxidativo en su DNA. Por último, los datos apoyan la hipótesis de que la exposición materna y los intercambios transplacentarios son eventos biológicos medibles y sus efectos se pueden detectar en el cordón umbilical, demostrando una posible exposición in utero. La falta de resultados que nos indiquen una asociación entre la ingesta de estos compuestos y la aparición de efectos genotóxicos, nos indican que se necesitan más estudios sobre cómo el consumo de alimentos ricos en estos contaminantes y/o sus precursores podrían relacionarse con el riesgo de efectos genotóxicos y sus consecuencias en el recién nacido. / Fetal exposure to xenobiotic agents during prenatal period may have important implications on the health of newborns, as well as adverse health diseases later in child life, such as asthma, allergies, neurologic impairment, diabetes, cardiovascular diseases and cancer, among others. Therefore, it is necessary to develop and use sensitive tools to carry out a systematic analysis of the potential risk in children resulting from exposures to genotoxic agents through the mother. A cross-sectional study of 200 voluntary and healthy pregnant women, at the Hospital del Mar in Barcelona, was performed. Biological samples were obtained from 2008 to 2010. In our study, we have used the comet assay as a biomarker of effect, allowing to assess the level of basal and DNA oxidative damage by incorporating lesion-specific bacterial DNA repair enzymes, such as formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) and endonuclease III (EndoIII), as well as to evaluate DNA repair capacity in mothers-newborns lymphocytes. Since the effect of exposure to hazardous environmental agents may be modified by diet during the pregnancy, in our work we used the dietary patterns of these mothers to assess food intake during pregnancy and their possible modulating effect. We have also considered dietary intake as a vehicle for exposure to various environmental pollutants potentially genotoxic. The results of this study indicated that the levels of basal damage, oxidative damage (oxidized purines and pyrimidines), and repair capacity measured in mothers and children are correlated. These positive associations may indicate transplacental exchange of agents involved in the induction of DNA lesions. So, the comet assay can detect DNA alterations caused by exposure to endogenous and/or exogenous genotoxic compounds, as well as interaction with factors such as age, body mass index, micronutrients, season of birth, gender and other environmental factors. In this study, we have also shown that infants born from women exposed to contaminants that may induce potentially oxidative stress, does not present higher level of oxidative damage in DNA. Finally, our data support the hypothesis that maternal exposure and transplacental exchanges are biological events measurable, and they can be detected in the umbilical cord, indicating a possible exposure in utero. The lack of results indicating an association between intake of these genotoxics compounds and the occurrence of genotoxic effects, lead us to suggest that further studies are necessary to show how the consumption of foods with high content of contaminants and/or their precursors can be related to increased risk of genotoxic effects in the newborns.

El cáncer es una patología compleja, con respecto a su génesis, donde participan factores tanto ambientales, como genéticos y epigenéticos; sin embargo, se conoce que los mecanismos de reparación tienen una gran influencia sobre su desarrollo debido a su implicación en el mantenimiento de la integridad del genoma, característica que se pierde en varios tipos de cánceres. Es por este motivo que nuestro grupo viene trabajando en la búsqueda de factores genéticos que puedan suponer un riesgo para el desarrollo de cáncer de tiroides. Existe un vínculo crítico entre la capacidad individual de reparar el daño en el DNA y el desarrollo y progresión de cáncer, así como con la respuesta frente a la terapia contra esta enfermedad. En este estudio se ha evaluado el posible riesgo que supone la presencia de cinco polimorfismos en genes de reparación [OGG1 (rs1052133) y XRCC1 (rs25487, rs25489), involucrados en la vía de reparación por escisión de bases; y de XRCC2 (rs3218536) y XRCC3 (rs1799796) involucrados en la vía de reparación por recombinación homóloga] sobre el desarrollo de cáncer de tiroides. También se ha evaluado la sensibilidad a la radiación ionizante en un grupo de pacientes que desarrollaron cáncer de tiroides, así como la posible influencia de los polimorfismos citados anteriormente sobre los niveles de daño en el DNA. Adicionalmente, siguiendo el mismo modelo de análisis para los genes de reparación, también se han evaluados tres polimorfismos del gen WDR3 (rs3754127, rs3765501, rs4658973) para conocer su influencia sobre los niveles de daño en el DNA, debido a que nuestro grupo ha encontrado recientemente una asociación entre este gen y el riesgo de desarrollar cáncer de tiroides papilar. Así, se ha encontrado que la presencia de la variante A del polimorfismo rs25489 del gen XRCC1 supone un incremento de riesgo para el desarrollo de cáncer de tiroides en la población española. Con respecto a la sensibilidad a la radiación ionizante, no se han encontradodiferencias significativas entre un grupo de pacientes con cáncer de tiroides y un grupo control, cuando se induce un daño con radiación ionizante en linfocitos de sangre periférica en la etapa G0 del ciclo celular. Finalmente, se ha encontrado que los niveles de daño en el DNA, tanto basales como inducidos por radiación ionizante parecen estar influenciados por la presencia de las variantes menos frecuentes del polimorfismo rs1052133 del gen OGG1 y de los tres polimorfismos del gen WDR3. / Cancer is a complex disease with the involvement of environmental, genetic and epigenetic factors; however, it is known that repair mechanisms have a major influence on their development because of its involvement in maintaining genome integrity, characteristic which is lost in several types of cancers. This is the reason why our Group has been working in the search of genetic factors that may have a influence on the risk for the development of thyroid cancer. There is a critical relationship between the capacity to repair DNA damage and the development and progression of cancer, as well as with the response to the therapy used against this disease. In this study we evaluated the potential risk of five polymorphisms in repair genes [OGG1 (rs1052133) and XRCC1 (rs25487, rs25489), involved in base excision repair pathway, and XRCC2 (rs3218536) and XRCC3 (rs1799796) involved in homologous recombination repair pathway] on the development of thyroid cancer. We also assessed the sensitivity to ionizing radiation in a subgroup of patients of thyroid cancer and the possible influence of the polymorphisms mentioned above on the levels of DNA damage. Since our Group has reported an association between the WDR3 gene and the risk of developing papillary thyroid cancer, additionally and following the same model of analysis used for the repair genes, three WDR3 gene polymorphisms (rs3754127, rs3765501, rs4658973) were also evaluated to establish their influence on the levels of DNA damage. Thus, it was found that the presence of the A variant (rs25489) in XRCC1 gene is a genetic factor associated with an increased risk for developing thyroid cancer in the Spanish population. In spite of the sensitivity to ionizing radiation showed by thyroid cancer patients, no significant differences were found between patients with thyroid cancer and controls, when DNA damage was induced by ionizing radiation in peripheral blood lymphocytes in the G0 phase of the cell cycle. Finally, we found that the levels of DNA damage, both basal and induced by ionizing radiation appear to be significantly influenced by the presence of variants of the assayed polymorphisms rs1052133 (OGG1) and rs3754127, rs3765501, rs4658973 (WDR3).

El arsénico inorgánico (i-As) es un metaloide tóxico que se encuentra en el medio ambiente y que afecta a millones de personas en todo el mundo. Se considera un compuesto carcinogénico siendo el hígado un órgano diana. Además de su efecto carcinogénico, está relacionado con un aumento de la prevalencia de la diabetes. Los factores nucleares 1 y 4 α (HNF1α y HNF4α) son miembros clave de la red de transcripción esencial para el mantenimiento de la arquitectura del hígado. Los cambios en la expresión de HNF1α y HNF4α están claramente asociados con el desarrollo de cáncer de hígado y de diabetes en humanos. En este trabajo, la línea celular hepática HepG2 y los hámsteres Golden Syrian han sido expuestos a dosis subtóxicas de arsenito sódico, dosis medioambientalmente relevantes (inferiores a 10 µM in vitro y de 15 mg/L in vivo) con la finalidad de evaluar si el arsénico es capaz de comprometer la expresión de los factores nucleares hepáticos (HNFs). También, como medida de los efectos inducidos por el i-As se ha estudiado in vitro la expresión de varios marcadores de diferenciación hepática y el estado de metabolización de la glucosa. Los resultados muestran una disminución de la expresión de HNF1α y HNF4α cuando la línea celular HepG2 se expone al arsénico, momento en el que se observa: (i) adquisición de resistencia a la toxicidad/apoptosis, (ii) pérdida de las características específicas de tejido (disminución de la expresión de ALDOB, PEPCK y CYP1A2, inducción de la transición epitelio-mesenquima (EMT) y la hipersecreción de metaloproteinasas de matriz 2 y 9), (iii) fallo del mantenimiento del balance del programa de auto-renovación (desregulación de C-MYC, OCT3/4, LIN28 y NOTCH2) y (iv) desregulación del metabolismo de la glucosa. Concluimos que la disminución de la expresión de HNF1α y HNF4α inducida por el i-As bajo un escenario de exposición crónica puede jugar un papel central en el efecto del arsénico en el cáncer de hígado y en la diabetes. / Inorganic arsenic (i-As) is a naturally occurring toxic metalloid affecting millions of people world-wide. It is known to be carcinogen, liver being an important target, and related to the prevalence of diabetes in arseniasis-endemic areas. Hepatocyte nuclear factor 1 and 4 alpha (HNF1α and HNF4α) are key members of a transcriptional network essential for normal liver architecture. Changes in HNF1α and HNF4α expression are clearly associated with the development of liver malignancies and diabetes in humans. In this work, hepatic HepG2 cells and Golden Syrian hamsters were exposed to sub-toxic, environmentally relevant doses of sodium arsenite (SA; up to 10 µM in vitro, 15 mg/L in vivo) in order to evaluate whether arsenic is able to compromise the expression of hepatocyte nuclear factors (HNFs). Also, several markers of hepatocyte differentiation and glucose metabolism status were determined in vitro as a measure of i-As-induced effects. Results show a consistent down-regulation of HNF1α and HNF4α under an scenario of exposure where HepG2 cells (i) gained resistance to arsenic-induced toxicity/apoptosis, (ii) attained loss of tissue specific features (as shown by the observed downregulation of ALDOB, PEPCK and CYP1A2, the triggering of the epithelial-to-mesenchymal transition program (EMT) and the hypersecretion of matrix metalloproteinase-2 and 9), (iii) failed to maintain balanced their self-renewal program (as shown by the observed deregulation of C-MYC, OCT3/4, LIN28 and NOTCH2) and (iv) showed glucose metabolism impairment. We conclude that the i-As-induced down-regulation of HNF1α and HNF4α under chronic settings may play a central role in the observed features of disease and cancer.

El gen DYRK1A es troba situat en una regió del cromosoma 21 humà que s'ha associat a alteracions en el neurodesenvolupament. Aquest treball mostra com canvis en la dosis gènica de Dyrk1A en el ratolí causen una alteració en la cel.lularitat de les capes internes de la retina i provoquen alteracions funcionals severes. A més a més, la sobreexpressió de Dyrk1A és la única responsable de les alteracions en la retina dels animals Ts65Dn, un model murí de Síndrome de Down. El control de la mort cel.lular programada és fonamental pel correcte desenvolupament del sistema nerviós central. Aquest treball demostra que la proteïna quinasa DYRK1A és un regulador negatiu de la via intrínseca d'apoptosis durant el desenvolupament de la retina. DYRK1A no afecta la proliferació o especificació de les cèl.lules progenitores, sinó que regula el nombre de cèl.lules que moren per apoptosis. La caspasa-9 és un nou substracte de DYRK1A, i la fosforilació de la caspasa al residu treonina 125 per DYRK1A protegeix les cèl.lules de la retina de la mort apoptòtica. Aquestes dades suggereixen un model en el qual una desregulació de la resposta apoptòtica en neurones en diferenciació podria participar en la neuropatologia de malalties que pesenten una alteració en la dosis gènica de DYRK1A. / DYRK1A is located in a region of human chromosome 21 (HSA21) that has been associated to the neurodevelopmental impairments shown by individuals with HSA21 aneuploidies. This work shows changes in Dyrk1A gene dosage in the mouse strongly alter the cellularity in inner retina layers and results in severe functional alterations. Moreover, overexpression of Dyrk1A is solely responsible for the retina alterations shown by Ts65Dn mice, a mouse model for Down syndrome. The precise regulation of programmed cell death is critical for the normal development of the nervous system. This work demonstrates that DYRK1A protein kinase is a negative regulator of the intrinsic apoptotic pathway in the developing retina. DYRK1A does not affect the proliferation or specification of retina progenitor cells, but rather regulates the number of cells that die by apoptosis. Caspase-9 is a novel DYRK1A substrate, and the phosphorylation on caspase-9 at threonine residue 125 by DYRK1A protects retina cells from apoptotic cell death. This data suggests a model in which dysregulation of the apoptotic response in differentiating neurons participates in the neuropathology of diseases that display DYRK1A gene dosage imbalance effects.

Les tecnologies de seqüenciació de nova generació (NGS) han emergit com a una poderosa eina per al descobriment de mutacions causals i nous gens per a malalties Mendelianes, i estan tenint un ràpid impacte en l’àmbit del diagnòstic genètic. Les tecnologies de NGS es poden utilitzar en combinació amb mètodes d’enriquiment de l’ADN per a seqüenciar en profunditat regions genòmiques diana, com l’exoma o gens associats a malalties, entregant informació genètica d’una manera ràpida, barata i acurada. Aquesta tesi descriu l’aplicació de la NGS dirigida per a identificar un nou gen per a la hipertensió hipercalièmica familiar. També s’explora la traducció clínica de les tecnologies de NGS per a millorar el diagnòstic genètic d’un panell heterogeni de malalties Mendelianes, què inclou la fibrosi quística, hiperfenilalaninèmies i la malaltia renal poliquística autosòmica dominant. Els resultats d’aquesta tesi no només ratifiquen la NGS dirigida com a una potent eina per al descobriment de gens de malalties Mendelianes, sinó què també demostren que aquesta tecnologia està preparada per a substituir els mètodes moleculars tradicionals a l’àmbit de la genètica mèdica. / Next Generation Sequencing (NGS) technologies have emerged as a powerful tool for the discovery of causative mutations and novel Mendelian disease genes, and are rapidly impacting genetic diagnostics. NGS technologies can be used in combination with DNA enrichment methods to generate deep sequencing of target genome regions, such as the exome or known disease loci, delivering fast, inexpensive and detailed genetic information. This thesis describes the application of targeted NGS to identify a novel disease gene for familial hyperkalemic hypertension. In addition, it also explores the clinical translation of NGS technologies to the genetic diagnostics of a heterogeneous panel of Mendelian diseases, including cystic fibrosis, hyperphenylalaninemias and autosomal dominant polycystic kidney disease. The results of this thesis do not only ratify targeted NGS as a powerful tool for Mendelian disease gene discovery, but also show that it is ready to substitute traditional molecular methods in medical genetics.

Phylogenomics is a biological discipline which can be understood as the intersection of the fields of genomics and evolution. Its main focuses are the analyses of genomes through the evolutionary lens and the understanding of how different organisms relate to each other. Moreover, phylogenomics allows to make accurate functional annotations of newly sequenced genomes. This discipline has grown in response to the deluge of data coming from different genome projects. To achieve their objectives, phylogenomics heavily depends on the accuracy of different methods to generate precise phylogenetic trees. Phylogenetic trees are the basic tool of this field and serve to represent how sequences or species relate to each other through common ancestry. During my thesis, I have centered my efforts in improving an automated pipeline to generate accurate phylogenetic trees and its posterior publication through a public database. Among the efforts to improve the pipeline, I have specially focused on the problem of multiple sequence alignment post-processing, which has been shown to be central to the reliability of subsequent analyses. Subsequently I have applied this pipeline, and a battery of other phylogenomics tools, to the study of the phylogenetic position of Microsporidia, a group of fast-evolving intracellular parasites. Due to their special genomic features, Microsporidia evolution constitutes one of the classical examples of challenging problems for phylogenomics. Finally, I have also used the pipeline as a part of a newly designed method for selecting robust combinations of phylogenetic gene markers. I have used this method for selecting optimal gene sets to assess the phylogenetic relationships within fungi and cyanobacteria, showing that the potential of these genes as phylogenetic markers goes well beyond the species used for their selection. / Filogenómica es una disciplina biológica que puede ser entendida como la intersección entre los campos de la genómica y la evolución. Su área de estudio es el análisis evolutivo de los genomas y como se relacionan las distintas especies entre sí. Además, la filogenómica tiene como objetivo anotar funcionalmente, con gran precisi ón, genomas recién secuenciados. De hecho, esta disciplina ha crecido rápidamente en los úultimos años como respuesta a la avalancha de datos provenientes de distintos proyectos genómicos. Para alcanzar sus objetivos, la filogenómica depende, en gran medida, de los distintos métodos usados para generar árboles filogenéticos. Los árboles filogenéticos son las herramientas básicas de la filogenómica y sirven para representar como secuencias y especies se relacionan entre sí por ascendencia. Durante el desarrollo de mi tesis, he centrado mis esfuerzos en mejorar una pipeline (conjunto de programas ejecutados de forma controlada) automática que permite generar árboles filogenéticos con gran precisión, y como ofrecer estos datos a la comunidad científica a través de una base de datos. Entre los esfuerzos realizados para mejorar la pipeline, me he centrado especialmente en el post-procesamiento previo a cualquier análisis de alineamientos múltiples de secuencias, ya que la calidad del alineamiento determina la de los estudios posteriores. En un contexto más biológico, he usado esta pipeline junto con otras herramientas filogenómicas en el estudio de la posición filogenética de Microsporidia. Dadas sus características genómicas especiales, la evolución de Microsporidia constituye uno de los problemas clásicos y difíciles de resolver en filogenómica. Finalmente, he usado también la pipeline como parte de un nuevo método para seleccionar combinaciones óptimas de genes con potencial como marcadores filogenéticos. De hecho, he usado este método para identificar conjuntos de marcadores filogenéticos que permiten reconstruir con alto grado de precisión las relaciones evolutivas en Cyanobacterias y en Hongos. Lo más interesante de este método es que eval úa la fiabilidad de los marcadores en especies no usadas para su selección.

S'ha abordat l'estudi genètico-molecular d'una extensa família espanyola afectada per una nova forma de distròfia muscular de maluc (Limb-girdle muscle dystrophy, LGMD) amb herència autosòmica dominant. Un cop definida la clínica de forma detallada s'han comparat les seves característiques amb les de les altres 5 formes autosòmiques dominants prèviament conegudes. Si bé ja alguns dels trets clínics eren diferencials, mitjançant l'anàlisi de lligament a 3 punts (2 marcadors-malaltia) de marcadors polimòrfics lligats a aquestes formes (regions 1q11-q21, 3p25, 5q31, 6q23 i 7q), s'han pogut excloure com a responsables de la malaltia en la família estudiada. Un cop establert que ens trobàvem davant d'una nova forma genèticament diferenciada, s'ha procedit a fer una anàlisi de lligament completa a 2 punts (marcador-malaltia), tot analitzant un ampli grup de marcadors polimòrfics dispersos pels 22 cromosomes autosòmics, comprovant manual i estadísticament la seva segregació respecte el fenotip clínic. Inicialment s'han utilitzat microsatèl.lits marcats amb fluorescència i pel fine mapping s'han utilitzat microsatèl.lits adicionals marcats radiactivament, havent-se inclós en aquesta darrera part fins a 55 d'individus del pedigrí, 27 afectes i 28 sans. Com a resultat, s'ha pogut trobar el locus de la malaltia al braç llarg del cromosoma 7, concretament a la regió 7q31-q32. Mitjançant l'estudi de marcadors adicionals i considerant la valuosa informació del 4 individus recombinants trobats en diferents parts del pedigrí, s'ha pogut establir una regió candidata d'unes 3,7 megabases, entre els marcadors D7S680 i D7S2544, dins els mapes del consorci humà i en la qual s'han identificat una sèrie de gens candidats i de expressed sequence tags (EST). El continu avenç en el projecte Genoma Humà ha suposat un gran ajut a l'hora de situar i escollir marcadors i gens dins el cromosoma 7.S'ha estudiat a fons un dels gens candidats, la Filamina C, proteïna que lliga actina. S'ha pogut excloure la Filamina C com a gen responsable de la nostra nova forma de LGMD després de no trobar-se cap mutació present en tots els individus afectes en co-segregació amb la malaltia ni cap alteració en el nivell d'expressió a nivell de mARN (àcid ribonucleic missatger).Podem concloure que ens trobem davant una nova forma d'LGMD autosòmica dominant genèticament diferenciada que caldria anomenar LGMD1F, segons la nomenclatura de l'OMIM (On-line Mendelian Inheritance in Man database). / It has been performed the genetic and molecular analysis of a large Spanish family affected by a new limb-girdle muscle dystrophy form (LGMD) with an autosomal dominant inheritance trait. Once described the clinical features of the disease we compared them with the 5 other autosomal dominant LGMD previously described. Aditionally to some clinical specific and differential traits, 3-point linkage analysis (2 markers and disease) with linked markers to this forms (regions 1q11-q21, 3p25, 5q31, 6q23 and 7q) excluded them as responsible for the disease in our pedigree. Once stablished that we had a new genetically distinguished form, we performed a genomic wide 2-point linkage analysis (marker-disease), by the use of many polymorphic markers spread all over the 22 autosomal chromosomes, checking manually and statistically its segregation with respect to the clinical phenotype. We first performed the analysis with fluorescently labeled markers and then, for the fine mapping, we used aditional 32P labeled markers, including in this part up to 55 members of the pedigree, being 27 of them affected and 28 unaffected. As a result, we could find the locus of the disease in the long arm of chromosome 7, specifically to region 7q31-q32. By the use of aditional markers and analysing the 4 informative recombinant individuals found in different parts of the pedigree it was possible to stablish a candidate region that spans 3.7 megabases, between markers D7S680 and D7S2544, following the available human physical and genetic maps. We have identified some candidate genes and expressed sequence tags (EST) in this interval. The continuous improvement in the Human Genome Project has become a great help at the time of placing and choosing markers and genes in Chromosome 7. One of the candidate genes, Filamin C, an actin-binding protein, has been extensively studied. We were able to exclude Filamin C as the gene responsible for the disease in our LGMD pedigree after the analysis of the whole coding sequence and not finding any pathological mutation in all affected individuals co-segregating with the disease and after checking the expression levels at the mRNA level in affected individuals in comparison with unaffected individuals, not being significatively different. We can conclude that this is a new autosomal dominant LGMD form, genetically distinguished that we could name LGMD1F, following the OMIM nomenclature (On-line Mendelian Inheritance in Man Database).