No description available.

El descobriment dels microRNAs (miRNAS) com a nous reguladors de l’expressió gènica ha obert un nou camp en l’estudi de quin és el comportament d’aquests RNAs de mida petita i descriure en quins processos actuen i de quina manera regulen l’expressió gènica. L’aparició de les tècniques de seqüenciació massiva ha permès la descripció i estudi dels perfils d’expressió de miRNAs en diferents situacions, a fi d’observar la seva implicació en els processos biològics, tant fisiològics com patològics. Aquesta tesi exemplifica, mitjançant dues aproximacions diferents, l’ús d’aquestes tècniques per a la descripció, descobriment i estudi de perfils de miRNAs en l’espècie porcina. La primera part del treball es va dissenyar amb l’objectiu d’ampliar el nombre de miRNAs descrits en el porc. Les aproximacions utilitzades per a la determinació de nous miRNAs varen ser, primer de tot, la descripció del perfil d’expressió de miRNAs en el ronyó del porc, incloent els miRNAs ortòlegs i, segon, l’ús d’un protocol de descobriment i validació de nous miRNAs porcins. Una altra motivació del treball va ser el fet d’estudiar possibles canvis en l’expressió dels miRNAs en races de porc de diferents orígens, des de races europees fins a asiàtiques, incloent races europees amb influència asiàtica, on hem descrit miRNAs diferencialment expressats i s’ha estudiat la seva possible funcionalitat. En la segona part del treball es va dur a terme una infecció experimental amb el virus de la malaltia d’Aujeszky (ADV), l’herpesvirus porcí tipus 1 (SHV-1), amb una soca virulenta (NIA-3) i una soca vacunal (Begonia). Es varen realitzar dues aproximacions diferents: un aproximació in vitro utilitzant les línies cel·lulars PK-15 derivades del ronyó de porc, i una aproximació d’infecció experimental in vivo utilitzant el bulb olfactori i el gangli trigemin com a teixits diana per l’estudi. Amb l’objectiu d’estudiar la implicació dels miRNAs, tant virals com de l’hoste, en les interaccions hoste – patogen durant una infecció vírica, s’han descrit els perfils de miRNAs i s’han avaluat les diferències en la seva expressió, no només entre el grup infectat i el grup control, sinó també entre les soques utilitzades i entre les dues aproximacions. També s’han descrit nous miRNAs virals que s’expressen durant la infecció. Finalment, s’ha elaborat, amb estudis funcionals in silico, una xarxa d’interaccions entre els miRNAs virals, els miRNAs de l’hoste diferencialment expressats i els gens que codifica l’agent infecciós SHV-1. Donada la importància de la tècnica de l’RT-qPCR per a la validació de l’expressió de miRNAs, també s’ha realitzat un estudi addicional per avaluar l’estabilitat en l’expressió d’alguns miRNAs per a poder ser utilitzats com a gens de referència en estudis de quantificació relativa de dades d’RT-qPCR, ja que fins l’actualitat s’han fet servir poc per a aquest propòsit. / The discovery of microRNAs (miRNAs) as novel gene expression regulators has opened a new field in the study of the roles of these small RNAs, as well as on describing in what processes they act and how they regulate gene expression. The emergence of next generation sequencing methods has allowed the description and study of miRNA expression profiles in different situations, in order to observe its involvement in biological processes, both physiological and pathological. This thesis illustrates, through two different approaches, the use of these techniques for the description, discovery and study of miRNA profiles in the porcine species. The first part of the study was designed with the aim of increasing the number of described miRNAs in pigs. The approaches used for the determination of novel miRNAs were, first of all, the expression profiling of miRNAs in the swine kidney, including the orthologous ones and, second, using a pipeline for the discovery and validation of new porcine miRNAs. Another motivation of this work was to study the possible changes in the kidney miRNAs expression patterns among pig breeds from different origins, from European to Asian breeds, including European breeds with Asian influences. In this sense, differentially expressed miRNAs have been described and their functional roles have been studied. In the second part of the study, an experimental infection with Aujeszky's disease virus (ADV), also known as suid herpesvirus type 1 (SHV-1), was carried out, using a virulent strain (NIA-3) and a vaccine strain (Begonia). Two different approaches were conducted: an in vitro approach using PK-15 cell lines, derived from pig kidney, and an in vivo approach using the olfactory bulb and trigeminal ganglia as target tissues. With the aim of studying the role of both host and viral miRNAs in host – pathogen interactions during SHV-1 infection, miRNAs expression profiles have been described and their expression differences evaluated, not only between infected and mock-infected groups, but also between strains and between the two performed approaches. New viral miRNAs have been described and their expression during the infection has been confirmed. Finally, a network of interactions between viral miRNAs, host differentially expressed miRNAs and SHV-1 encoded genes was developed using in silico functional studies. Given the importance of RT-qPCR method for validating the expression of miRNAs, we also performed an additional study to assess the expression stability of some miRNAs to be used as reference genes in relative quantification studies of RT-qPCR data, which they have not been widely used for this purpose.

La tesi recull els resultats obtinguts de la caracterització genética del linfoma de la zona marginal esplènic (LZME). Està presentat en format de tesi per articles, i inclou, en aquest ordre, els apartats de: Introducció, Hipòtesi i Objectius, Resultats, Discussió, Conclusions, Bibliografia i Annexos. La introducció resum la limfomagènesi i l’origen del limfòcits B, i detalla la anatomia dels òrgans involucrats en aquest procés. A continuació es fa una introducció a les neoplàsies de cèl·lules B madura i s’explica la classificació actual dels limfomes detallant les alteracions citogenètiques i moleculars d’aquest subgrup de neoplàsies. Més específicament es detallen les característiques clinico-biològiques del LZME, entitat que tracta aquesta tesi. Finalment, s’inclou un resum dels mètodes de detecció d’alteracions cromosòmiques i moleculars utilitzats per estudiar el càncer. Els resultats contenen un breu resum dels articles presentats en aquesta tesi i a més s’inclouen els articles publicats com a fruït d’aquest treball. A la discussió s’analitzen els resultats obtinguts i es comparen amb altres estudis de la literatura. Finalment, s’inclou també un capítol d’annexos que conté el material i mètodes emprat en aquesta tesi i les taules suplementaries d’un dels articles presentats. / This thesis contains the results of genetic characterization of splenic marginal zone lymphoma (LZME). It is presented as a compendium of publications, and includes, in this order, the sections: Introduction, Hypothesis and Objectives, Results, Discussion, Conclusions, Bibliography and Appendices. The introduction summarises the lymphomagenesis and the the origin of B lymphocytes, and details the anatomy of the organs involved in this process. Below there is an introduction to mature B-cell neoplasms explaining the current classification of lymphomas and detailing the cytogenetic and molecular alterations. More specifically explains the clinical and biological features of LZME. Finally, there is a summary of methods used for detecting chromosomal and molecular alterations in cancer. The results contain a brief summary of the papers included in this thesis and also included articles published as a result of this work. In the discussion section, the results are analysed and compared with other studies in the literature. Finally, there is a chapter appendices containing materials and methods used in this thesis and supplementary tables of one of the papers included.

Per tal d'identificar nous membres de la família de receptors CD300L, es va fer una cerca a la base de dades genòmica utilitzant les seqüències d'IREM-1 (nou receptor inhibidor identificat en el nostre laboratori) i CMRF-35, i es va descriure un nou membre de la família anomenat "immune receptor expressed on myeloid cells" (IREM-2/CD300e). El gen localitzat en el cromosoma 17q25.1 codifica per una proteïna de 205 aminoàcids formada per una regió extracel·lular amb un domini immunoglobulina i una regió transmembrana amb un residu carregat positivament (Lys), el qual permet predir la seva possible associació a una molècula adaptadora. La interacció entre IREM-2 i DAP-12 es va confirmar en cèl·lules COS transfectades. Emprant els anticossos específics generats amb cèl·lules de sang perifèrica i del moll de l'os vàrem observar que l'expressió d'IREM-2 està restringida a cèl·lules hematopoètiques madures del llinatge mielomonocític. La diferenciació in vitro a macròfags o cèl·lules dendrítiques immadures provoca una disminució de l'expressió d'IREM-2. L'estimulació, amb els anticossos específics, d'IREM-2 en la línia cel·lular RBL (leucèmia basofílica de rata) juntament amb DAP-12 indueix l'activitat transcripcional d'NFAT i en absència de DAP-12 es requereix la presència d'un coestímul, el PMA, per produir activitat transcripcional. A més a més, l'estimulació d'IREM-2 en monòcits indueix la producció de TNF- i l'alliberació de calci intracel·lular. Com a conclusió, aquests resultats indiquen que IREM-2 és un nou receptor activador de la superfamilía de les immunoglobulines expressat en el llinatge mielomonocític. / Homology BLAST search was carried out using a sequence encoding for a novel inhibitory receptor (IREM-1) cloned in our laboratory and a previously described homologous sequence termed CMRF-35. Based on this information, we cloned a full-length cDNA corresponding to a novel member of this family, termed IREM-2. The gene, located in cr. 17q25.1, encodes for a protein of 205 amino acids that contains an extracellular region comprising an Ig-like domain and a transmembrane region with a positively charged amino acid residue (Lys), that predicted its putative association with an adapter molecule. Indeed, the interaction between IREM-2 and DAP-12 was confirmed in transfected COS-7 cells. By generating specific antibodies and using bone marrow and peripheral mononuclear cells we observed that IREM-2 expression appeared restricted to mature hematopoietic cells of the monocytic and myeloid dendritic cell lineages. In vitro differentiation to macrophages or immature dendritic cells down-regulated IREM-2 expression. Upon engagement with the specific mAbs, IREM-2 expressed in rat basophilic leukaemia (RBL) cells together with DAP-12, induced NFAT transcriptional activity; moreover IREM-2 engagement on monocytes induced TNF-alpha production. Taken together, our results indicate that IREM-2 is a novel activating receptor of the Ig-superfamily in the monocytic lineage.

El presente trabajo describe el clonaje y caracterización de un nuevo receptor inhibidor de la superfamilia de las Ig, que hemos denominado IREM-1 (Immune Receptor Expressed by Myeloid Cells). El analisis de su secuencia demuestra que esta molécula forma parte de la familia multigénica conocida como CMRF35 o CD300. IREM-1 fue clonado a partir de cDNA proveniente de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), y es una glucoproteina tipo I de membrana, con un único dominio Ig extracelular, un fragmento transmembrana y una cola citoplasmática con cinco residuos tirosina que cosntituyen diversos motivos de señalización intracelular. Dos de estos residuos, las tirosinas 205 y 249, corresponden a ITIMs, mientras que las tirosinas 236 y 263 son parte de motivos YxxM asociados al reclutamiento de PI3K. La tirosina más distal (Y284) podría ser considerada como parte de un motivo ITIM-like. IREM-1 es capaz de asociarse a la fosfatasa SHP-1, y hemos identificado al residuo Y205 como principal responsable de dicha interacción. IREM-1 es capaz de producir señales inhibitorias sobre receptores activadores como el FcRI, en un modelo heterólogo de rata con la línea basofílica RBL. Esta inhibición está mediada por ambos ITIMs. IREM-1 también es capaz de unir la subunidad p85 de la PI3K a través de sus dos motivos YxxM. Ambos motivo poseen la capacidad de unir esta molécula. El triple mutante de IREM-1 de los 2 sitios ITIMs y el ITIM-like, que no une SHP-1, es capaz de producir señales activadoras como la inducción de la degranulación en RBLs. Esta respuesta es dependiente de PI3K y es anulada con inhibidores de esta enzima. La expresión de IREM-1 se restringe a células hematopoiéticas de linaje mieloide incluyendo precursores de médula ósea CD34+. En conclusión, presentamos la identificación y caracterización molecular y funcional del receptor IREM-1. / The present work describes the cloning and characterization of a novel inhibitory receptor belonging to the Ig superfamily, that we termed IREM-1 (Immune Receptor Expressed by Myeloid Cells). The analysy of IREM-1 sequence demonstrated that this molecule belongs to the multigenic family known as CMRF35 or CD300.. IREM-1 was cloned from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) cDNA, and it is a type I glycoprotein, with a single extracellular Ig domain, a transmembrane region and a cytoplasmic tail with five tyrosine residues in the context of several intracellular signaling motifs. Two of these residues, including tyrosines 205 and 249, correspond to ITIMs, whereas tyrosines 236 and 263 are part of YxxM motifs associated to the recruitment of PI3K. The most distal tyrosine (Y284) could be considered as part of an ITIM-like motif. IREM-1 is able to associate to SHP-1 phosphatase, and we identified the residue Y205, as the main responsible for the interaction. IREM-1 delivers inhibitory signal over activating receptors as FcRI, in a heterologous model as the rat basophilic cell line, RBL. This inhibition is mediated by both ITIMs. IREM-1 also binds the p85 subunit of PI3K through its YxxM motifs. Both motifs have the capacity of binding this molecule.A mutated form of IREM-1 mutant lacking the two ITIMs and the ITIM-like, is able to produce activating signals like the induction of of RBL degranulation. This responses are produced in the absence of SHP-1 recruitment and are dependent on PI3K, because are abrogated with inhibitors of this enzyme. IREM-1 expression is restricted to hematopoietic cells of myeloid lineage, including CD34+ precursors from bone marrow. In conclusion, we herein present the identification and molecular and functional characterization of the receptor IREM-1.

La maduixa silvestre, F. vesca, és una espècie diploid de la família Rosaceae. El seu petit genoma (240 Mb), la seva gran diversitat genètica i la seva elevada col·linealitat amb la maduixa cultivada (Fragaria x ananassa), la fan un model ideal per tota mena de estudis genètics i funcionals. En aquest treball, s’ha volgut contribuir al coneixement profund de la espècie i la seva variabilitat amb l’objectiu de mapar caràcters de interès agronòmic i de qualitat de fruit. Per això s’ha desenvolupat i caracteritzat una eina genètica de elevat valor, la col·lecció de línies casi isogèniques. Aquesta població comprèn 41 línies que permeten mapar caràcters quantitatius (QTL) i gens majors amb una resolució mitja de 14.2 cM. El fenotipat exhaustiu de la col·lecció juntament amb un detallat anàlisi estadístic han permès mapar centenars de QTL amb interès agronòmic, nutricional i organolèptic. Atenen als aspectes agronòmics, es van mapar nou gens majors i set QTL controlant caràcters tan importants com la forma del fruit la producció d’estolons i el període de floració. L’estudi nutricional del fruit madur es va centrar en el seu contingut en polifenols, donat l’elevat poder antioxidant que proporcionen aquests compostos a les baies. Es van identificar i quantificar inequívocament 22 polifenols, incloent-hi antocianines, flavonoles i flavan-3-oles entre d’altres, per als quals es van mapar 49 QTL controlant una important proporció de la variabilitat observada. A més, es van localitzar dos QTL addicionals explicant la capacitat antioxidant total. Els compostos organolèptics que influencien més decisivament la qualitat del fruit són els sucres i els volàtils. En total, cinc QTL van ser mapats per als tres sucres quantificats. En quant als volàtils, més de 100 compostos diferents van ser identificats en la col·lecció i 126 QTL van ser mapats per 81 d’ells. Entre els QTL més significatius trobem alguns metabòlits de gran importància per l’aroma de la maduixa com el methyl 2-aminobenzoat o el mesifurano. L’estudi transcriptomic de les línies d’introgressió que cobreixen regions genètiques amb un alt nombre de QTL per la qualitat del fruit, han revelat una selecció de gens candidats per alguns dels QTL organolèptics i nutricionals més interessants. Aquest treball, profunditza en el coneixement genètic de la maduixa silvestre i aporta noves eines genètiques i nous QTL que poden ser emprats per la millora genètica del cultiu i que obren un gran ventall d’oportunitats per a futurs estudis. / Woodland strawberry, Fragaria vesca, is a diploid species from the Rosaceae familiy. Its small genome (240 Mb), its huge genetic variability and its high degree of colinearity with the cultivated strawberry (Fragaria x ananassa), make it an ideal model to develop genetic and functional studies. This work has the objective of delving into knowledge on the species and its variability and aims to map characters with agronomical interest and involved in fruit quality. Therefore, a highly relevant genetic tool has been developed and characterized, the near isogenic lines collection. This population consists of 41 lines that allow quantitative traits (QTL) and major genes mapping with an average resolution of 14.2 cM. Exhaustive phenotyping of the collection, together with a thorough statistical analysis lead to mapping hundreds of QTL with agronomic, nutritional and organoleptic interest. Attending to agronomical traits, nine major genes and seven QTL were mapped controlling important characters such as fruit shape, runnering and flowering habit. Ripe fruit nutritional study focused on its polyphenolic content, according to the high antioxidant capacity that these compounds bring to berries. Twenty-two (poly)phenols were unambiguously identified and quantified, including anthocyanins, flavonols and flavan-3-ols among others. For which 49 QTL controlling important proportion of the observed variability were mapped. Furthermore, two additional QTL explaining total antioxidant capacity were detected. Organoleptic compounds that influence the most fruit quality are sugars and volatiles. A total of five QTL were mapped for three quantified sugars. Attending to volatiles, more than 100 different compounds were identified in the collection and 126 QTL were mapped for 81 of them. Among the most significant QTL we found some relevant metabolites for strawberry aroma like methyl 2-aminobenzoate and mesifurane. Transcriptomic study of introgression lines covering genetic regions with a high number of QTL for fruit quality has revealed a selection of candidate genes for the most interesting organoletpic and nutritional QTL. This work deepens in the genetic knowledge of woodland strawberry, bringing new genetic tools and QTL useful for strawberry breeding programs and open new perspectives for future studies.

Els caràcters reproductius són de gran interès en la indústria porcina per tal de millorar l’eficiència productiva. En estudis previs, utilitzant un creuament experimental F2 entre les races Ibèric (Ib) i Meishan (Me) es van identificar varis QTL afectant varis caràcters reproductius (Noguera et al., 2009, Fernandez-Rodriguez et al., 2010, Rodriguez et al., 2005). En particular, es van identificar 2 QTL amb efecte al nombre de garrins nascuts vius (NV) i al nombre total de garrins nascuts (NT) localitzats en els cromosomes porcins 13 (SSC13) i SSC17 (Noguera et al., 2009). Per tal de poder identificar els gens responsables dels QTL en el SSC13, es van analitzar quatre gens candidats (ITIH1, ITIH3, ITIH4 and MUC4). La caracterització del clúster de gens ITIH va permetre identificar que aquests tenen un efecte sobre el NV però que és independent dels QTL associats a la mida de la ventrada. Els anàlisis del gen MUC4, que es troba localitzat dins l’interval de confiança del QTL en el SSC13, van determinar una associació significativa entre un SNP dins d’aquest gen i els caràcters NV i NT, tot i que l’efecte era superior pel NV. A més, l’expressió del gen MUC4 en l’úter és dues vegades superior en truges d’alta prolificitat. Per tal de millorar el nostre coneixement envers l’arquitectura genètica dels caràcters relacionats amb la prolificitat, es va analitzar el transcriptoma a nivell d’expressió gènica en úter així com també els nivells d’expressió de miRNAs tant en úter com en ovari. Aquests estudis es van realitzar utilitzant truges F2 IbxMe que presentaven fenotips extrems pels nivells de prolificitat definits com el nombre d’embrions (NE) units a l’úter a dia 30-32 de la gestació. En l’úter de les truges d’alta prolificitat es van identificar 101 gens (upregulated) implicats en la resposta inflamatòria enfront als estímuls i en el desenvolupament del teixit muscular. Per altra banda, 196 gens (downregulated) es van relacionar amb el desenvolupament del teixit muscular, l'organització d’unió cel·lular, en processos d’adhesió, en la regulació biològica, en processos del sistema muscular i circulatori i en el transport. L’estudi del microRNAoma va identificar els miR-125b-5p, miR-200C-3p, miR-23b-3p, miR-23-3p i miR-99-5p com els més abundants en l'úter de les truges gestants, mentre que l'expressió de miR-139- 5p, miR-150-5p, miR-27-3p i miR-20-5P es van associar amb els nivells de prolificitat. Entre tots els possibles gens diana per als miRNAs relacionats amb la prolificitat, es troben 32 gens localitzats dins l’interval de confiança per als QTL de prolificitat i, per tant, es van proposar com a bons gens candidats per a ser estudiats. Entre aquests, es troba el gen MUC4 que és de gran interès per a ser el responsable del QTL en el SSC13 ja que reuneix varis criteris; es localitza dins l’interval de confiança del QTL en el SSC13, té un efecte sobre la mida de la ventrada, el seu nivell d’expressió es relaciona amb els nivells de prolificitat i pot ser regulat pel miR-150-5p, que també es va trobar diferencialment expressat en relació amb els nivells de prolificitat. D’altra banda, en ovari, els miR-146a-5p i miR-142-3p, involucrats en processos del sistema immunològic i en la homeòstasis cel·lular, estan diferencialment expressats en relació amb els nivells de prolificitat. Quatre gens diana per aquests miRNAs (LRRK1, CCL8, CPEB2 and BAT1) es troben dins l’interval de confiança per als QTL amb efecte per la prolificitat, fet que fa que siguin bons candidats a ser estudiats. Finalment, es va dissenyar un nou mètode RT-qPCR molt específic, sensible i precís per tal de mesurar els nivell d’expressió dels miRNAs mitjançant l’ús d’encebadors d’ADN. / Reproductive traits are of great interest in the swine industry to improve the pig efficiency production. In a previous study, several QTL affecting reproductive traits were identified in an Iberian (Ib) x Meishan (Me) F2 population (Noguera et al., 2009, Fernandez-Rodriguez et al., 2010, Rodriguez et al., 2005). In particular, two QTL for the number of piglets born alive (NBA) and the total number of piglets born (TNB) were located on porcine chromosomes 13 (SSC13) and SSC17 (Noguera et al., 2009). To identify genes responsible for the prolificacy QTL on SSC13, four candidate genes (ITIH1, ITIH3, ITIH4 and MUC4) were analysed. Analyses for ITIH gene cluster showed that these genes had an effect on NBA independent of litter size QTL. Results for MUC4 gene, located within the confidence interval of the QTL on SSC13, determined that a SNP within the MUC4 gene was associated with NBA and TNB although the effect was stronger for NBA. In addition, uterine MUC4 expression was two-fold higher in high prolificacy sows. To better understand the genetic basis of prolificacy related traits, transcriptome analyses, which included the study of uterine gene expression as well as the miRNA expression profile in the uterus and in the ovary, was performed. For this, IbxMe F2 sows displaying extreme phenotypes regarding the prolificacy levels defined as the number of embryos (NE) attached to the uterus at day 30-32 of the gestation were used. In uterus of high prolificacy sows, 101 genes involved in the inflammatory response to stimulus and muscle tissue development were upregulated whereas 196 genes that participated in muscle tissue development, cell junction organization and adhesion, biological regulation, muscle and circulatory system processes, and transport were downregulated. The microRNAome identified the miR-125b-5p, miR-200c-3p, miR-23b-3p, miR-23a-3p and miR-99a-5p as the most abundant miRNAs in uterus of pregnant sows while expression of miR-139-5p, miR-150-5p, miR-27a-3p and miR-20-5p was associated with prolificacy levels. Among predicted gene target for uterine prolificacy-related miRNAs, 32 were located within the confidence interval of the QTL for NBA and TNB and therefore, they are proposed to be good candidate genes to be further investigated. Importantly, among these candidate genes, it is found MUC4 gene which is of great interest to be the responsible for the prolificacy QTL on SSC13 because it fulfilled several criteria: it is located within the QTL confidence interval with an effect on NBA and TNB, its expression level varies regarding the prolificacy level of sows, and it is targeted by miR-150-5p, a miRNA that was also found diferentially expressed regarding the prolificacy levels. On the other hand, ovarian miR-146a-5p and miR-142-3p, involved in immune system processes and cellular homeostasis, were differentially expressed regarding prolificacy levels. Four predicted target genes (LRRK1, CCL8, CPEB2 and BAT1), located within confidence intervals for prolificacy QTL, are good candidate genes to be studied for QTL on litter size. Alternatively, we have designed a new RT-qPCR methodology, by using DNA primers to measure miRNA expression, which is highly specific, sensitive and accurate.

L'estudi de la variació genòmica ens pot ajudar a entendre la història demogràfica de les poblacions i els events de selecció que hi han influït. Normalment això es fa mitjançant els tests de neutralitat, una eina estadística que permet detectar desviacions de la neutralitat mitjançant la comparació dels resultats empírics obtinguts per un estadístic a partir d'una mostra d'ADN, contra una distribució neutra simulada d'aquest estadístic. Tot i això, aquesta metodologia té algunes limitacions, principalment relacionades amb (a) la variació a partir de la que treballa el test, (b)la metodologia d'ús dels estadístics de neutralitat, i (c) la tecnología emprada per obtenir informació de les seqüències d'ADN. En els quatre articles presentats en aquesta tesis he abordat tots aquests problemes. Respecte a la primera limitació he analitzat l'efecte que les desviacions de la neutralitat, com ara la recombinació i la demografia, tenen sobre el poder dels estadístics de neutralitat. Pel que fa a la metodologia, he estudiat si la incertesa en la reconstrucció de les dades de resequenciació té algun efecte en el poder dels tests quan aquests es comparen contra dades simulades. Finalment, els dos darrers treballs aborden els problemes que sorgeixen quan s'utilitzen genotips en lloc de dades de resequenciació, i proposen alternatives per a l'anàlisi d'aquestes dades. / The study of the genomic variation can give us insights into the demographic history of the populations and of the selective events acting upon them. This is usually approached by means of the neutrality tests, a statistical tool that can detect departures from neutrality by comparing the empirical results for a given statistic obtained from DNA samples against neutral, simulated distribution of this statistic. However, this methodology has some limitations, mainly related to (a) the variation the tests rely upon, (b) the methodology of the use of neutrality tests, and (c) the technology used to obtain information from DNA sequences. In the four papers included in this thesis I approach all these issues. For the first of the mentioned concerns, I have analysed how the power of neutrality statistics is affected by departures of neutrality such as recombination or demographic events. As for the methodology, I have estudied whether uncertainity in the reconstruction of resequencing data has any effect on the power of the tests when it is compared with simulation data. Finally, the last two works address the problems of using genotyping instead of resequencing data and propose alternatives to the analysis of such data.

El diagnòstic genètic preimplantaional (PGD) permet seleccionar, dins un programa de fecundació in vitro (FIV), embrions lliures d’alteracions cromosòmiques per a la transferència a l’úter matern. Actualment, la tècnica més freqüentment utilitzada per a aquesta finalitat és la hibridació in situ fluorescent (FISH), que tan sols permet analitzar de manera rutinària nou dels 24 tipus diferents de cromosomes existents. Una tècnica alternativa menys emprada és la hibridació genòmica comparada (CGH), que permet una anàlisi citogenètica completa de tot el cariotip. Aquesta metodologia, però, requereix un temps major que la duració del cicle de FIV per obtenir els resultats, de manera que els embrions analitzats s’han de criopreservar i transferir en un altre cicle addicional. L’objectiu d’aquest treball ha estat desenvolupar i aplicar una metodologia de CGH ràpida en què el temps d’hibridació s’ha reduït de 72 hores a 12 hores, de manera que no sigui necessària la criopreservació. Per a la seva posada a punt, s’han analitzat 32 fibroblasts aïllats de línies cel·lulars establertes (Coriel) amb alteracions cromosòmiques conegudes, el resultat de CGH ràpida dels quals ha confirmat en tots els casos la presència d’aquestes alteracions. Un cop desenvolupat el protocol de CGH ràpida, s’ha adaptat i validat per a l’anàlisi de blastòmers, emprant embrions descartats de casos de PGD mitjançant FISH amb nou sondes per als cromosomes 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X i Y (FISH-9-cr). Aquesta anàlisi ha posat de manifest que les discordances entre els resultats de la CGH ràpida i els de la FISH-9-cr són degudes principalment a l’existència de mosaïcisme, però també a errors de la FISH. La CGH ràpida també s’ha utilitzat per fer l’anàlisi de 22 embrions de pacients amb edat materna avançada descartats del PGD amb FISH-9-cr. Aquest estudi ha revelat la presència d’aneuploïdies (el 38,5% de les quals no s’haurien detectat mitjançant la FISH) i d’alteracions estructurals (en el 31,8% dels embrions), així com de mosaïcisme (en el 77,3% dels embrions) en els diferents blastòmers analitzats. Un cop demostrada la seva fiabilitat, la tècnica s’ha aplicat clínicament per al cribatge d’aneuploïdies en dos casos d’edat materna avançada, dos casos d’avortaments de repetició i un cas de fallades repetides d’implantació, en els quals s’ha obtingut una taxa d’implantació dels embrions transferits del 60%. Prèvia comprovació que la CGH ràpida era capaç de detectar desequilibris parcials de cromosomes amb un límit de resolució de 10-20Mb, aquesta metodologia s’ha aplicat en el PGD de portadors de translocacions cromosòmiques Robertsonianes (tres casos, quatre cicles de FIV-PGD), recíproques (dos casos, tres cicles de FIV-PGD) i un cas d’una doble translocació (tres cicles de FIV-PGD), en els quals s’ha obtingut un elevat èxit de diagnòstic i dos embarassos. En aquests casos, la CGH ràpida permet estudiar la segregació dels cromosomes implicats en la reorganització, alhora que la resta de cromosomes de la cèl·lula. La variant de CGH desenvolupada, doncs, permet estudiar tots els cromosomes de la cèl·lula i detectar-hi tant alteracions numèriques com estructurals en un sol procediment que, degut a la reducció del temps d’hibridació, és compatible amb la transferència en fresc dels embrions seleccionats. Per tant, la seva implementació pot incrementar la taxa d’implantació dels embrions transferits després del PGD. / Preimplantation genetic diagnosis (PGD) concurrent to in vitro fertilization (IVF) allows for the selection of embryos free of chromosomal abnormalities for transfer into the mother uterus. Nowadays, the technique most frequently used for this purpose is fluorescent in situ hybridization (FISH), which routinely allows for the study of only nine of the 24 existing chromosomes. Comparative genomic hybridization (CGH), although applied less frequently, is an alternative approach which permits a comprehensive cytogenetic study of the full karyotype. This method, nevertheless, requires a time greater than the length of the IVF cycle to get the results, so the embryos analyzed must be cryopreserved and transferred in a subsequent additional IVF cycle. The objective of this work was to develop and apply a short-CGH methodology in which the hybridization time is reduced from 72 hours to 12 hours, so that cryopreservation of biopsied embryos is no necessary. Thirty-two fibroblasts isolated from established cell lines (Coriel) with known aneuploidies have been used to develop the short-CGH protocol, obtaining results that confirmed the presence of these aneuploidies in all the studied cells. Subsequently, the method was adapted and validated for the analysis of blastomeres, using discarded embryos from PGD by FISH with nine probes for chromosomes 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X and Y (FISH-9-cr). The short-CGH analysis revealed that the discordances between short-CGH results and FISH-9-cr results are mainly due to the existence of mosaicism, but also to FISH errors. The short-CGH approach has also been used for the analysis of 22 embryos from advanced maternal age patients, discarded by FISH-9-cr PGD. This study detected aneuploidies (38.5% of which could not have been detected by FISH), structural errors (in 31.8% of the embryos) and mosaicism (in 77.3% of the embryos) among the analysed blastomeres. Once its reliability was proven, this technique has been clinically applied for aneuploidy screening in two advanced maternal age cases, two recurrent miscarriage cases and a repeated implantation failure case, allowing a 60% implantation rate. After checking that short-CGH is capable of detecting partial chromosomal imbalances with a resolution limit of 10-20Mb, this approach has been applied in PGD for chromosomal Robertsonian translocation carriers (three cases, four IVF-PGD cycles), reciprocal translocation carriers (two cases, three IVF-PGD cycles) and a double translocation carrier (three IVF-PGD cycles), in which high diagnosis rate and two pregnancies have been achieved. In these cases, short-CGH allows for the study of the chromosomes involved in the reorganization simultaneously to the analysis of the remaining complement chromosomes. In conclusion, the developed CGH variant permits the study of the full karyotype, detecting both numerical and structural chromosomal abnormalities in a single process that, due to the reduction of the hybridization period, is compatible with fresh transfer of the selected embryos. Therefore, its implementation may improve the implantation rate of the transferred embryos after PGD.

No description available.