Este trabajo de tesis se centró en tres ámbitos de gran interés social, económico y biomédico: envejecimiento, epigenética y ejercicio físico como estilo de vida saludable. Actualmente existe un patrón de pirámide poblacional cada vez más envejecido y la proporción de patologías asociadas a este proceso ha aumentado significativamente, convirtiendo al envejecimiento en uno de los principales ejes de la investigación científica actual. Además, los recientes hallazgos en el campo de la epigenética muestran la implicación de este tipo de regulación en la mayoría de procesos celulares y funciones biológicas. La modulación epigenética ejercida por el entorno y los hábitos de vida hacen de esta ciencia una de las más interesantes en la búsqueda de herramientas preventivas y terapéuticas de patologías crónicas y asociadas a envejecimiento. Asimismo, el ejercicio físico es uno de los factores de estilo de vida más estudiados y recomendados por las autoridades sanitarias a nivel mundial como hábito saludable. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis fue identificar marcadores de envejecimiento y su posible regulación epigenética mediante la práctica de ejercicio físico en el modelo murino de senescencia acelerada SAMP8 empleando como control la cepa SAMR1,. Observamos que los ratones SAMP8 presentan rasgos de inflamación crónica y alteraciones de factores de remodelación de cromatina durante todo su ciclo vital. El entorno proinflamatorio presente en los ratones senescentes se ha visto reflejado por el aumento de IL6 y por una respuesta exacerbada a LPS, debido al menos en parte a la reducción en la expresión del factor epigenético RCOR2. Además, se observó alteración en la expresión génica de diversos componentes remodeladores de cromatina, implicados principalmente en la regulación de los niveles de metilación de histonas. En concordancia con estos resultados, los ratones SAMP8 mostraron un aumento de histona H3 trimetilada en lisina 4 en linfocitos, hipocampo y corteza cerebral, lo cual sugiere que los mecanismos de regulación de metilación de histona H3 lisina 4, podrían ser la vía por la cual se establece la relación entre inflamación y envejecimiento en los ratones SAMP8. En cuanto a la modulación por ejercicio físico, se observaron beneficios derivados de la práctica a nivel fenotípico, neurovascular y transcripcional. En hipocampo, el aumento en los niveles de vascularización observado en los ratones SAMP8 se vio acompañado del aumento de factores neurotróficos como el Bdnf y otros componentes de su vía, Trkb y neuritina, implicados en fenómenos de plasticidad neuronal y neurogénesis. Por otro lado, la matriz extracelular mostró ser el compartimento más sensible al ejercicio físico. También se observaron cambios a nivel epigenético, concretamente en acetilación de histonas y microARNs asociados a desarrollo neuronal y enfermedades neurológicas. Todos estos datos apoyan el uso del ejercicio físico como terapia complementaria para la prevención y tratamiento del deterioro cognitivo y enfermedad de Alzheimer. / This thesis is focused on three major topics: aging, epigenetics and exercise. Nowadays, the molecular mechanisms of aging as well as the manifestation and progression of age-related pathologies is one of the main fields of biomedical research. Furthermore, epigenetics is an emerging and very promising science, as it has been described its involvement in most biological functions and seems to be modulated by genetic, but also environmental and lifestyle factors. Among them, exercise has been widely associated with cardiovascular and cognitive improvements and its positive impact on the promotion of health has been broadly accepted. In this context, the main objective of this thesis was to identify aging biomarkers and their epigenetic modulation by physical exercise in the accelerated senescence mouse model SAMP8. We have found that senescence mice exhibit features of chronic inflammation. We described an interplay between the down-regulation of the epigenetic factor RCOR2 and the increased of cytokine IL6 in SAMP8 mouse model. Moreover, changes in some chromatin remodeling factors mainly involved in the regulation of histone methylation levels and a consequent enhancement in trimethylation of histone H3 at lysine 4 were found in peripheral and nervous tissues of SAMP8 mice. These results suggest the involvement of epigenetic machinery in the relationship between inflammation and aging. Regarding the effects of physical exercise, phenotypic, neurovascular and transcriptional alterations were detected after the exercise intervention. An increase in vascularization levels in the hippocampus of SAMP8 mice was accompanied by changes in the expression of neurotrophic and neurogenic factors of the BDNF pathway. Furthermore, physical exercise reversed the transcriptional alterations present in SAMP8 mice for several genes involved in the establishment and maintenance of the extracellular matrix. Epigenetic changes were also observed after the exercise practice, specifically in histone acetylation and microRNAs that were previously associated with neural development and neurological disorders such as Alzheimer’s disease. As a whole, the findings presented in this thesis support the use of moderate physical activity as a complementary therapy for the prevention and treatment of cognitive impairment and Alzheimer's disease.

Aquest treball parteix de la premissa que els processos de diferenciació cel·lular i tumorigènesi impliquen vies de senyalització i programes relacionats i que l’estudi dels canvis epigenètics subjacents a ambdós processos pot contribuir a un millor coneixement dels mecanismes i factors que determinen el destí i funcions cel·lulars. L’estudi dels patrons epigenètics en aquests processos s’ha realitzat a diferents nivells: escala genòmica, regions regulades conjuntament en càncer (Silenciament Epigenètic de Gran Abast, LRES) i a nivell individual. L’estudi dels patrons de metilació a escala genòmica mitjançant l’AIMS-Seq va permetre determinar que la diferenciació de l’intestí prim es caracteritza per lleus guanys de metilació que s’esdevenen majoritàriament en les regions contigües a illes CpG promotores (CpGi shores) associades a gens implicats en el desenvolupament, regulació de l’expressió i càncer. La gran majoria d’aquests gens no s’expressaven en intestí, estaven hipermetilats en adenomes de ratolins Apcmin/+ i en la línia cel·lular colorectal murina CT26. Els estudis d’expressió gènica amb microarrays revelaren una sobreexpressió en adenomes dels gens involucrats en comunicació cel·lular, angiogènesi i migració, que no es relacionà amb canvis en la metilació del DNA. Així doncs, es pot concloure que els gens implicats en desenvolupament, sovint poc expressats en teixit diferenciat, tendeixen a metilar-se tant en processos de diferenciació com en processos tumorals. Roman per determinar si aquesta tendència a hipermetilar-se durant la diferenciació té una repercussió funcional directa o és conseqüència d’un procés d’estabilització irreversible de la cromatina en un estat de silenciament gènic. Per tal d’analitzar la dinàmica del LRES en diferenciació i càncer van ser claus: el model de diferenciació in vitro de les cèl·lules d’adenocarcinoma humà CaCo2 a cèl·lules amb fenotip d’enteròcit, on s’observà la reversió del LRES; i la determinació que el LRES és un mecanisme conservat en càncer colorectal murí (CT26), fet que va permetre l’ús del ratolí com a model d’estudi. Els adenomes inicials dels ratolins APCmin/+ no mostraren LRES. En fases avançades, el LRES comportà la pèrdua dels subdominis de la regió (disminució de CTCF) i la infraexpressió gènica, essent el silenciament per metilació del DNA i l’adquisició de marques repressives de cromatina (H3K9me/3, EZH2) propis d’estadis més avançats de la carcinogènesi. Tot i que aquests gens tenien dominis bivalents de cromatina (H3K4me3 i H3K27me3) en teixit normal, la hipermetilació en cèl·lules tumorals no comportà una resolució de la bivalència (determinat per reChIP). A més, aquestes regions tendien a estar hiperactivades en cèl·lules progenitores de l’intestí i en adenomes benignes, suggerint la presència d’un possible mecanisme de protecció contra el silenciament regional en cèl·lules no malignes amb elevada capacitat proliferant. Finalment, ens vam interessar pel gen INH-βB, citoquina que dimeritza formant Activines. L'INH-βB està silenciat en càncer colorectal mitjançant LRES i la hipermetilació de la seva CpGi promotora està associada a una reducció de la supervivència del pacient. Els estudis funcionals (proliferació, migració i invasió) en línies cel·lulars colorectals no van demostrar que el silenciament d'aquest gen incrementés la malignitat cel·lular, suggerint que la seva associació amb agressivitat podria està relacionada amb l'extensió del fenomen LRES més que amb un efecte directe del silenciament del gen. Cal emfatitzar la necessitat d’implementar aquests estudis en altres línies cel·lulars i expandir l’anàlisi a altres funcions com són l’adhesió i la resposta a hipòxia per confirmar aquestes interpretacions. / This work is based on the fact that cellular differentiation and tumoral processes concern related pathways and that the study of epigenetic changes involved in both processes could contribute to a better understanding of the mechanisms and factors that determine the cellular fate and function. The analysis of the epigenetic patterns associated with these processes has been performed at different levels: genomic scale, regions regulated concomitantly in cancer (Long Range Epigenetic Silencing, LRES) and specific genes. Genomic methylation patterns throughout small intestine differentiation were analyzed by AIMS-Seq showing slight gains of methylation, mainly in regions contiguous to promoter CpG island (CpGi shores) of genes involved in development and cancer. The great majority of these genes were not expressed in intestine and were hypermethylated in Apcmin/+ mouse adenomas and in colorectal cell line CT26. Microarray analysis revealed that adenomas overexpressed genes implicated in cellular communication, angiogenesis and wound healing, although they did not present variations in DNA methylation. Therefore, genes involved in development, usually expressed at low levels in differentiated tissue, tend to be methylated during cellular differentiation and tumoral progression. It remains to be elucidated whether this tendency to hypermethylation during differentiation has a direct functional effect or it just implies a irreversible chromatin stabilization after genetic silencing. In order to analyze LRES dynamics during differentiation and cancer processes we worked with in vitro differentiation of the adenocarcinoma cell line CaCo2 to enterocyte-like population, in which LRES was reverted. Furthermore we determined the occurrence of the LRES mechanism in murine colorectal carcinoma (CT26), which let us to compare the mouse and human LRES processes. Initial adenomas from APCmin/+ mice did not show LRES. In advanced stages, LRES implied the loss of regional boundaries (CTCF) and transcriptional down-expression, being the silencing by DNA methylation and the acquisition of chromatin repressive marks (H3K9me2/3, EZH2) features of later stages of carcinogenesis. Although these genes presented chromatin bivalent domains (H3K4me3 and H3K27me3) in normal tissue, DNA hypermethylation in tumoral cells did not imply resolution of bivalent states (determined by reChIP). Moreover, these regions tend to be more transcriptionally active in intestinal progenitor cells and benign adenomas, suggesting that this elevated expression could be a possible protective mechanism against regional silencing in non-malignant cells with high proliferative capacity. Lastly, we were interested in INH-βB, a cytokine that dimerizes forming Activins. INH-βB is silenced in colorectal cancer by LRES and the hypermethylation of its promoter CpG island has been associated with a reduction of patient survival. Functional studies (proliferation, migration and invasion) in colorectal cell lines did not demonstrate that INH-βB silencing increases malign cell properties. Therefore, the association with aggressiveness could be due to the LRES extension instead of the direct effect of INH-βB silencing. In order to confirm this interpretation it is necessary to extend these functional studies to other cell lines and to investigate other functions, such as adhesion and response to hypoxia.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvtige (IDIBELL) / La sirtuïna 1 (SirT1), una desacetilasa depenent de NAD, promou la formació de l’heterocromatina facultativa (HF) desacetilant H4K16Ac, H3K9Ac i H1K26Ac i establint marcadors d’heterocromatina via interacció amb la histona metiltransferasa Suv39h1, un factor clau en l’organització de la cromatina. Però SirT1 també regula l’heterocromatina constitutiva (HC) depenent de Suv39h1 a través d’un mecanisme desconegut. Considerant la importància de l’HC en l’organització i estabilitat de la cromatina global, i les seves implicacions funcionals en l’envelliment i la durada de la vida, definir si i com SirT1 ajuda a mantenir l'estructura de l’HC podria ser per a determinar les conseqüències durant la resposta a l'estrès en l'estabilitat del genoma. Per aquest motiu, en aquesta primera part de la tesi, ens vam centrar en entendre la connexió entre SirT1 i l’estructura de l’HC a través de l’estudi de la relació entre SirT1 i Suv39h1, ja que com s’ha comentat anteriorment, aquesta relació és crucial per la formació d’HC. En el mecanisme que proposem entre SirT1 i Suv39h1 per entendre la relació funcional entre aquestes dues proteïnes a l’HC, SirT1 preserva l’estructura de l’HC a través de l’estabilització de Suv39h1 sota condicions d’estrès inhibint la poliubiquitinització, mediada per la ubiquitina lligasa E3 MDM2 (un factor molt important en el control de la resposta a estrès relacionat amb p53), a la lisina 87 del domini chromo de Suv39h1. Els nostres estudis suggereixen que l’augment dels nivells de Suv39h1 promou un augment de l’intercanvi d’aquest a l’HC. L’increment de la taxa de renovació de Suv39h1, observat al mutant K87 d’aquest, promou la integritat genòmica en condicions d’estrès genotòxic. Aquest mecanisme pot ser també molt important per l’HF en el contexte del programa d’expressió en resposta a estrès regulat per SirT1. Una altra proteïna molt important en l’HC, en el manteniment i formació d’aquesta, és la proteïna estructural HP1, de la qual s’han descrit tres isoformes en mamífers: HP1α, HP1β i HP1γ. Curiosament comparada amb SirT1, HP1 també s’uneix a la regió N-terminal de Suv39h1, però contràriament, té una forta localització a HC. Aquesta observació ens va portar a desenvolupar la segona part del projecte centrada en entendre si el mecanisme observat entre SirT1 i Suv39h1 estava conservat dins del cor estructural de l’HC a través de la relació entre Suv39h1 i les isoformes d’HP1. Conseqüentment, aquest estudi ens va dirigir cap a la caracterització del paper de cadascuna de les isoformes d’HP1 en el manteniment de l’estructura de l’HC. Les qual s’han considerat, excepte en aspectes molt concrets, força similars. Sorprenentment, tot i la similitut entre les tres isoformes d’HP1, vam aportar una regulació diferencial sobre Suv39h1. De les isoformes d’HP1 existents a mamífers, dues d’elles HP1α i HP1γ, augmenten els nivells de Suv39h1 a través de la seva unió i regulació a la regió N-terminal d’aquest, com hem vist amb SirT1, inhibint la degradació per ubiquitinització i conseqüentment augmentant l’intercanvi de Suv39h1. El mecanisme a través del qual no està clar. HP1β sembla tenir un paper com a reservori respecte la regulació de Suv39h1 en condicions normals. Les isoformes d’HP1α i HP1γ també semblen incrementar la renovació de Suv39h1 per tal de mantener una adequada estructura de l’HC. Específicament, l’HP1β sería necessària en aquest augment sota l’efecte de l’estrès per garantitzar la integritat del genoma. Tenint en compte el coneixement de l’HC, que és mínim, els nostres estudis s’han centrat en entendre l’estructura, a través de la caracterització del paper de les isoformes d’HP1, en condicions normals i d’estrès. Proposem un model en el qual situaríem predominantment HP1α, però també HP1γ, formant homo i heterodímers, en diferents regions del foci d’HC limitant l’expansió de la marca d’H4K20me3. En aquesta regió, Suv39h1 uniría a HP1α i a HP1γ i aquestes l’estabilitzarien. I en el centre d’aquestes regions localitzaríem HP1β que tindria més afinitat amb Suv420h2 formant homo i heterodímers amb HP1γ. En absència d’HP1α, la modificació H4K20me3 s’expandiria provocant una compactació a la cromatina. / Sirtuin1 (SirT1) is a NAD dependent deacetylase that promotes the formation of facultative heterochromatin via interaction with histone methyltransferase Suv39h1, a key factor in the organization of chromatin. But SirT1 also regulates the constitutive heterochromatin (HC) depending Suv39h1 through an unknown mechanism. Considering the importance of the HC in the organization and stability of the global chromatin and its functional implications in aging and lifespan, define whether and how SirT1 helps keep the structure HC could be to determine the implications for the stress response in genome stability. In the proposed mechanism between SirT1 and Suv39h1 to understand the functional relationship between these two proteins in the HC, SirT1 preserves the structure of the HC through the stabilization of Suv39h1 under stress conditions inhibiting polyubiquitination mediated by MDM2 at lysine 87 of the chromo domain of Suv39h1. The increase in available Suv39h1 is associated with a faster renewal of the HC and increased protection of genomic integrity in these conditions. Another important protein in the HC, maintenance and training for this, which also binds to the N-terminal region of Suv39h1 is heterochromatin protein1 (HP1) which has a strong localization in HC. Therefore, we focused on studying the relationship between Suv39h1 and three HP1 isoforms found in mammals: HP1α, HP1β and HP1γ. Surprisingly, despite the similarity, we observed a differential regulation of Suv39h1. HP1α and HP1γ, increase the levels of Suv39h1 through its binding and regulation by the N-terminal region that inhibits degradation by polyubiquitination and consequently increasing the exchange of Suv39h1 to maintain an adequate structure of the HC. The mechanism through which is unclear. HP1β would be necessary, in this increase, under the effect of stress. This study led to the characterization of the role of each of the HP1 isoforms in maintaining the structure of the HC. We propose a model which would place predominantly HP1α, but also HP1γ in different regions of foci of HC limiting the expansion of the H4K20me3 mark. In this region, would interact Suv39h1. And the center, HP1β would have more affinity with Suv420h2, where also would find HP1γ.

High Throughput Sequencing technologies (HTS) are becoming the standard in genomic regulation analysis. During my thesis I developed software for the analysis of HTS data. Through collaborations with other research groups, I specialized in the analysis of ChIP-Seq short mapped reads. For instance, I collaborated in the analysis of the effect of Hog1 stress induced response in Yeast and helped in the design of a multiple promoter-alignment method using ChIP-Seq data, among other collaborations. Making use of expertise and the software developed during this time, I analyzed ENCODE datasets in order to detect active genomic enhancers. Genomic enhancers are regions in the genome known to regulate transcription levels of close by or distant genes. Mechanism of activation and silencing of enhancers is still poorly understood. Epigenomic elements, like histone modifications and transcription factors play a critical role in enhancer activity. Modeling epigenomic signals, I predicted active and silenced enhancers in two cell lines and studied their effect in splicing and transcription initiation. / Las tecnologías High Throughput Sequencing (HTS) se están convirtiendo en el método standard de análisis de la regulación genómica. Durante mi tesis, he desarrollado software para el análisis de datos HTS. Mediante la colaboración con otros grupos de investigaci n, me he especializado ́ en el análisis de datos de ChIP-Seq. Por ejemplo, colaborado en el análisis del efecto de Hog1 en células de levadura afectadas por stress, colaboré en el diseño de un m ́ todo para el alineamiento m ́ ltiple de promotores usando datos de ChIP-Seq, entre otras colaboraciones. Usando el conocimiento y el software desarrollados durante este tiempo, analicé datos producidos por el proyecto ENCODE para detectar enhancers genómicos activos. Los enhancers son areas del genoma conocidas por regular la transcripción de genes cercanos y lejanos. Los mecanismos de activación y silenciamiento de enhancers son aún poco entendidos. Elementos epigenómicos, como las modificaciones de histonas y los factores de transcripción juegan un papel crucial en la actividad de enhancers. Construyendo un modelo con estas señales epigen ́ micas, predije enhancers activos y silenciados en dos lineas celulares y estudié su efecto sobre splicing y sobre la iniciacion de la transcripción.

Antimicrobial Peptides have strong interest as a novel class of antimicrobial agents in the phytosanitary field. This Thesis focuses on the development of strategies to produce of BP100 derivatives (BP100ders) in genetically modified (GM) rice plant biofactories. The production of certain BP100ders using a strong constitutive promoter was toxic to the host plant and, impairing its viability. That phytotoxicity to the host was directly linked to the haemolytic activity of BP100ders. Transgenic plants were obtained that produced these peptides with yields up to 0.5% total soluble protein and retaining their antimicrobial activity. Through fusion to the DsRed fluorescent tag allowed tracing recombinant BP100ders in plants observing the accumulation in large vesicles derived from the endoplasmic reticulum. Through a strategy based on inducible promoters, particularly heat-shock, we showed that recombinant phytotoxic peptides can be produced in GM plants by using promoters that have minimal activities during transformation and regeneration of GM plants / Els pèptids antimicrobians són de gran interès com una nova classe d'agents antimicrobians en el camp fitosanitari. Aquesta Tesi se centra en el desenvolupament d’estratègies per a la producció de BP100ders en plantes d'arròs modificades genèticament (MG) com a biofactoria. La producció d’alguns BP100ders sota el control d’un promotor constitutiu fort va ser tòxica per la planta. Aquesta fitotoxicitat estava directament relacionada amb l'activitat hemolítica del pèptid. Es van obtenir plantes MG que els produeixen amb uns rendiments de 0,5% de proteïna soluble total i conservant l’activitat antimicrobiana. Mitjançant fusió amb la proteïna fluorescent DsRed es va observar l'acumulació dels BP100ders recombinants en grans vesícules derivades del reticle endoplasmàtic. Mitjançant l'estratègia basada en l'ús de promotors induïbles, concretament per temperatures elevades, es va demostrar que els pèptids fitotòxics poden ser produïts en plantes MG si els transgens que els codifiquen estan regulats per promotors amb una activitat basal mínima

Las enfermedades autoinmunes son enfermedades multifactoriales donde la genética, el sistema inmune y factores ambientales se encuentran relacionados. En muchas de ellas el Sistema Principal de Histocompatibilidad o HLA juega un papel importante. El HLA es un sistema molecular constituido por un conjunto de proteínas de membrana que son extraordinariamente polimórficas y que, debido a que se encuentran en una misma localización cromosómica con alto desequilibrio de ligamiento, se heredan en haplotipos. Su función principal es la presentación de péptidos a los linfocitos T, definiendo por ello el rechazo en el trasplante alogénico. Como consecuencia de estas características la determinación del polimorfismo HLA (tipificación HLA) es útil en diferentes campos biomédicos. Hay diferentes técnicas que permiten la definición de estos antígenos HLA a diferentes niveles de resolución. Por un lado se encuentran las técnicas de baja-media resolución como son las técnicas serológicas (microlinfocitotoxicidad) u otras basadas en la amplificación de DNA (PCR-SSP, PCR-SSO) y por otro las de alta resolución cuyo gold standard es la secuenciación (PCR-SBT). Esta aproximación junto con las nuevas metodologías de secuenciación (deep sequencing) ha hecho posible resolver los problemas de ambigüedades en la alta resolución. No obstante, en algunas ocasiones no es necesaria una tipificación HLA de alta resolución y por ello no está justificado el uso de una metodología tan costosa, sin embargo las técnicas de baja-media resolución, ampliamente utilizadas en los laboratorios de HLA, también presentan ciertas limitaciones. Este trabajo pretende abordar la complejidad del sistema HLA desde dos puntos de vista; primero explorando la asociación HLA (y otros genes no HLA) y enfermedad, concretamente en el caso de la celiaquía y de la enfermedad de Graves-Basedow y segundo definiendo una metodología de tipificación de baja resolución del locus A del sistema HLA mediante PCR a tiempo real. Para ello, se han puesto a punto técnicas de tipificación de familias de alelos HLA concretos como son HLA-DQ2/DQ8 para el estudio de la celiaquía y HLA-B*08/44 y HLA-C*03/07/16 en el caso de la enfermedad de Graves-Basedow, y en este último además se han estudiado polimorfismos en otros genes no HLA como son CTLA4 (una molécula de coestimulación inhibidora) y PTPN22 (una fosfatasa con funciones también inhibidoras). Con esto se ha pretendido desarrollar un conjunto de pruebas que nos permitan predecir mejor la susceptibilidad a padecer estas enfermedades y ver la correlación con otros parámetros clínicos post-diagnóstico. / Autoimmune diseases are multifactorial diseases where genetics, immune system and environmental factors are related. In many of them the Major Histocompatibility System (or HLA) plays an important role. HLA is a molecular system comprising a set of membrane proteins which are extremely polymorphic and, due to they are in the same chromosomal location with a very high linkage disequilibrium, are inherited in haplotypes. Its main function is the peptide presentation to T cells, thereby defining the allogeneic transplant rejection. As a result of these features, determine the HLA polymorphism (HLA typing) is useful in different biomedical fields. There are different techniques that allow the definition of these HLA antigens at different levels of resolution. On one side, low-medium resolution techniques like serological ones (microlymphocytotoxicity) or those based on DNA amplification (PCR-SSP, PCR-SSO) and in the other side, high resolution techniques, where sequence based typing (PCR-SBT) is the gold standard. This approach together with new sequencing methods (deep sequencing) has made possible to resolve the ambiguity problems in high resolution. However, sometimes a high resolution HLA typing it is not necessary and thus does not justify the use of a very expensive method, but low-medium resolution techniques, widely used in laboratories HLA also exhibit certain limitations. The aim of this work is to study the HLA system complexity from two points of view: first exploring the association HLA (and other non-HLA genes) with disease, particularly in the case of celiac and Graves' disease and second defining a low-resolution technique to HLA-A typing using real time PCR. For this purpose, we have developed different reactions to detect different allele families like HLA-DQ2/DQ8 (related with celiac disease) and HLA-B*08/44 and HLA-C*07/03/16 (in case of Graves' disease). Moreover, in Graves’ disease study there also have been studied polymorphisms in other non-HLA genes such as CTLA4 (costimulatory molecule inhibitor) and PTPN22 (a phosphatase inhibitor also functions). With all of this we have tried to develop a set of tests that allow us to better predict individual disease susceptibility.

Most evolutionary analyses are based upon pre-estimated multiple sequence alignment models. From a computational point of view, it is too complex to estimate a correct alignment, as it is to derive a correct tree from that alignment. Several works have recently reported on the influence of alignment on downstream analysis, and on the uncertainty inherent to their estimation. Chapter 1 develops the notion of alignment uncertainty as either inherent to the data (internal) or resulting from methodological biases (external). Chapter 2 presents two contributions of mine for the improvement of MSA methods through the use of homology extension (TM-Coffee) and thanks to an improved word-matching algorithm (SymAlign). In Chapter 3, I show how alignment uncertainty can be used to improve the trustworthiness of phylogenetic analysis. Chapter 4 shows how a similar improvement can be obtained through a simple adaptation of the T-Coffee transitive score, thus allowing downstream analysis to take into account internal alignment uncertainty. The final chapter contained a discussion of our current results and possible future work. / La mayoría de los análisis evolutivos están basados en modelos establecidos de alineamiento de secuencia múltiple. Desde un punto de vista computacional, es igual de complejo la estimación de un alineamiento correcto, como la obtención de un árbol correcto a partir del alineamiento. Recientemente varios trabajos han informado sobre la influencia del alineamiento en los análisis posteriores, y en la incertidumbre inherente a su estimación. El Capítulo 1 desarrolla el concepto de incertidumbre de alineación, tanto inherente a los datos (internos), como resultante de los sesgos metodológicos (externo). El Capítulo 2 presenta dos contribuciones mías para la mejora de los métodos de MSA a través del uso de la extensión de homología (TM‐Coffee) y gracias a un algoritmo de coincidencia de palabra mejorado (SymAlign). En el capítulo 3, se muestra cómo la incertidumbre de alineación puede ser utilizada para mejorar la confiabilidad del análisis filogenético. El capítulo 4 nos muestra como se puede obtener una mejora similar por medio de una simple adaptación de la puntuación transitiva del T-- Coffee, lo cual permite un análisis posterior para tener en cuenta la incertidumbre de alineación interna. El último capítulo contiene un análisis de los resultados actuales y los posibles futuros trabajos.

Durant el transcurs d’un rastreig a gran escala per RNA d’interferència (iARN) en Caenorhabditis elegans, el gen rsr-2 va ser identificat com a interactor genètic del gen lin-35 Retinoblastoma, l’homòleg de la família humana de Retinoblastoma. El gen rsr-2 és l’ortòleg de la proteina humana d’splicing SRm300/SRRM2. A diferència del seu ortòleg en llevat Cwc21, rsr-2 és essencial per la viabilitat. Degut a que la forta inactivació d’rsr-2 produeix uns fenotips molt severs, hem aprofitat l’efecte lleu que produeix l’ARN interferent a través de l’aliment per estudiar les funcions d’rsr-2 durant el desenvolupament. Els assatjos d’iARN d’rsr-2 juntament amb anàlisis d’epistàsia genètica situen rsr-2 en la via de la determinació sexual de la línia germinal. Tot i així, tiling arrays d’animals rsr-2(iARN) no han revelat defectes significatius en l’splicing. Gràcies a experiments d’immunofluorescència, hem observat que un anticòs específic per RSR-2 co-localitza amb cromatina en nuclis de cèl·lules de la línia germinal. Interessantment, experiments d’immunoprecipitació de cromatina i seqüenciació massiva (ChIP-Seq) han desvetllat que RSR-2 co-precipita cromatina seguint un patró similar al de l’ARN polimerassa II. Aquests experiments de ChIP-Seq també han fet palès que RSR-2 és reclutada a la cromatina d’un mode que és independent de l’splicing i suggereixen que RSR-2 podria desenvolupar un rol de regulador transcripcional. Addicionalment, hem explorat els transcriptomes d’animals rsr-2(iARN) i prp-8(iARN) en estadi de larva 3 (L3), fet que ens ha permès classificar rsr-2 com a un factor d’splicing no essencial. Conjuntament, el nostre estudi mostra que RSR-2 és una proteina multifuncional que regula el desenvolupament de Caenorhabditis elegans influenciant, i probablement acoblant, els processos d’splicing i transcripció. / During the course of a large scale interference RNA (RNAi) screen in Caenorhabditis elegans, rsr-2 was identified as a genetic interactor of lin-35 Rb, the homolog of human Retinoblastoma. The rsr-2 gene encodes the ortholog of the human spliceosomal protein SRm300/SRRM2. In contrast to its yeast ortholog Cwc21, rsr-2 is essential for viability. Since strong inactivation of rsr-2 produces severe phenotypes, we took advantage of the mild effect of RNAi by feeding to study functions of rsr-2 during development. rsr-2 RNAi assays and genetic epistasis analysis locate rsr-2 within the germ line sex determination pathway but tiling arrays of rsr-2(RNAi) animals do not disclose significant splicing defects. By inmunofluorescence, we observe that an antibody specific for RSR-2 co-localizes with chromatin in germ line nuclei. Interestingly, ChIP-Seq experiments reveal that RSR-2 co-precipitates chromatin in a pattern similar to that of RNA Polymerase II. These ChIP-Seq assays also evidenced a splicing-independent recruitment of RSR-2 to chromatin and suggest that RSR-2 could have a role in regulating transcription. Moreover, we have explored the transcriptomes of rsr-2(RNAi) and prp-8(RNAi) L3 worms by RNA-Seq, which classified rsr-2 as a non-essential splicing factor. Altogether, our study shows that RSR-2 is a multifunctional protein that regulates development by influencing, and probably coupling, splicing and transcription.

The main goal of this thesis was to help in the identification of genetic variants that are responsible for complex traits, combining both linear and nonlinear approaches. First, two one-locus approaches were proposed. The first one defined and characterized a novel nonlinear test of genetic association, based on the mutual information measure. This test takes into account the genetic structure of the population. It was applied to the GAW17 dataset and compared to the standard linear test of association. Since the solution of the GAW17 simulation model was known, this study served to characterize the performance of the proposed nonlinear methods in comparison to the linear one. The proposed nonlinear test was able to recover the results obtained with linear methods but also detected an additional SNP in a gene related with the phenotype. In addition, the performance of both tests in terms of their accuracy in classification (AUC) was similar. In contrast, the second approach was an exploratory study on the relationship between SNP variability among species and SNP association with disease, at different genetic regions. Two sets of SNPs were compared, one containing deleterious SNPs and the other defined by neutral SNPs. Both sets were stratified depending on the region where the polymorphisms were located, a feature that may have influenced their conservation across species. It was observed that, for most functional regions, SNPs associated to diseases tend to be significantly less variable across species than neutral SNPs. Second, a novel nonlinear methodology for multiloci genetic association was proposed with the goal of detecting association between combinations of SNPs and a phenotype. The proposed method was based on the mutual information of statistical significance, called MISS. This approach was compared with MLR, the standard linear method used for genetic association based on multiple linear regressions. Both were applied as a relevance criterion of a new multi-solution floating feature selection algorithm (MSSFFS), proposed in the context of multi-loci genetic association for complex diseases. Both were also compared with MECPM, an algorithm for searching predictive multi-loci interactions with a criterion of maximum entropy. The three methods were tested on the SNPs of the F7 gene, and the FVII levels in blood, with the data from the GAIT project. The proposed nonlinear method (MISS) improved the results of traditional genetic association methods, detecting new SNP-SNP interactions. Most of the obtained sets of SNPs were in concordance with the functional results found in the literature where the obtained SNPs have been described as functional elements correlated with the phenotype. Third, a linear methodological framework for the simultaneous study of several phenotypes was proposed. The methodology consisted in building new phenotypic variables, named metaphenotypes, that capture the joint activity of sets of phenotypes involved in a metabolic pathway. These new variables were used in further association tests with the aim of identifying genetic elements related with the underlying biological process as a whole. As a practical implementation, the methodology was applied to the GAIT project dataset with the aim of identifying genetic markers that could be related to the coagulation process as a whole and thus to thrombosis. Three mathematical models were used for the definition of metaphenotypes, corresponding to one PCA and two ICA models. Using this novel approach, already known associations were retrieved but also new candidates were proposed as regulatory genes with a global effect on the coagulation pathway as a whole.

La present tesi doctoral consta de 5 publicacions i un manuscrit en preparació que aprofundeixen en l'estudi dels mecanismes de lesió mitocondrial secundaris al contacte amb determinats agents tòxics pel mitocondri (mitotòxics) com el virus de la immunodeficiència humana (VIH), el tractament antiretroviral (TARV) administrat per tractar aquesta infecció, un antibiòtic anomenat linezolid, diferents tipus d'antipsicòtics i el monòxid de carboni (CO). Tots aquests estudis s'han realitzat sempre ex-vivo emprant mostres humanes.Molts agents mitotòxics poden induir una lesió mitocondrial similar a la característica de les malalties mitocondrials primàries (innates i genètiques) amb les que sovint comparteixen simptomatologia clínica. Si bé les mitocondriopaties primàries no són massa freqüents, gran part de la població està exposada a molts d'aquests agents mitotòxics, molts dels quals són fàrmacs habitualment emprats en la pràctica clínica.Els tres primers treballs tracten sobre la toxicitat mitocondrial del VIH i el TARV i pretenen establir mètodes menys invasius per determinar l'abast de la lesió mitocondrial i la reversibilitat de la mateixa. A través de l'estudi de la funció mitocondrial en teixit muscular, el primer dels treballs valida l'ús de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica com a model d'estudi de la funció mitocondrial en pacients VIH-positius que sota TARV desenvolupen una crisis d'hiperlactatèmia. Per això la resta de treballs s'han realitzat en cèl·lules mononuclears. Aquest estudi també valida l'aplicació d'un test d'esforç aeròbic de l'avantbraç, inicialment dissenyat per detectar disfunció mitocondrial primària (genètica), en el seguiment i diagnòstic de la disfunció mitocondrial secundària (tòxica) d'aquest tipus de pacients. Mitjançant tots aquests tests es determina que la funció mitocondrial en aquests individus es recupera un cop superat l'episodi d'hiperlactatèmia.El segon dels treballs determina la reversibilitat de la lesió mitocondrial induïda per un TARV de contrastada potència mitotòxica com són els dideoxinucleòsids quan són substituïts per un tractament teòricament menys lesiu pel mitocondri consistent en saquinavir potenciat amb ritonavir, tenofovir i enfuvirtide. Transcorreguts 6 mesos el canvi de TARV només aconsegueix una recuperació mitocondrial parcial amb una millora de la funció però no de la genètica (contingut en ADN mitocondrial o ADNmt) d'aquest orgànul.El tercer dels treballs avalua com la reducció de la dosi d'un dels components del TARV pot reduir la toxicitat mitocondrial d'aquesta teràpia. Concretament es valora la reducció de dosi de didanosina de 400 a 250 mg/d quan s'administra conjuntament amb tenofovir i nevirapina. Un any de tractament a elevades dosis d'aquest fàrmac disminueix el contingut en ADNmt i la funció mitocondrial en aquests pacients i l'administració consecutiva durant un altre any de la dosi reduïda de l'antiretroviral només permet una recuperació mitocondrial parcial que possibilita que es restableixi el contingut en ADNmt però no la funció d'aquest orgànul.El quart dels treballs avalua la toxicitat mitocondrial de l'antibiòtic linezolid en pacients que desenvolupen hiperlactatèmia associada al tractament prolongat amb aquest fàrmac. Estableix que el linezolid inhibeix la síntesi de proteïnes mitocondrials amb la conseqüent disminució de l'activitat enzimàtica de la cadena respiratòria d'aquest orgànul, malgrat l'augment en la taxa de transcripció mitocondrial (probablement en un intent infructuós d'augmentar la síntesi proteica bloquejada pel linezolid), i que aquesta podria ser la etiologia de la hiperlactatèmia associada a l'administració d'aquest antibiòtic. Totes aquestes alteracions són reversibles en retirar el fàrmac.El cinquè dels treballs estudia la toxicitat mitocondrial dels antipsicòtics, caracteritzada per la inhibició de la funció de la cadena respiratòria mitocondrial a nivell del complex I, i en el cas de l'haloperidol, a més a més, per l'augment de l'estrès oxidatiu. La capacitat mitotòxica dels antipsicòtics és proporcional al grau de manifestacions adverses de tipus extrapiramidal associades per a cadascun dels fàrmacs considerats (haloperidol > risperidona > clozapina), i podria ser doncs part de la base fisiopatològica responsable de l'aparició dels efectes secundaris. El sisè dels treballs (l'únic que no està publicat) empra l'estudi de la funció mitocondrial per avaluar les diferents opcions terapèutiques disponibles per tractar la intoxicació aguda per CO. El CO inhibeix la funció del complex IV de la cadena respiratòria independentment de la gravetat de la intoxicació, sense que augmenti el nivell d'estrès oxidatiu. En els intoxicats la funció mitocondrial es recupera al llarg del temps, de manera independent al tractament d'oxigen aplicat. Per tant, la recuperació de la funció mitocondrial només requereix una sessió d'oxigen hiperbàric per als intoxicats greus i l'oxigen normobàric per als lleus. Caldrà cerciorar aquests resultats un cop finalitzada la inclusió de pacients. / This thesis is composed by 5 articles and one manuscript on preparation which analyse the mechanisms of mitochondrial lesion induced by some mitochondrial toxic (mitotoxic) agents such as the human immunodeficiency virus (HIV), the antiretroviral treatment (ARVT) used to treat HIV infection, an antibiotic named linezolid, different antipsychotics and carbon monoxide (CO). All these studies have been performed on humans samples that have been analysed ex-vivo.Many mitotoxic agents induce mitochondrial lesion and clinical symptoms common to primary (hereditary or genetic) mitochondriopathies. Primary mitochondrial disorders are not much frequent on general population, but many people is exposed to mitotoxic agents, many of them, because are routinely drugs in clinical practice.The first three studies of the present thesis analyse mitochondrial toxicity of both HIV and ARVT to establish less invasive methods to study mitochondrial dysfunction and the reversibility of HIV and ARVT-induced mitochondrial damage. They have validated the use of peripheral blood mononuclear cells and the forearm aerobic effort test to study mitochondrial lesion in HIV-infected and ARV-treated patients. These studies have determined that mitochondrial lesion reverts after an hyperlactatemic episode and partially recovers after changing potent mitotoxic ARVT (dideoxynucleosides) by theoretically less mitotoxic drugs (saquinavir/ritonavir+tenofovir+enfuvirtide) or after reducing ARV doses (didanosine from 400 to 250 mg/d+tenofovir+nevirapine).The forth study analyses mitochondrial toxicity of linezolid in patients suffering from hyperlactatemia. It demonstrates that linezolid inhibits mitochondrial protein synthesis and respiratory chain function, albeit increased mitochondrial transcription rates (maybe as an homeostatic intent to upregulate linezolid inhibited translation), and that all these mitochondrial abnormalities revert with linezolid withdrawal.The fifth study analyses mitochondrial toxicity of antipsychotics, which inhibit mitochondrial complex I function, and in case of haloperidol, indeed, increases oxidative stress. Antipsychotic mitochondrial lesion is proportional to their capacity to induce extrapiramidal disorders (haloperidol > risperidona > clozapina). Maybe mitochondrial lesion could be partially responsible of clinical adverse manifestations.The sixth study (unique work not published) use mitochondrial function monitorisation to evaluate different therapeutic options to treat acute CO intoxication. CO binds to mitochondrial complex IV inhibiting its function, independent to intoxication severity, without increasing oxidative stress. In CO poisoning mitochondrial function is recovered along the time independent to oxygen treatment option. Thus, recover of mitochondrial function after CO intoxication only requires of one hyperbaric oxygen session for severe poisoned patients and normobaric oxygen for the moderate ones, although these results have to be validated with a bigger amount of patients.