In this thesis we developed two approaches to study positive selection and genetic adaptation in the human genome. Both approaches are based on applications of network theory. In the first approach, we studied how the signals of selection are distributed among the genes of a metabolic pathway. We use a network representation of the Asparagine N-Glycosylation pathway, and determine if given positions are more likely to be involved in selection events. We determined a different distribution of signals between the upstream part of this pathway, which has a linear structure and is involved in a conserved process, and the downstream part of the pathway, which has a complex network structure and is involved in adaptation to the environment. In the second approach, we applied a network representation of the set of genotypes observed in a population (Genotype Network) to next-generation sequencing data. The main result is a genome-wide picture of how the populations of the 1000 Genomes dataset have explored the genotype space. We found that the genotype networks of coding regions tend to be more connected and more expanded in the space than non coding regions, and that simulated sweeps have similar patterns compared to simulated neutral regions. / En esta tesis hemos desarrollado dos métodos para estudiar los patrones de selección positiva y adaptación genética en el genoma humano. Ambos métodos se basan en aplicaciones de teoría de redes. En la primera aplicación hemos investigado cómo las señales de selección están distribuidas a lo largo de una ruta metabólica. Hemos utilizado una representación de la ruta de N-Glicosilación, para estudiar si determinadas posiciones tienen más probabilidades de estar implicadas en eventos de selección positiva. Hemos comparado la distribución de las señales de selección entre la primera parte de la ruta metabólica, que tiene una estructura muy lineal y está involucrada en un proceso conservado, y la segunda parte de la ruta, que tiene una estructura de redes compleja y está involucrada en adaptación al ambiente. En la segunda aplicación hemos aplicado el concepto de redes de genotipos (Genotype Networks) a datos de secuencia de nueva generación. El resultado es un análisis completo de cómo las poblaciones de 1000 Genomas han explorado el espacio de genotipo. Las redes de genotipos de regiones codificantes suelen estar más conectadas y más expandidas que las regiones no-codificantes. Además, por medio de simulaciones hemos observado los patrones esperados para eventos de selección positiva.

El Diagnòstic Genètic Preimplantacional (PGD) utilitzant la hibridació in situ fluorescent (FISH) per identificar embrions cromosòmicament anòmals analitzant nou cromosomes ha permès incrementar les taxes d'embaràs en certs grups de pacients. Malgrat això, aquesta estratègia presenta certes limitacions, sent la més important el nombre de cromosomes que poden ser analitzats. En aquest treball hem avaluat la fiabilitat de la hibridació genòmica comparada (CGH) per a analitzar el complement cromosòmic sencer, com una alternativa al PGD utilitzant FISH. La CGH proporciona un anàlisi més complert del cariotip i per tant, permetria la transferència de només embrions cromosòmicament normals, que són els més idonis per produir un embaràs viable. La validació de la CGH s'ha realitzat avaluant la complementarietat entre els resultats obtinguts en els primers corpuscles polars (1CP) i els obtinguts en l'oòcit en metafase II (MII). S'han analitzat un total de 106 oòcits donats per 71 dones. En 81 casos s'ha analitzat tant la MII com el 1CP, mentre que en 25 casos s'ha analitzat tan sols un dels membres de la parella. L'eficiència de la CGH ha estat del 80,1% i la taxa de complementarietat del 87,4%. En alguns casos s'ha detectat una manca de complementarietat entre el 1CP i la corresponent MII, explicable per la existència d'un mosaïcisme gonadal en alguna d'aquestes pacients.La incidència d'aneuploïdies ha estat del 45,3%. S'han trobat un total de 80 aneuploïdies, afectant a gairebé tots els cromosomes tot i que en general, els cromosomes petits, tendeixen a mostrar-ne més.Pràcticament el 50% d'aquestes aneuploïdies corresponen a cromosomes que no són analitzats amb l'estratègia de FISH de nou cromosomes degut a que aquests cromosomes no són els responsables de descendència trisòmica viable o de la majoria d'avortaments espontanis. No obstant, les nostres dades indiquen que els errors per aquests cromosomes si deuen ser freqüents en el moment de la concepció però fallen en implantar causant una davallada en les taxes de implantació. Aproximadament un 37% de les parelles 1CP-MII aneuploides mostren errors de cromosomes no inclosos en el cribatge d'aneuploïdies que es realitza en l'actualitat i per tant haurien estat incorrectament diagnosticades com a normals en un PGD emprant FISH per a l'anàlisi de nou cromosomes.S'ha trobat una major proporció d'anomalies en el grup d'oòcits de dones d'edat avançada (60,7%), comparant amb el grup d'oòcits de dones sota els 35 anys (28%). Aquestes diferencies han estat estadísticament significatives. Per una altra banda, les tècniques de FISH i cenM-FISH s'han utilitzat també en aquest treball per a diferenciar les alteracions de cromosoma de les de cromàtida, ja que això no sempre és possible utilitzant CGH. Aquestes dues tècniques han indicat l'existència de dos mecanismes d'aneuploïdia, la separació precoç de cromàtides germanes (PSSC) (68,1%), i la no-disjunció de cromosomes homòlegs (31,9%). La fiabilitat de la CGH no només per a detectar canvis en el nombre de còpies de qualsevol cromosoma en 1CP i oòcits en metafase II, sinó també per a detectar segregacions desequilibrades de translocacions maternes ha estat demostrada. Això fa que la CGH pugui ser utilitzada en PGD de translocacions, per analitzar tan els cromosomes involucrats com els cromosomes no involucrats en la reorganització. Finalment, la CGH s'ha aplicat per a l'estudi de 1CPs en un PGD d'una dona d'edat materna avançada. Aquest protocol és compatible amb una transferència embrionària a dia +4, sense necessitat de congelar els embrions. En conclusió, els nostres resultant indiquen que l'estratègia ideal en un PGD hauria de comportar l'anàlisi de la totalitat de cromosomes ja que algunes aneuploïdies no incloses en l'anàlisi amb FISH poden ser, en realitat, freqüents en el moment de la concepció. / Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) using fluorescent in situ hybridization (FISH) to analyze up to nine chromosomes to identify chromosomally abnormal embryos has resulted in an increase of pregnancy rates in certain groups of patients. However, PGD using FISH has several limitations; the most important one is the number of chromosomes that can be analyzed. In this work we evaluate the reliability of using comparative genomic hybridization (CGH) to analyze the whole set of chromosomes, as an alternative to PGD using FISH. The more extensive analysis of the karyotype provided by CGH may allow replacement of only chromosomally normal embryos, which are those most likely to establish a successful pregnancy. The validation of the CGH was performed by the analysis of both, first polar bodies (1PB) and metaphase II oocytes (MII). A total of 106 oocytes donated by 71 women were analyzed. These oocytes correspond to 81 1PB-MII doublets and 25 cells without its partner. The CGH efficiency was 80.1% and the reciprocity rate between the 1PBs and the MIIs was 87.4%. In some cases we detected a lack of reciprocity between the 1PB and the MII results, which can be explained, in part, by the existence of a gonadal mosaicism in some of these patients.The aneuploidy rate was 45.3%. A total of 80 aneuploid events were found. In general, smaller chromosomes were more prone to aneuploidy although almost all chromosomes showed abnormalities. It is worth emphasizing that almost 50% of these aneuploidies correspond to chromosomes that are not analyzed with the nine-chromosome FISH approach for not being commonly involved in trisomic offspring or spontaneous abortions. Nevertheless, errors affecting these chromosomes may be common at conception but fail to implant, causing a decrease in the implantation rate. To date, 37.5% of the aneuploid doublets had aneuploidies affecting chromosomes not included in the current panels for aneuploidy screening. Consequently, they would have been misdiagnosed as normal in a PGD using FISH for 9 chromosomes. We have found a higher proportion of abnormalities in the group of older women (60.7%) compared to the group of women below 35 years old (28%). These differences are statistically significant. On the other hand, FISH and cenM-FISH analysis enable the distinction between chromosome and chromatid anomalies, which is not always possible using CGH. Using these two techniques, we have detected unequivocally two mechanisms of aneuploidy, revealing that as much as two thirds of the aneuploidy events (68.1%) were due to a premature separation of sister chromatids (PSSC), while only one third (31.9 %) were due to chromosome non-disjunction.Additionally, we have demonstrated the reliability of CGH not only to detect single copy number changes involving whole chromosomes in 1PB and MII oocytes, but also to detect unbalanced segregations of maternal translocations. This indicates that CGH could be used for PGD of maternal translocations, detecting also the presence of chromosome abnormalities involving other chromosomes different from those implicated in the rearrangement. Finally, we have applied the CGH to analyze 1PBs within a PGD of an advanced maternal age woman. This protocol was compatible with embryo replacement on day +4, without embryo freezing. In conclusion, our results strength the arguments for the complete karyotyping as an ideal PGD strategy, since aneuploidies affecting chromosomes that are not included in FISH analysis may be common at conception.

Durant la profase I meiòtica els cromosomes homòlegs s'uneixen mitjançant sinapsi formant els bivalents i intercanvien material genètic per recombinació homòloga. Al llarg de l'eix de sinapsi s'estructura el complex sinaptinemal (CS). Anomalies de la sinapsi i de la recombinació meiòtica s'han considerat com dos possibles causes de bloqueig total o parcial de la meiosi. L'objectiu general d'aquet treball és estudiar la incidència d'anomalies sinàptiques i de recombinació en individus controls i infèrtils per a caracteritzar diferents graus d'anomalies en aquests processos en la infertilitat idiopàtica.S'han processat biòpsies testiculars de set individus control i de tretze infèrtils. La detecció immunofluorescent de proteïnes de CS (SCP1 i SCP3) i de llocs de recombinació (MLH1) s'ha utilitzat por primera vegada en combinació amb un mètode de hibridació in situ fluorescent amb múltiples sondes subtelomèriques específiques (stM-FISH), que permet la identificació de tots els SCs d'una cèl·lula a paquitè.Les regions d'heterocromatina no centromèrica, 9qh, 1qh, 16qh i braços curts dels cromosomes acrocèntrics, han presentat una major incidència d'anomalies sinàptiques, indicant que són les últimes regions del genoma en fer sinapsi. La incidència d'anomalies sinàptiques en aquestes zones varia entre individus, fet explicable per polimorfismes d'aquestes regions en la població general. Anomalies sinàptiques en altres zones, aquelles que afecten a varis CSs en un mateix nucli o aquelles presents en estadi de paquitè tardà podrien indicar una afectació severa de la sinapsis. Els CSs dels cromosomes 15 i 21 s'associen més freqüentment al parell de cromosomes sexuals possiblement degut a l'homologia existent entre les regions heterocromàtiques d'aquests cromosomes i la del cromosoma Y.L'anàlisi de la recombinació meiòtica ha mostrat que la recombinació homòloga en el parell XY pot ser un indicador de la freqüència general de recombinació i de la progressió de la meiosi. Els resultats confirmen que una menor freqüència de recombinació pot augmentar el risc d'univalents a metafase I i que les diferències entre individus en aquesta freqüència podrien explicar la variabilitat en la freqüència d'aneuploïdies en espermatozoides humans. Els resultats de distribució de punts de MLH1 en cada CS i de les distancies entre aquests punts ens ha permès proposar un model de com es distribueixen aquests punts al llarg del CS.L'anàlisi de la longitud del CS ha mostrat que cada un dels braços del CS, de manera independent a l'altre, pot variar la seva longitud relativa en comparació a la longitud relativa dels cromosomes mitòtics. En el treball s'evidencia que aquesta variació de la longitud relativa pot reflectir la quantitat de fibres compactes i no compactes de cromatina presents a la zona.Finalment, la observació d'una cèl·lula tetraploide en estadi de paquitè, possiblement originada per endoreduplicació, demostra que la sinapsi i la recombinació meiòtica poden tenir lloc en aquestes cèl·lules en humans. A més a més, permet suposar que aquestes cèl·lules són un altre possible origen de espermatozoides diploides.Durant el transcurs d'aquest estudi s'ha caracteritzat citogenèticament un isocromosoma dicèntric Yq(p11.32) en mosaic en un individuo azoospermic, mitjançant FISH amb sondes específiques pel cromosoma Y. / During meiotic prophase I, homologous chromosomes are joined forming bivalents and they exchange genetic material by the processes of synapsis and crossing over. The synaptonemal complex (SC) appears along the synapsis axis. Synapsis and crossover anomalies have been considered as two possible causes of partial or total meiotic arrest. The general aim of this study is to analyse the incidence of synaptic and crossover anomalies in controls and infertile men in order to characterise different degrees of anomaly in these processes in idiopathic infertility.Testicular biopsies from seven controls and thirteen infertile men have been processed. Immunolabelling of SC proteins (SCP1and SCP3) and of DNA mismatch repair proteins present in crossover foci (MLH1) has been applied, for the first time, in combination with the seven-fluorochrome subtelomere-specific multiplex FISH assay (stM-FISH) in order to analyse synapsis and crossovers individually in each SC of a nucleus at pachytene.SCs regions with non-centromeric heterochromatin, 9qh, 1qh, 16qh and short arms of acrocentric chromosomes, have presented the highest incidence of gaps and splits, indicating that these are the last regions in the genome to synapse. Interindividual variability in the incidence of synaptic anomalies in these regions may be explained by polymorphisms of these regions in the general population. Synaptic anomalies in other SC regions, those affecting several SCs or present in late pachytene nuclei may indicate nuclei with a severely affected synapsis. Autosomal SC15 and SC21 associate with the XY pair more frequently than other SCs, possibly due to the homology between non-centromeric heterochromatins in the short arm of chromosomes 15 and 21 and in the q arm of chromosome Y.The analysis of crossovers shows that the amount of XY pairs with a crossover could be an indicator for general crossover frequency and for a successful meiotic process. Results confirm that reduction in the crossover frequency may increase the risk of achiasmatic small bivalents, and that interindividual differences in crossover frequency could explain the variability in the frequencies of aneuploidy in human sperm. How MLH1 foci are positioned within the SC is discussed based on detailed MLH1 foci distributions and interfoci distances.SC length analysis has shown that SC arms can be longer or shorter than the corresponding mitotic ones. Moreover, for a given SC, the variation in length found in one arm was independent of the variation observed in the other one. Evidence that the variation of the SC arm length may reflect the abundance of open and of compact chromatin fibres in the arm is shown.The finding of a tetraploid pachytene, possibly originated by endoreduplication, demonstrates that synapsis and crossover events can occur in these cells in humans. Moreover, it indicates that diploid sperm may also originate from tetraploid meiotic cells.During this study, a dicentric Yq(p11.32) isochromosome has been cytogenetically characterised in an azoospermic male by FISH using specific probes for chromosome Y.

L'anàlisi citogenètica del 1er corpuscle polar (1CP) permet una caracterització indirecta de l'oòcit en metafase II (MII) sense comprometre la seva capacitat reproductiva. Això permet, dins un programa de fecundació in vitro (FIV), desenvolupar una variant del diagnòstic genètic preimplantacional en la que s'analitza el 1CP (DGP-1CP).L'objectiu general d'aquest treball és estudiar la incidència d'aneuploïdia en la línia germinal femenina i en els primers estadis del desenvolupament embrionari.S'han utilitzat oòcits descartats de cicles de FIV per a desenvolupar una metodologia de hibridació in situ fluorescent (FISH) que permet detectar nou cromosomes en 1CPs i en MII. Fins ara, les absències de cromosomes o cromàtides en 1CP es consideraven artefactes però la valoració de la complementarietat 1CP- MII realitzada constata que només ho són una minoria (25,8%). Tant la freqüència d'aneuploïdia obtinguda per als nou cromosomes estudiats (47,5%) com el risc estimat d'aneuploïdia per els 23 cromosomes (57,2%) són molt elevats. El risc estimat de segregació anòmala per cromosoma analitzat és del 0,89%.S'han identificat diferents mecanismes de generació d'aneuploïdies en l'oòcit: separació precoç de cromàtides germanes (observada amb més freqüència al 1CP que a la MII) i no-disjunció de cromosomes homòlegs en la meiosi i segregació anòmala en la mitosi de l'etapa proliferativa de la línia germinal (mosaïcisme gonadal). Aquest fenomen s'ha detectat en un 25,7% de les pacients analitzades i fa recomanable el diagnòstic prenatal a les pacients que quedin gestants després d'un DGP-1CP.Aplicant DGP-1CP a dones amb cariotip normal (dones d'edat avançada), la incidència d'aneuploïdia per als nou cromosomes ha estat del 60,4%, corroborant a aquest grup com a grup de risc per la presència d'aneuploïdies. Aplicant-lo a dues pacients portadores de translocacions robertsonianes s'ha trobat una taxa d'aneuploïdia molt alta per als cromosomes no implicats en la translocació (91,7% i 72,7%), independentment de les alteracions observades per als cromosomes de la translocació. L'anàlisi d'aneuploïdies en blastòmers de pacients portadors i portadores de translocacions recíproques mostra un alt índex d'aneuploïdies de cromosomes no implicats en la translocació (60,3%) i també un alt percentatge de mosaïcisme (58,7%), tenint en compte tant els cromosomes implicats com els no implicats en la translocació. S'han trobat embrions normals o equilibrats per la translocació però aneuploides per altres cromosomes.Sembla necessari l'estudi seqüencial de la segregació dels cromosomes implicats en la translocació i de les aneuploïdies per altres cromosomes, en pacients portadors de translocacions.Per a validar la interpretació del resultat de la FISH en l'anàlisi d'aneuploïdia en cèl·lules proliferants, s'han estudiat cèl·lules en estadi de G0 (cèl·lules de Sertoli) i cèl·lules proliferants (limfòcits). En aplicar FISH en cèl·lules en proliferació s'estima que el 10,8% de dobles marques en excés trobades, en comparació amb les trobades en cèl·lules no proliferants, no són senyals partits, sinó deguts al procés de replicació. L'aplicació de FISH en cèl·lules en proliferació, com són els blastòmers, pot dificultar la interpretació dels resultats de FISH. Caldria incloure marcadors de l'inici o el final de la replicació per tal de ser usats simultàniament amb les sondes diagnòstiques de FISH en realitzar un DGP en blastòmers.El DGP per a la detecció d'aneuploïdies és un procediment més del que es disposa per tal d'oferir als pacients amb risc tot i que s'ha de valorar, en cada cas, si la seva aplicació pot ser beneficiosa. / Cytogenetic analysis of the 1st polar body (1PB) allows an indirect characterisation of the oocyte in the metaphase II stage (MII) without compromising its reproductive capability. This allows, in an in vitro fertilisation treatment (IVF), the development of a variant of preimplantation genetic diagnosis in which the 1PB is analysed (PGD-1PB).The aim of this study is to analyse the aneuploidy rate in the female germ-cell line and in its first embryo development stages.We have used oocytes discarded from IVF cycles to develop a fluorescent in situ hybridisation (FISH) method that allows for the detection of nine chromosomes in 1PBs and in MII. Until now, missing chromosomes or chromatids in the 1PB have been considered as artefacts but the evaluation of the 1PB-MII complement could proves that they are only a minority (25.8%). Both the aneuploidy rate found for the nine chromosomes analysed (47.5%) and the estimated risk of aneuploidy for the 23 chromosomes (57.2%) are very high. The abnormal segregation percentage per analysed chromosome is 0.89%.Different mechanisms for the generation of aneuploidies have been identified: predivision of sister chromatids (more frequently observed in 1PB than in MII) and non-disjunction of homologous chromosomes in meiosis I and altered segregation in mitosis during the proliferative stage in the germ-cell line (gonadal mosaicism). This phenomenon has been found in 25.7% of the analysed patients and makes the application of prenatal diagnosis in patients which become pregnant after a PGD-1PB advisable.When applying PGD-1PB in females with a normal karyotype (advanced maternal age), the aneuploidy rate for the nine chromosomes is 60.4%, corroborating this group as a risk group for the presence of aneuploidies. Applying it to two female carriers of Robertsonian translocations, a high aneuploidy rate for the chromosomes not implicated in the translocation has been found (91.7% and 72.7%), independently of the alterations observed in the chromosomes of the translocation.The analysis of aneuploidies in blastomeres of male and female reciprocal translocation carriers shows a high aneuploidy rate for the chromosomes not involved in translocations (60.3%) and also a high percentage of mosaicism (58.7%), including both the chromosomes implicated and not implicated in the translocation. Normal and balanced embryos for the translocation, but with aneuploidies for other chromosomes, have been found.In translocation carriers, the sequential analysis of the segregation of the chromosomes involved in the translocation and the aneuploidy screening for other chromosomes seems necessary, In order to validate the interpretation of FISH results in the aneuploidy screening of proliferating cells, G0 stage cells (Sertoli cells) and proliferating cells (lymphocytes) have been studied. When applying FISH in proliferating cells, 10.8% extra double-dots found, in comparison with the ones found in non-proliferating cells, are not splits but are due to the replicating process. The use of FISH in proliferating cells as blastomeres could make the interpretation of FISH results difficult. It would be necessary to include markers of the beginning or the end of replication to be simultaneously used with other FISH probes in PGD-analysed blastomeres.PGD for aneuploidy screening is another procedure which is available to be offered to patients at risk although it has to be evaluated, case by case, to determine if its application can be beneficial.

El primer corpúsculo polar (1CP) es una célula que acompaña al ovocito maduro (MII) y se produce como consecuencia de la primera división meiótica en la gametogénesis femenina. Ambas células tienen dotaciones cromosómicas complementarias y por ese motivo el 1CP puede informar indirectamente de la dotación cromosómica del correspondiente ovocito, sin que este pierda su capacidad reproductiva. Este hecho permite que en el marco de un programa de fecundación in vitro (FIV) se puedan biopsiar los 1CP y diagnosticar indirectamente los ovocitos, evitando la transferencia de embriones procedentes de ovocitos afectos de la anomalía genética o cromosómica estudiada. Este procedimiento se conoce con el nombre de diagnóstico genético preimplantacional mediante análisis de 1CP (DGP-1CP) y permite detectar alteraciones genéticas o anomalías cromosómicas de origen materno, en concreto de primera división meiótica.El objetivo general de este trabajo ha sido poner a punto un método de DGP-1CP mediante la técnica de análisis citogenético molecular conocida con el nombre de hibridación in situ fluorescente (FISH). Nos hemos centrado en la aplicación clínica del DGP-1CP en mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas y mujeres portadoras de translocaciones recíprocas.La metodología de obtención de extensiones cromosómicas de 1CP para realizar el análisis citogenético, se ha puesto a punto en un modelo animal (hámster, Mesocricetus auratus) y se ha adecuado a ovocitos humanos descartados de ciclos de FIV antes o después de su inseminación. Los Comités Éticos de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB) y del Centro de FIV correspondiente han aprobado el protocolo a seguir para realizar el presente estudio y los ovocitos han sido donados por pacientes cuando estaban llevando a cabo su ciclo de FIV.Se han elaborado dos series de parejas 1CP-MII procedentes de ovocitos humanos no inseminados y descartados post inseminación, y se ha demostrado que las dotaciones cromosómicas son complementarias. La tasa de aneuploidia ha sido nula para ovocitos no inseminados y de un 5,1 % en ovocitos descartados por no mostrar signos de fecundación. La concordancia en parejas 1CP-MII en ovocitos no inseminados ha sido del 100 % y del 95,1 % en ovocitos descartados post inseminación. También se han estudiado citogeneticamente, ovocitos inmaduros y cigotos humanos anómalos, descartados de ciclos de FIV después de su inseminación y donados por las pacientes. Tras el análisis citogenético mediante FISH, se ha demostrado que un 25,4 % de los complementos cromosómicos correspondientes a ovocitos inmaduros son euploides en estadio de metafase I y el resto son aneuploides. Se ha observado una mayor incidencia de aneuploidia en ovocitos inmaduros descartados post inseminación (88,2 %) que en ovocitos inmaduros no inseminados (47,1 %). En cuanto a los cigotos anómalos descartados de ciclos de FIV con inseminación convencional por tener más de dos pronúcleos, en todos ellos la ploidía correspondía al número de núcleos observado. Por el contrario los cigotos con un único pronúcleo pueden ser diploides (88,9 %) o haploides (11,1 %).Aplicando el DGP-1CP a cinco mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas y a cuatro mujeres portadoras de translocaciones recíprocas, y haciendo una revisión de los casos publicados hasta el momento, se ha hecho evidente que en mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas la frecuencia de ovocitos cromosómicamente normales o equilibrados para la anomalía estudiada es del 60 % y en mujeres portadoras de translocaciones recíprocas es del 40 %. Se ha evidenciado una correlación estadísticamente positiva entre la frecuencia teórica de puntos calientes de recombinación y la incidencia observada de no disyunción de cromosomas homólogos en mujeres portadoras de translocaciones recíprocas con mínimo nuevo ovocitos diagnosticados. / In females, the particular characteristics of the gametogenesis allow the indirect characterization of the chromosome constitution of the gamete through the study of the first polar body (1PB) and these presents an opportunity for germ line analysis. The 1PB contents a chromosome set complementary to that of the oocyte. Thus, the 1PB can be analysed to obtain information on the chromosomal constitution of the corresponding oocyte, which is maintained in culture.Preimplantation genetic diagnosis (PGD) using the first polar body is a modality of PGD that can be used when the woman is the carrier of a genetic disease or of a balanced chromosomal reorganization.Here, we describe a procedure to obtain 1PB chromosome complements and our experience based on the analysis by fluorescent in situ hybridization (FISH) of unfertilized or fresh human oocytes and non-inseminated control human oocytes, by fixing separately the 1PB and the corresponding oocyte, and on the study of nine clinical cases of PGD using 1PB biopsy (five Robertsonian translocations and four reciprocal translocations).The method was developed in an animal model (Syrian hamster). Human samples were donated by patients undergoing in-vitro fertilization (IVF) cycles. The Informed Consent Form and the protocol for the study were approved by the Ethics Committees of the Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) and the IVF Centre.In fresh oocytes, the chromosome morphology of the 1PB was well preserved, and the results were always concordant for each 1PB-oocyte pair. This indicates that the 1PB can be reliably used for the diagnosis of chromosome reorganizations. The frequency of aneuploidy was zero in fresh oocytes and 5.1 % in unfertilized oocytes.Moreover, we describe the study of immature oocytes and abnormal zygotes from IVF cycles. We observed that 25.4 % of the chromosome complements from immature oocytes, were euploid in metaphase I, and the rest of complements were aneuploid. We observed more aneuploidy in immature oocytes discarded post insemination (88.2 %) than in immature oocytes non-inseminated (47.1 %). The ploidy of all zygotes with more than two pronuclei was concordant with the number of nuclei observed. Nevertheless, the zygotes with only one pronucleus were 88.9 % diploids and 11.1 % haploids.Applying PGD-1PB to five female carriers of Robertsonian translocations and four carriers of reciprocal translocations, and reviewing the cases published, we observed that in women carriers of Robertsonian translocations robertsonianas and in women carriers of reciprocal translocations, the frequency of normal or balanced oocytes was 60 %, and 40 % respectively. In reciprocal translocation cases, published in the literature or studied by us, in whom at least nine oocytes had been diagnosed, a correlation has been found between the frequency of non-disjunction observed and the theoretical recombination rate.

El cerdo es la especie doméstica más importante económicamente, no solo por ser la principal fuente de carne en la dieta humana, sino también por su papel como modelo animal para la investigación biomédica. La buena compresión de los mecanismos moleculares que afectan a la calidad de la carne en cerdos es esencial para la obtención de carnes con un patrón saludable de ácidos grasos sin afectar el rendimiento productivo. La composición de ácidos grasos es un carácter muy importante para la calidad de la carne; no obstante, nuestro conocimiento sobre la compleja red de procesos y vías metabólicas que forman el metabolismo de los ácidos grasos sigue siendo limitado. Esta tesis tiene como objetivo general mejorar el entendimiento de estos procesos moleculares, con el fin de comprender mejor la arquitectura genética de la calidad de la carne en el cerdo. Se ha evaluado la implicación funcional de la variante DQ144454:c.2645GT presentó una alta asociación con la expresión del propio gen y el contenido de los ácidos palmítico y palmitoleico en músculo y tejido adiposo. Estudios funcionales del promotor del gen validaron la unión de SREBF1 y ERα, sugiriendo un papel importante de ambos factores de transcripción en la regulación del gen ELOVL6. Curiosamente, el SNP ELOVL6:c.-394G>A se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el SNP ELOVL6:c.-533C>T y también se encuentra localizado en el único lugar de unión de ERα en el promotor. Además, los estudios realizados permitieron observar una unión diferencial de ERα en función del genotipo del ELOVL6:c.-394G>A, mostrando su unión solo en los animales portadores del alelo G. La unión de ERα ha sido asociada al reclutamiento de metilasas y, consecuentemente, al aumento de los niveles de metilación de los motivos CpG adyacentes. Por lo tanto, las diferencias en la unión de ERα y en el grado de metilación del promotor pueden ser los factores causales de la menor expresión del gen en animales con el alelo G. Por este motivo proponemos el SNP ELOVL6:c.-394G>A como el principal SNP causal de las variaciones fenotípicas del QTL. Finalmente, el transcriptoma del tejido adiposo de cerdos fenotípicamente extremos para la composición de ácidos grasos en músculo fue secuenciado mediante RNA-Seq. Se realizó un análisis de expresión diferencial que permitió identificar 396 genes diferencialmente expresados que modulaban principalmente la lipogénesis, probablemente debido a las diferencias en el contenido de ácidos grasos poliinsaturados entre grupos. Este efecto de la composición de ácidos grasos sobre la expresión de genes lipídicos sugiere que los genes diferencialmente expresados pueden desempeñar un papel importante en el metabolismo de los lípidos y de los ácidos grasos. / Pig is one of the most economically important domestic species, since they have been extensively used not only as the major human meat source, but also for biomedical research. A good understanding of the molecular mechanisms affecting meat quality traits in pigs is essential for obtaining meat with a fatty acids profile more in line with public health recommendations without affecting the production yield. Food fatty acid composition is highly relevant for determining meat quality traits, but its metabolism is composed by a complex network of processes and pathways that are not fully understood. Elucidating these molecular processes is the general objective of this thesis, in order to better understand the genetic architecture of meat quality traits in pigs. We evaluated the functional implication of the genetic variant DQ144454:c.2645GT SNP, identified in the promoter region, was highly associated with its own gene expression and the percentages of palmitic and palmitoleic fatty acids in muscle and adipose tissue. Functional analyses of ELOVL6 promoter showed the occupancy of SREBF1 and ERα, suggesting an important role of both transcription factors on the regulation of ELOVL6 gene expression. Interestingly, the ELOVL6:c.-394G>A SNP is in linkage disequilibrium with ELOVL6:c.-533C>T SNP and also is located within the only predicted ERE on ELOVL6 promoter. In addition, ChIP assays showed that ERα binding depends on ELOVL6:c.-394G>A genotype, showing union only in animals carrying the G allele. It has been described that ERα binding causes the recruitment of Dnmts and, consequently, an increase on the methylation levels of the surrounding CpG motifs. Therefore, differences on ERα binding and the methylation pattern may be the causal factors of the lower ELOVL6 expression in animals with the ELOVL6:c.-394G allele. Hence, we proposed ELOVL6:c.-394G>A SNP as the major putative causal mutation for explaining the phenotypic variation of the QTL analyzed. Finally, the adipose tissue transcriptomes of two groups of phenotypically extreme pigs for intramuscular fatty acid composition were sequenced using RNA-Seq. Differential expression analysis identified 396 genes differentially expressed between groups. The major metabolic pathway differentially modulated between groups was lipogenesis, probably caused by the differences on PUFA content between the two groups. Therefore, the linked effect of fatty acid composition on lipid-related gene expression suggested that differentially-expressed genes may play an important role in lipid and fatty acid metabolism.

La presente tesis es una aportación al conocimiento de las bases genéticas de la criptorquidia no sindrómica y de las formas idiopáticas de espermatogénesis anómala. RXFP2 y ESR1 son dos genes candidatos en la etiología de la criptorquidia no sindrómica debido al rol del receptor RXFP2 en el control hormonal del descenso testicular y al posible papel del receptor ESR1 como mediador de los efectos de substancias capaces de interferir con el desarrollo del tracto urogenital masculino. La primera parte de la tesis está enfocada en el estudio del papel de dos variantes de estos genes en la etiología de la criptorquidia: la variante de secuencia p.T222P del gen RXFP2 (previamente descrita como una mutación patogénica causante de criptorquidia) y el microsatélite (TA)n del promotor del gen ESR1 estudiado por primera vez en relación con la criptorquidia. Para cada una de las variantes hemos analizado 550 sujetos de origen italiana y 570 de origen española (entre pacientes y controles). En la población española la variante p.T222P se ha encontrado en una proporción parecida de casos (1.6%) y controles (1.8%). Estos resultados indican que dicha variante genética es un polimorfismo común sin significado clínico en esta población. En cambio en la población italiana la frecuencia de la p.T222P ha resultado ser significativamente más alta en pacientes que en controles, lo que sugiere un posible papel para dicha variante como factor de riesgo para la criptorquidia. No hemos observado diferencias significativas en la distribución de los alelos (TA)n entre casos y controles. La frecuencia del genotipo A (supuestamente asociado a mayor actividad del promotor de ESR1) ha resultado ser parecida en casos y controles en ambas poblaciones de estudio. Estos resultados indican que el polimorfismo (TA)n no está asociado con la criptorquidia no sindrómica ni en población española ni en población italiana. La segunda parte de la tesis investiga el papel de variantes de número de copias (CNVs) en los cromosomas Y y X en la etiología de la espermatogenésis anómala. El estudio de las CNVs del cromosoma Y incluye: i) el análisis de más de 800 pacientes infértiles (mayoritariamente españoles) para las microdeleciones del cromosoma Y; ii) el estudio de deleciones y duplicaciones parciales de la región AZFc (estas últimas estudiadas por primera vez en población española) en 330 infértiles idiopáticos y 385 controles normozoospermicos de origen española. Nuestros datos basados en 27 portadores de microdeleciones clasicas del Y (3.3%) junto con una amplia revisión de la literatura indican que el diagnóstico genético de rutina para las microdeleciones del Y se podría limitar a varones con concentración espermática ≤2x106 /ml; ii) la técnica de recuperación espermática testicular más adecuada para los pacientes azoospérmicos portadores de deleciones AZFc es la microTESE; iii) el background del Y podría explicar en parte que las microedeleciones del Y si encuentren en diferente frecuencia en distintas poblaciones. Con respecto al estudio de los reordenamientos parciales en AZFc, hemos corroborado que las deleciones gr/gr (deleciones parciales AZFc) representan un factor de riesgo para la espermatogénesis alterada en población caucásica y hemos descartado que las duplicaciones AZFc contribuyan a esta anomalía. Para estudiar el papel de las CNVs del cromosoma X en la etiología de la espermatogenésis anómala, hemos analizado 199 sujetos con diferente concentración espermática utilizando un array de CGH de alta resolución específico para el cromosoma X. Hemos identificado 73 CNVs entre las cuales 29 perdidas (mayoritariamente raras) y 44 ganancias. El número de deleciones por sujeto y la cantidad media de DNA delecionado han resultado ser significativamente mayores en pacientes que en controles, lo que sugiere que un aumento de la “carga de deleción” podría estar implicado en la etiología de la espermatogenésis anómala. Tres deleciones recurrentes localizadas en Xq27.3 (CNV64) y en Xq28 (CNV67 y CNV69) han sido consideradas de mayor interés por su presencia exclusiva (CNV67) o prevalente (CNV64, CNV69) en el grupo de los pacientes. Dichas deleciones han sido objeto de un estudio profundizado que incluye: i) el screening de 627 infértiles idiopáticos y 628 controles normozoospérmicos de dos poblaciones mediterráneas (española e italiana); ii) la caracterización molecular de las deleciones; iii) la identificación de elementos funcionales afectados por las deleciones. Las CNV64 y CNV69 se han encontrado más frecuentemente en pacientes que en controles. La CNV69 presenta al menos dos patrones de deleción (tipo A y tipo B) de los cuales solo el tipo B ha resultado ser significativamente más representado en pacientes, indicando que este tipo de deleción podría ser responsable del efecto deletéreo de la CNV69 en la espermatogenésis. Las CNV64 y CNV69 no contienen genes en su interior pero podrían afectar una serie de elementos reguladores localizados <0.5 Mb. La CNV67, identificada únicamente en un 1.1% de los pacientes (p<0.01), podría directamente afectar el gen MAGEA9 y/o sus elementos reguladores. El análisis del pedigrí de dos portadores de CNV67 ha evidenciado que esta deleción es trasmitida por la madre. La condición de normozoospermico del hermano no portador de uno de los pacientes portador de CNV67 suporta el posible efecto patogénico de esta deleción en la espermatogenésis. Los resultados presentados en esta tesis suportan la visión que la etiología de la criptorquidia es probablemente poligénica y en la mayoría de los casos multifactorial. Es plausible que la aplicación de nuevas tecnologías de secuenciación masiva, garantizando un análisis más a gran escala del background genético del individuo, contribuyan a desenredar la complejidad de la etiología de esta enfermedad. Futuros estudios serán necesarios para corroborar el significado clínico de la CNV67 y confirmar, en otras poblaciones, la significativa asociación entre CNV64, CNV69 tipo B y espermatogenésis anómala. / The present thesis explores the role of specific genetic variants in the etiology of two forms of disturbed male reproductive fitness: non-syndromic cryptorchidism and idiopathic spermatogenic failure. The etiology of non-syndromic cryptorchidism, still largely unknown, is likely to be multifactorial reflecting the involvement of environmental and genetic factors. RXFP2 and ESR1 are interesting candidate genes due to the involvement of RXFP2 receptor in testis descent and the potential role of ESR1 receptor as mediator of substances able to interfere with the development of the male urogenital tract. The first part of the thesis presents the study of two genetic variants of RXFP2 and ESR1, aimed to explore their contribution to non syndromic cryptorchidism. These are the missense substitution T222P in exon 8 of RXFP2, previously proposed as a pathogenic mutation for cryptorchidism, and the VNTR polymorphism (TA)n within the ESR1 promoter, previously reported as a potential functional polymorphism in relation to bone mineralization and spermatogenesis and never studied so far in relation to cryptorchidism. Complessively 550 subjects from Italy and 570 from Spain (with and without history of cryptorchidism) were screened for each variant. The T222P was found at a similar frequency in both patients (1.6%) and controls (1.8%) in the Spanish population thus indicating that in this population it is a common polymorphism with no pathogenic effect. In the Italian study population the frequency of T222P was significantly higher in patients (p = 0.031) supporting a role for this variant as mild risk factor for cryptorchidism (OR= 3.17, 95% CI: 1.07–9.34). Nevertheless, the screening for this variant for diagnostic purposes is not advised because of the relatively high frequency of control carriers (1.4%). Two (TA)n genotypes (A and B) were defined based on the possible allelic combinations of high, medium or low number of repeats and their frequency was compared between cases and controls from the two study populations. Allelic distribution of (TA)n did not show significant differences between cases and controls. The frequency of genotype A, considered the functionally most active one, was also similar in cases and controls both in the Italian and Spanish study populations. These results indicate that the (TA)n within the ESR1 promoter is not associated with non syndromic cryptorchidism neither in the Spanish nor in the Italian population. The second part of the thesis explores the role of Y and X-linked Copy Number Variations (CNVs) in the etiology of spermatogenic impairment. The study of Y-linked CNVs includes: i) the retrospective analysis of 806 mainly Spanish infertile patients screened for Y microdeletions and ii) the study of partial AZFc deletions and duplications (the latter studied here for the first time in the Spanish population) including 330 idiopathic infertile patients and 385 controls from Spain. A total of 27/806 (3.3%) patients carried complete AZF deletions. All were azoo/cryptozoospermic, except for one whose sperm concentration was 1- 2x106/ml. This finding integrated with the literature suggests that routine AZF microdeletion testing could eventually include only men with ≤2x106/ml. In AZFc deleted men a lower sperm recovery rate was observed upon conventional TESE (9.1%) compared to the literature (60%-80% with microTESE) indicating that microTESE ensuring better outcomes, should be regarded as the best option. Haplogroup (hgr) E was the most represented among non- Spanish whereas hgr P among Spanish AZF deletion carriers supporting a potential contribution of Y background to the inter-population variability in deletion frequency. The gr/gr deletion was significantly associated with spermatogenic impairment, further supporting the inclusion of this genetic test in the work-up of infertile men, while partial AZFc duplications do not represent a risk for spermatogenic failure in the Spanish population. The present thesis addresses the topic of X-linked CNVs in spermatogenic defects by presenting the X-chromosome array-CGH (a-CGH) analysis of 199 men with different sperm count. A total of 73 CNVs were identified including 29 mostly rare losses and 44 gains. A significantly higher burden of deletions was found in patients compared to controls due to an excessive rate of deletions/person (0.57 versus 0.21, respectively; p =8.78x10-6) and to a higher mean sequence loss/person (11.79 Kb and 8.13 Kb, respectively; p = 3.43 x10-6). This finding suggests that an increased X chromosome deletion burden may be involved in the etiology of spermatogenic impairment. X-linked Cancer Testis Antigen (CTA) genes resulted to be frequently affected, indicating that their dosage variation may play a role in X-linked CNV-related spermatogenic failure. Three recurrent deletions, mapping to the Xq27.3 (CNV64) and Xq28 (CNV67 and CNV69), were considered of interest for their exclusive (CNV67) or prevalent (CNV64 and CNV69) presence in patients. These deletions were object of an in-depth analysis including: i) the screening of 627 idiopathic patients and 628 normozoospermic controls from two Mediterranean populations (Spanish and Italian); ii) the molecular characterization of deletions; iii) the exploration for functional elements. CNV64 and CNV69 were significantly more frequent in patients than controls (OR=1.9 and 2.2, for CNV64 and CNV69 respectively). CNV69 displayed at least two deletion patterns (type A and type B), of which type B, being significantly more represented in patients than controls, may account for the potential deleterious effect of CNV69 on sperm production. No genes have been identified inside CNV64 and CNV69, nevertheless a number of regulatory elements, have been found to be potentially affected. CNV67 deletion was exclusively found in patients at a frequency of 1,1% (p<0.01) thus resembling the AZF region of the Y chromosome. This deletion may involve the CTA gene MAGEA9 and/or of its regulatory elements. It may also affect regulatory elements of HSFX1/2 showing testis-specific expression. Pedigree analyses of two CNV67 carriers indicated that CNV67 deletion is maternally inherited. One of these families was especially informative since the pathological semen phenotype of the carrier versus his normozoospermic non-carrier brother was a strong indicator for a pathogenic effect of the deletion on spermatogenesis. The results of the present thesis are in line with the prevalent view that the etiology of nonsyndromic cryptorchidism is likely to be polygenic and in most of cases multifactorial. We are confident that high throughput technologies, especially next generation sequencing, will help to unravel the complexity of the etiology of this disease. We provide evidence for a significant association between recurrent X-linked deletions and impaired sperm production. Further studies in other ethnic-geographic groups are needed to confirm the association of CNV64 and CNV69 type B with spermatogenic failure. Due to the specific association of CNV67 with spermatogenic impairment a parallelism with AZF deletions of the Y chromosome is tempting. This CNV merits further investigation in order to provide a feasible substrate for fine molecular characterization, and to further evaluate its putative diagnostic value.

Aquesta tesi es centra en l’anàlisi genètica dels següents trastorns neurològics paroxístics pediàtrics: el torticoli paroxístic benigne del lactant (TPBL), l’hemiplegia alternant de la infància (HAI), la discinèsia paroxística cinesigènica (DPC) i el síndrome de la deficiència del transportador de glucosa GLUT1 (GLUT1DS); i en l’anàlisi genètica i epigenètica de la migranya, un trastorn neurològic paroxístic majoritàriament de l’adult. Els trastorns neurològics paroxístics pediàtrics analitzats són trastorns rars, poc estudiats, en els quals la simptomatologia i el patró d’herència han portat a sospitar-ne una base monogènica i un vincle amb el grup de les canalopaties neuronals. La dificultat en el seu estudi deriva, majoritàriament, de la manca de sèries importants de pacients de les quals se’n puguin obtenir conclusions extrapolables. L’interès d’aprofundir en el seu coneixement, a banda del propi interès científic, rau en trobar les causes que els originen i, així, poder trobar un tractament contra aquests trastorns, millorar la qualitat de vida dels pacients que els sofreixen i/o poder oferir consell genètic als familiars dels individus afectes. - El cribratge mutacional en 2 pacients afectes de TPBL ha identificat la mutació p.Glu533Lys en el gen CACNA1A com a causant de la malaltia, junt amb els estudis funcionals que indiquen que aquesta mutació provoca una pèrdua de funció de la proteïna codificada. - El cribratge mutacional en una cohort de 10 pacients d’HAI ha identificat 3 mutacions en el gen ATP1A3 (p.Asp801Asn, p.Glu815Lys i p.Gly947Arg) en 5 dels pacients, remarcant l’existència d’una heterogeneïtat genètica major de l’esperada en aquest trastorn. - El cribratge mutacional en la DPC ha identificat 3 mutacions diferents en el gen PRRT2 en 8 dels 10 pacients (c.649dupC, c.649delC i c.219_220delGA) descrivint per primera vegada tant la mutació c.219_220delGA com la presència de la c.649dupC i la c.649delC en un mateix pacient. - El cribratge mutacional en la GLUT1DS va permetre trobar mutacions de novo en el gen SLC2A1 en 3 dels 5 pacients analitzats: la c.667C>T, la c.710_711delGA i una deleció de tot l’exó 1; remarcant l’interès en cercar delecions GLUT1DS. La migranya és un trastorn neurològic primari molt prevalent que es manifesta amb crisis episòdiques i recurrents de mal de cap incapacitant. Els criteris de la International Headache Society subclassifiquen la malaltia en diferents subtipus, incloent la migranya sense aura (MO), la migranya amb aura (MA) i la migranya hemiplègica (MH). - El cribratge mutacional de la MH va permetre identificar 4 mutacions en el gen CACNA1A (p.Ser218Leu, p.Thr501Met, p.Arg583Gln i p.Thr666Met), 2 mutacions en el gen ATP1A2 (p.Ala606Thr i p.Glu825Lys) i la mutació p.Phe1661Leu en el gen SCN1A. - L’estudi d’associació genètica a nivell genòmic (GWAS) de la MO va permetre la identificació de 2 SNPs associats a MO, un localitzat en el gen MEF2D i l’altre proper al gen TGFBR2. També es van trobar SNPs que suggerien una tendència a la replicació en el gens PHACTR1 i ASTN2. A més a més, es van replicar els resultats obtinguts en un GWAS anterior, trobant novament associats a migranya els gens TRPM8 i LRP1. Aquest estudi va permetre identificar el primer loci d’associació a susceptibilitat a patir MO. - L’estudi epigenètic en un model de MA va permetre trobar diferències de metilació de l’ADN degudes al tractament amb àcid valproic o topiramat o a l’efecte de la depressió cortical propagant (DCP), el fenomen subjacent de l’aura, en gens que podrien estar relacionats amb la susceptibilitat a patir migranya. Els resultats podrien indicar que ambdós tractaments protegeixen davant les DCPs degut al seu efecte sobre la metilació de l’ADN, emfatitzant la importància dels mecanismes epigenètics en la susceptibilitat de la migranya. / This thesis is focused on the genetic analysis of the following neurological paediatric paroxysmal disorders: benign paroxysmal torticollis of infancy (BPTI), alternating hemiplegia of childhood (AHC), paroxysmal kinesigenic dyskinesia (PKD) and GLUT1 deficiency syndrome (GLUT1DS); and on the genetic and epigenetic analysis of migraine, a neurological paroxysmal disorder mainly found in adults. The neurological paediatric paroxysmal disorders analyzed are rare and present a simptomatology and an inheritance that suggest a monogenic origin and a link with the neuronal channelopathies. The lack of significant cohorts of patients from which obtain transferable conclusions makes it difficult to study them. The main interest of their study, besides the own scientific interest, is based on finding the underlying causes of the disorder which would be the first step to find the appropriate treatment, improve the quality of life of the patients and/or be able to offer genetic counselling to the patients relatives. The results of this study are resumed below: - The mutational screening in 2 patients of BPTI identified the p.Glu533Lys mutation in the CACNA1A gene as the genetic cause of this disorder, in line with the functional studies that indicate that this mutation induces a loss-of-function of the coding protein. - The mutational screening in a cohort of 10 patients of AHC identified 3 mutations in the ATP1A3 gene (p.Asp801Asn, p.Glu815Lys and p.Gly947Arg) in 5 patients, highlighting the existence of a greater genetic heterogeneity than expected in this disorder. - The mutational screening in PKD identified 3 different mutations in the PRRT2 gene in 8 out of 10 patients (c.649dupC, c.649delC and c.219_220delGA), describing for the first time the mutation c.219_220delGA and also the presence of both the duplication and the deletion in the c.649 position in the same patient. - The mutational screening in 5 patients of GLUT1DS identified de novo mutations in the SLC2A1 gene in 3 patients, specifically c.667C>T, c.710_711delGA and a deletion affecting the whole first exon, highlighting the interest in looking for deletions in GLUT1DS. Migraine is a common primary neurological disorder that presents with episodic and recurrent attacks of disabling headache. The criteria of the International Headache Society divide the disorder into different subclasses, including migraine without aura (MO), migraine with aura (MA) and hemiplegic migraine (HM). The results of the genetic and epigenetic studies of migraine are resumed below: - The mutational screening of HM identified 4 mutations in the CACNA1A gene (p.Ser218Leu, p.Thr501Met, p.Arg583Gln and p.Thr666Met), 2 mutations in the ATP1A2 gene (p.Ala606Thr i p.Glu825Lys) and the mutation p.Thr501Met in the SCN1A gene. - The genome wide association study (GWAS) of MO identified 2 SNPs associated with MO, one in the MEF2D gene and the other close to the TGFBR2 gene. There were SNPs that showed suggestive evidence of replication at PHACTR1 and ASTN2 genes. Moreover, previous GWAS findings were replicated, finding the genes TRPM8 and LRP1 associated with migraine. This study allowed the identification of the first loci associated with MO. - The epigenetic study in a MA rat model identified DNA methylation differences due to the administration of valproate and topiramate drugs and/or due to the cortical spreading depression (CSD) effects in genes that could be related to the migraine susceptibility. These results could indicate that both treatments protect against CSD due to their effects on DNA methylation, highlighting the importance of the epigenetic mechanisms in the migraine susceptibility.

El complexos SWI/SNF són remodeladors de cromatina dependents d’ATP que es troben altament conservats al llarg de l’evolució. Aquests complexos poden regular l’accessibilitat a una zona genòmica alterant l’estat de la cromatina i actuant com a reguladors transcripcionals. A més d’una subunitat enzimàtica central i diverses proteïnes que conformen el nucli, els complexos SWI/SNF incorporen subunitats accessòries que confereixen especificitat i varien segons el tipus cellular i el context del desenvolupament. Les poteïnes accessòries humanes BAF60a, BAF60b i BAF60c representen proteïnes paràlogues amb funcions especialitzades, de manera que mutacions en elles s’han relacionat amb diverses malalties (p. ex. càncer). Per tal de tenir una millor visió de les funcions de les unitats accessòries del complex SWI/SNF hem estudiat els paràlegs de les proteïnes BAF, codificades pels gens ham-3 i swsn-2.2. Hem investigat les funcions de ham-3 i swsn-2.2 en diversos teixits i processos del desenvolupament i hem observat que els dos gens són redundants en diversos contextos. Tot i així, i com ocorre amb els gens humans, HAM-3 i SWSN-2.2 també han adquirit funcions específiques. / SWI/SNF complexes are ATP-dependent chromatin remodelers highly conserved through evolution. By altering the chromatin state, these complexes can regulate the accessibility of a given genomic region and thereby perform transcriptional regulation. Besides a central enzymatic subunit and various core proteins, SWI/SNF complexes incorporate accessory subunits that confer specificity to a given complex and vary depending on the cell type and developmental context. The human accessory proteins BAF60a, BAF60b and BAF60c represent paralog proteins with specialized functions, and mutations in the BAF60 genes are involved in human disease (e.g. cancer). To get closer insight in the functions of SWI/SNF accessory subunits, we studied C. elegans homologs of the BAF60 proteins, encoded by the paralog gene pair ham-3 and swsn-2.2. We investigated ham-3 and swsn-2.2 functions in various tissues and developmental processes and observed that the two genes act redundantly in many contexts. However, as their human counterparts, HAM-3 and SWSN-2.2 have also acquired specialized functions.

Durante las últimas décadas ha crecido el interés en cuestiones como qué nos hace humanos o cómo difiere a nivel molecular el cerebro humano del de nuestros parientes más cercanos. Se han podido identificar cientos de genes con diferencias de expresión entre el ser humano y otros primates no humanos. Sin embargo, es importante estudiar más en detalle estos genes para comprobar si realmente están involucrados en las características específicas de nuestro cerebro. Las trombospondinas son glicoproteínas extracelulares multiméricas que modulan las interacciones entre células y con la matriz extracelular y que se han implicado en la sinaptogénesis. Dentro de la familia de las trombospondinas, los genes de la trombospondina-2 (THBS2) y trombospondina-4 (THBS4) se expresan, respectivamente, alrededor de 2 y 6 veces más en la corteza cerebral humana en comparación con la de chimpancés o macacos. Para conocer las causas de estas diferencias de expresión, hemos llevado a cabo un análisis comparativo y funcional de la región promotora de THBS4 en humanos y en chimpancés. Hemos identificado y validado un sitio de inicio de transcripción (TSS) alternativo para THBS4 que se encuentra 44 kb aguas arriba del TSS de referencia y que genera una nueva isoforma de ARNm que podría haber aparecido más tarde durante la evolución. Para comparar los niveles de expresión de ambos transcritos se realizó RT-PCR cuantitativa en diferentes tejidos humanos y en muestras de corteza cerebral de 11 humanos, 11 chimpancés y 8 macacos. Curiosamente, la nueva isoforma de THBS4 se expresa principalmente en los tejidos cerebrales. Por otra parte, la diferencia de expresión entre humanos y primates no humanos para la isoforma alternativa son consistentes con la encontrada al analizar la expresión total de THBS4. Por tanto, el aumento de la expresión de THBS4 en el cerebro humano parece estar relacionado con una mayor transcripción a partir del promotor alternativo. Para evaluar la actividad de ambas secuencias promotoras en humanos y en chimpancés, hemos llevado a cabo ensayos con un gen indicador en diferentes líneas celulares humanas. Se han encontrado diferencias significativas entre los dos promotores, aunque en las líneas de neuroblastoma que utilizamos no existen diferencias significativas entre especies. Este resultado es consistente con la búsqueda de sitios de unión de factores de transcripción en la región del promotor alternativo, ya que sólo se detectaron tres posibles sitios de unión diferentes entre ambas especies. Se ha comparado también la metilación del ADN en una isla CpG situada aguas arriba de la nueva isoforma de THBS4 en 5 humanos y en 5 chimpancés, detectando niveles bajos de metilación en ambas especies. Basándonos en las predicciones informáticas disponibles y en experimentos piloto de ChIP-Seq, hemos buscado posibles enhancers que estén controlando el promotor alternativo de THBS4, pero no hemos encontrado ningún candidato fiable. Por último, en humanos, se ha visto que hay dos haplotipos de THBS4 diferentes que se encuentran mantenidos mediante selección equilibradora. Sin embargo, la comparación experimental de ambos no muestra ningún efecto del genotipo sobre la expresión de THBS4. Aunque no se ha conseguido identificar la causa concreta del incremento en los niveles de THBS4 en humanos, en base a nuestros resultados sugerimos que la expresión diferencial del gen podría estar relacionada con una secuencia potenciadora específica del cerebro que no hemos conseguido localizar. Comprender como se encuentra regulada esta posible secuencia potenciadora podría ser relevante para entender cuales son las consecuencias funcionales de las diferencias de expresión de THBS4 sobre la evolución del cerebro y, en última instancia, darnos pistas sobre como nos convertimos en humanos. / The last decades have seen a growing interest in what makes us humans and how the human brain differs from that of our closest relatives at the molecular level. Hundreds of genes with expression differences between human and non-human primates have been identified. However, it is important to study these genes in more detail to see if they are really involved in human brain characteristics. Thrombospondins are multimeric extracellular glycoproteins that modulate cell-cell and extracellular matrix interactions and have been implicated in synaptogenesis. Within the thrombospondin family, thrombospondin-2 (THBS2) and thrombospondin-4 (THBS4) show, respectively, a ~2-fold and ~6-fold upregulation in human cerebral cortex compared to chimpanzees and macaques. To analyze the causes of these expression differences, we have carried out a comparative and functional analysis of the THBS4 promoter region in humans and chimpanzees. We have identified and validated an alternative transcription start site (TSS) for THBS4 that is located ~44 kb upstream from the known TSS and generates a new mRNA isoform that might have appeared later that the reference one during evolution. To compare expression levels of both mRNAs, we performed quantitative RT-PCR in different human tissues and cortical regions of 11 humans, 11 chimpanzees and 8 macaques. Interestingly, the new isoform of THBS4 is expressed mainly in brain tissues. Moreover, expression differences between human and non-human primate cortex for this alternative isoform are consistent with those shown for total THBS4 expression. Increased THBS4 expression in the human brain therefore appears to be related to higher transcription from the alternative promoter. To evaluate the activity of both THBS4 promoter sequences we performed reporter assays from humans and chimpanzees in different human cell lines. We have found significant differences between both promoters, but not between species, in the neuroblastoma cell lines assayed. This result is consistent with the search for transcription factor binding sites (TFBS) in the alternative promoter region, which only detected three putative TFBS differentially predicted between both species. We also compared the DNA methylation in a CpG island upstream the new isoform in 5 humans and 5 chimpanzees detecting similar low methylation levels in all of them. Based in the computational predictions available online and ChIP-Seq pilot experiments, we searched for a putative enhancer region controlling the THBS4 alternative promoter without finding any reliable candidate. Finally, in humans, THBS4 has been associated to two different haplotypes that are maintained by balancing selection, but experimental analysis did not show any effect of the genotype over THBS4 gene expression. Although we have not been able to identify the ultimate cause of the increased THBS4 levels in humans, based on all our results we suggest that the differential gene expression might be related to a brain-specific enhancer sequence that has so far escaped our scrutiny. Understanding its regulation could be relevant to the functional consequences of THBS4 expression differences during human brain evolution and ultimately could give us clues of how we became humans.