El compost energètic que utilitzen les cèl·lules per realitzar les seves funcions biològiques bàsiques és l’ATP, produït a través de la respiració oxidativa mitocondrial. Durant aquest procés es produeixen de manera secundària espècies reactives d’oxigen (ROS) que són capaces d’atacar i danyar diferents estructures cel·lulars, entre elles el DNA. Si es produeix un desequilibri i les ROS generen dany considerem que la cèl·lula es troba condicions d’estrès oxidatiu. La present tesi doctoral aporta nous coneixements sobre els mecanismes de reparació del dany al DNA en fase replicativa i en condicions d’estrès oxidatiu. Està centrada en l’estudi de dos mecanismes de reparació del dany: la ruta de senyalització de l’Anèmia de Fanconi (FA) i l’acció de l’antigen de proliferació nuclear (PCNA). FA és una malaltia genètica rara i altament heterogènia causada per mutacions en 15 gens coneguts. Està caracteritzada per disfuncions al moll de l’os, susceptibilitat a càncer i fragilitat cromosòmica. Les cèl·lules FA presenten un defecte en la reparació dels enllaços creuats entre cadenes (ICLs) del DNA en fase replicativa. Les 15 proteïnes derivades actuen en una ruta de senyalització conjunta per la reparació dels ICLs. Es considera que la ruta està activada quan es produeix la monoubiquitinació de la proteïna central FANCD2. Fins l’actualitat no es coneix cap inductor de ICLs, tant endogen com exogen, que sigui capaç d’explicar el fenotip observat. En el present treball s’explora l’estrès oxidatiu endogen com una de les possibles causes per explicar el fenotip de FA. Es coneix que les cèl·lules FA presenten nivells elevats de la base oxidada 8-oxoG al DNA. Els resultats presentats aquí descarten un defecte en el processament de les lesions oxidatives per part de la ruta FA i, per tant, els nivells elevats de 8-oxoG en cèl·lules són deguts a una superproducció de dany. El dany oxidatiu indueix de manera secundària trencaments de doble cadena (DSBs) i es demostra un processament d’aquest tipus de lesió per part de la ruta FA. L’Atàxia telengectasia (A-T) és una altra malaltia genètica rara caracteritzada per un defecte en la reparació del DNA i causada per mutacions en la proteïna de control del cicle cel·lular i de resposta a dany ATM. A-T presenta certs trets característics comuns amb FA tals com els nivells elevats de 8-oxoG en cèl·lules i pacients. El nostre treball planteja un model comú entre FA i A-T en la reparació del dany oxidatiu: ATM fosforila FANCD2 al residu S222 en resposta a lesions secundàries induïdes pel dany oxidatiu tals com els DSBs per a l’establiment del punt de control del cicle cel·lular en fase S del cicle. Aquest fet podria explicar el perquè el fenotip dels pacients FA amb mutacions al gen de FANCD2 presenten una major severitat respecte la resta de pacients del grup central de FA. Així doncs, FANCD2 és una proteïna amb funcions duals en la resposta a dany oxidatiu: està involucrat en la reparació per se dels DSBs (monoubiquitinació) i intervé en el correcte establiment del punt de control de fase S del cicle cel·lular (fosforilació). L’última part del treball descriu una nova ruta de reparació del dany oxidatiu mitjançant la monoubiquitinació de PCNA depenent de fase replicativa del cicle cel·lular i de la lligasa d’ubiquitina RAD18. La monouibiquitinació de PCNA és un conegut mecanisme d’activació del procés de síntesi per translesió (TLS). Aquest procés està caracteritzat pel reclutament de les polimerases de TLS per a la síntesi de DNA circumval·lant la lesió. El treball proposa un model de la circumval·lació de les lesions oxidatives mitjançant la monoubiquitinació de PCNA i el reclutament de manera específica de la polimerasa de TLS DNA polι. / ATP is the molecular unit of currency of intracellular energy transfer. ATP is produced normally during the oxidative phosphorylation inside the mitocondria, the process induces by side effects reactive oxigen species (ROS) capable to induce damage to all cellular structures, including DNA. Cells have developed during evolution several mechanisms to control ROS damage. If these mechanisms fails, we consider the cell under oxidative stress conditions. The thesis sheds light on the DNA repair mechanisms in replicative phase of cell cycle under oxidative stress conditions. Is focused on the study of two DNA repair pathways: the Fanconi Anemia (FA) pathway and the role of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in response to oxidative insults. FA is a highly heterogenic rare genetic disease. Mutations in any of the 15 known FA gens cause FA. FA is characterized by bone marrow failure, chromosome fragility and increased cancer susceptibility. FA cells are sensitive to interstrand crosslinking (ICLs) agents. All 15 FA proteins cooperate in a common pathway to repair the ICLs lesions during replicative phases of cell cycle. We consider FA pathway activated when the central FA protein FANCD2 is monoubiquitinated in response to DNA damage. Until now, is not known any natural source of ICLs, either endogenous or exogenous, to explain FA phenotype. We tried to solve in the thesis if the endogenous oxidative damage could explain, at least partially, FA phenotype. Is known that FA cells present high level of the oxidated lesion 8-oxoG in their DNA. The results presented here discard a repair defect of FA cells in response to oxidative lesions such as 8-oxoG and other oxidative base lesions processed by BER. So and most probably, the high levels of 8-oxoG observed in FA cells are due to increase of 8-oxoG production rather than DNA repair defect of these kind of lesion. We showed here that DNA oxidative damage inducer H2O2 induces secondarily DNA double strand breaks and that this DNA lesion is processed by FA pathway. Ataxia telengectasia (A-T) is another rare genetic disease characterized by DNA repair defects caused by mutations in the cell cycle and DNA repair protein ATM. A-T shares some phenotypic common tracks with FA such as the increased levels of 8-oxoG in their DNA. Our work suggest a common and coordinated model between A-T and FA in response to oxidative damage inducer H2O2: ATM phosphorylates residue S222 of FANCD2 protein in response to DSBs induced by oxidative damage to correctly establish the cell cycle checkpoint in S-phase to repair the damage. This model could also explain why FANCD2 patients have more sever phenotype respect FA core complex patients. In summary, we showed here that FANCD2 has dual functions in response to oxidative damage inducer H2O2, is both monoubiquitinated through ATR and FA pathway and phosphorylated through ATM kinase for proper response to oxidative endogenous insults. The last part of the work describes a novel DNA repair pathway in response to oxidative damage mediated by PCNA and dependent on replicative phase of the cell cycle. PCNA is monoubiquitinated in response to oxidative DNA damage lesions by RAD18 ubiquitin ligase in a translesion synthesis (TLS) like process. Monoubiquitinated PCNA is then able to recruit TLS polymerases to bypass oxidative DNA lesions. We suggest here a putative and novel role for the unknown DNA polymerase iota to bypass such kind of oxidative lesions in an error free manner.

El Retinoblastoma és el tumor intraocular maligne més freqüent en l'edat pediàtrica, amb una incidència d'entre 1/16.000 i 1/25.000 nascuts vius. És hereditari en el 40% dels casos, amb una segregació de caràcter autosòmic dominant, i no hereditari en el 60%.Per a determinar si un pacient presenta la forma hereditària o no hereditària de la malaltia, cal un diagnòstic genètic, pel que l'objectiu principal d'aquest treball va ser l'establiment d'un protocol de diagnòstic addient.Es va realitzar un estudi citogenètic i d'hibridació in situ fluorescent, i un estudi molecular, utilitzant les tècniques de detecció directa de mutacions per PCR i digestió enzimàtica, la tècnica de SSCP, i la seqüenciació automàtica. Es va portar a terme d'altra banda un estudi indirecte per anàlisi de lligament, en famílies amb al menys dues generacions d'individus afectesA partir d'aquest treball s'han obtingut els resultats i conclusions següents:1.- Mitjançant l'estudi citogenètic s'ha detectat un 4,2% d'anomalies constitucionals que justifiquen el fenotip dels pacients2.- Mitjançant FISH s'han detectat mutacions constitucionals en el 14,3% dels individus estudiats, que justifiquen el seu fenotip3.- En l'anàlisi de lligament utilitzant els marcadors BamHI, XbaI, Tth 111 I, Rb1.20, i VNTR16 s'ha observat un percentatge d'heterozigots del 46,6%, 60%, 34,5%, 74,2% i 84,6% respectivamentLa utilització conjunta de cinc marcadors polimòrfics ha permès identificar l'al·lel del gen RB1 al que va lligada l'herència del retinoblastoma en les famílies estudiades4.- L'anàlisi dels exons 8 i 18, que contenen codons CGAarg, per digestió amb enzims de restricció, ha permès detectar mutacions en dos pacients (5%), caracteritzades per seqüenciació, i els resultats obtinguts estan d'acord amb el fenotip dels pacients 5.- El cribatge de mutacions mitjançant SSCP ha permès la detecció, en quatre pacients, de tres variants, (3,1%, 2,8%, 5,8% dels pacients estudiats per cada exó), caracteritzades mitjançant seqüenciació6.- La baixa incidència d'anomalies detectades mitjançant SSCP es justifica tant per l'alt percentatge de pacients amb retinoblastoma esporàdic unilateral i unifocal inclòs a l'estudi (35%), com per l'elevada heterogeneitat mutacional del gen RB1, i per la baixa eficiència del mètode.7.- El diagnòstic genètic mitjançant l'anàlisi de mutacions ha permès l'assessorament als familiars de risc, i oferir un diagnòstic prenatalL'anàlisi indirecta ha estat útil per a la detecció de portadors adults no afectes, i per a determinar la condició de no portadors de pacients en edat de risc, fet que els pot excloure de revisions oftalmològiques8.- La variabilitat clínica i l'heterogeneitat genètica de la malaltia, fan necessari utilitzar un protocol d'estudi genètic, tant per pacients amb retinoblastoma bilateral com unilateral, aplicable a la rutina clínica en termes de cost-benefici. / Retinoblastoma (Rb) is the most common intraocular tumour in children, with an incidence of 1 in 16.000-23.000 live births. Of all Rb-patients, 40% have a heritable predisposition; this form is inherited as an autosomal dominant trait, with high, but incomplete penetrance.In order to determine carrier status it's necessary to establish a test suitable for genetic diagnosis.Cytogenetic and fluorescence in situ hybridization analysis, as well as a molecular study of mutations by enzymatic digestion, SSCP and PCR sequencing were carried out. In patients with positive family history, we have employed intragenic polymorphic markers in a linkage analysisOur main results and conclusions are as follow:1.- Cytogenetic and FISH analysis allowed the detection of constitutional mutations in 4,2% and 14,3% of patients respectively2.- Segregation of disease-causing gene was followed by linkage analysis in all families studied3.- Enzimatic digestion analysis of exons 8 and 18 revealed mutations in two patients (5%), confirmed by sequencing, and related to patient's phenotype4.- Mutation screening by SSCP allowed the detection of three alterated patterns (3,1%, 2,8%, 5,8% of patients studied for each exon), all of them characterized by sequencing5.- The low frequency of mutations found in our study using SSCPis explained by the high percentage of unilaterally sporadic affected patients analyzed (35%), as well as by the wide spectrum of mutations affecting Rb gene, and by the low efficiency of SSCP6.- Direct detection of mutations has allowed genetic assessment of parents, and can be applied in prenatal screeningIndirect analysis has allowed unequivocal identification of gene carriers as well as exclusion of repeated ophthalmological examination of those individuals who don't carry the mutant gene. The study has been applied prenatally7.- Because of clinical and genetic heterogeneity, a procedure for genetic testing is required, both for bilaterally and unilaterally affected patients. This procedure needs to be applicable to clinic routine

Generalment s'ha pensat que la regulació de l'splicing alternatiu està controlada principalment per la interacció entre els factors reguladors de l'splicing i la taxa d'elongació de la ARN polimerasa II (RNAPII). Hi ha un evidencia emergent de la complexitat de la regulació de l'splicing alternatiu, que ara també inclou l'activitat d'ARNs no codificants i l'estat de la cromatina. Diverses experiments han demostrat que modificacions en les histones poden regular la inclusió d'exons alternatius, i que la taxa d'elongació de la RNAPII pot estar influenciada pels diferents estats de la cromatina. Els ARNs petits (sRNAs) són una família d'ARNs no codificants associats amb membres de la família de proteïnes Argonauta i són efectors de la via de silenciació gènica. Alguns sRNAs participen en una via alternativa anomenada via de silenciació gènica transcripcional (TGS). Evidències experimentals ha mostrat que els sRNAs interferents que s'uneixen a introns poden promoure l'aparició de modificacions en les histones que alteren la taxa de elongació de la transcripció provocant canvis en l'splicing alternatiu. Aquesta via és coneguda com via de silenciació gènica transcripcional acoplada a splicing alternatiu (TGS-AS). Tenint aixó en compte, nosaltres vam proposar que la proteïna Argonauta 1 (AGO1), podria induir la formació d'heterocromatina i canviar l'splicing alternatiu alterant l'elongació de la RNAPII. Per tal de realitzar una análisi a escala genómica de la regulació de l'splicing alternatiu, hem utilitzat dades provinents de noves tècniques de seqüenciació a gran escala, com ChIP-Seq i RNA-Seq. Hem trobat que hi ha regulació d'splicing alternatiu depenent d'AGO1. Els nostres resultats suggereixen que ARNs interferents endógens podrien estar relacionats amb aquesta regulació. A més, a la part final de la tesi demostrem que hi ha un codi de cromatina que requereix AGO1 que regula l'splicing alternatiu i que és específic per diferents tipus cel·lulars. Adicionalment hem trobat que altres efectors, com CTCF i HP1 alpha, també sòn importants per explicar els canvis en l'splicing dels pre-ARNs. Conjunatment amb altres treballs, aquesta tesis demostra que la regulació de l'splicing alternatiu implica la funció de molts components nuclears i probablement de molts altres que encara han de ser descoberts. / The regulation of alternative splicing has been generally thought of being primarily controlled by the interaction of splicing factors with the RNA molecule and by the elongation rate of the RNA polymerase II (RNAPII). There is an emerging understanding of the complexity of how alternative splicing is regulated which now involves the activity of non-coding RNAs and the chromatin state. Different experiments have shown that histone modifications can regulate the inclusion of alternative exons and that the elongation rate of the RNAPII could be influenced by different chromatin states. In this sense, small RNAs (sRNAs), which are a family of non-coding RNAs associated with members of the Argonaute family of proteins, that are effectors of the silencing pathway, which can participate in an alternative pathway known as transcriptional gene silencing (TGS). Experimental evidence shows that siRNAs targeting introns can induce chromatin marks that affect the rate of transcriptional elongation, affecting the splicing of pre-mRNAs, which is called transcriptional gene silencing alternative splicing (TGS-AS) \citep{Allo2009}. Thus, we proposed that the Argonaute protein (AGO1) could trigger heterochromatin formation and affect splicing by affecting RNAPII elongation. In order to perform a genome-wide analysis of the regulation of alternative splicing we used new highthroughput sequencing technologies as ChIP-Seq and RNA-Seq. We found that there is AGO1 dependent alternative splicing regulation, and our results suggest that endogenous sRNAs could be involved. Additionally, in the last part of the thesis we show a cell specific alternative splicing chromatin code, which also involves AGO1. Even though AGO1 regulation of alternative splicing was related to some specific cases, we found that other effectors, CTCF and HP1$\alpha$ were also important for the splicing changes decisions. This thesis and other recent reports show the regulation of alternative splicing as an integrated process,

La família B7 de proteïnes és àmpliament reconeguda per jugar un paper important en els processos inflamatoris mitjançant l'alteració de la capacitat de resposta de les cèl•lules T. La unió d’aquestes proteïnes als seus receptors situats a la superfície de cèl•lules T pot promoure (per exemple, B7-1, B7-2, ICOS- L) o inhibir (per exemple, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7x) l'activació, la proliferació, la maduració i la producció de citoquines en cèl•lules T . A més, s’ha identificat l’expressió de diversos membres d’aquesta família de proteïnes tant en diferents tipus de tumors com en el microambient tumoral. Degut a les capacitats immunosupressores de diversos membres de la família B7, es creu que l'expressió aberrant d'aquestes molècules a interferit negativament amb la resposta immune de l' hoste, el que porta a la progressió de la malaltia. En efecte, l'expressió de proteïnes de la família B7 en molts tumors hematològics malignes s'associa sovint amb un mal pronòstic i un comportament agressiu dels tumors. Actualment, diversos membres de la família B7, com CTLA-1 i PD-1 són usats per el tractament del càncer i, més recentment , el primer agent que focalitza la via de B7, el anti-CTLA-4 MAB (ipilimumab) ha estat aprovat per l'Administració d'Aliments i Medicaments (FDA) per al tractament del melanoma metastàsic. A més, els estudis en curs dirigits a membres recentment descrits de la família B7: B7-H3, B7x, B7-H6 són prometedors , però una major clarificació del seu paper patogènic en malalties hematològiques ajudarà a identificar el seu paper més actiu com a adjuvants immunes al tractament convencional. Tot i els grans grans progressos en aquest camp , es coneix poc de les proteïnes homòlogues butyrophilin-like (BTNL). La família butyrophilin (BTN) comparteix homologia estructural amb membres de la família B7 i similars a les proteïnes B7. Gairebé tots els BTNS / BTNLs estudiats fins al moment han demostrat ser capaços d'esmorteir la resposta immune mitjançant la co-estimulació negativa en l’activació del les cèl•lules T, fent-les candidates importants en la immunitat antitumoral. Per tant, en aquest estudi, caracteritzem un clúster que conté tres gens BTNL, situats al cromosoma humà 5q35.3, a nivell genòmic, transcripcional i funcional per obtenir una visió més clara en la funció de les proteïnes BTNL. En el primer capítol, presentem la identificació d’una deleció d’una variant en nombre de còpia (CNV en anglès) de 56 kb donant com a producte un nou gen quimèric (BTNL8*3). Aquesta deleció és responsable de la sobre-expressió del tercer gen del clúster, BTNL9. Posteriorment, es desenvolupà un assaig de genotipació i es va dur a terme un anàlisi poblacional d’aquesta variant en mostres de diferents poblacions pertanyents al HapMap i el panell de diversitat humana (HGDP-CEPH). Aquest assaig de genotipació ens va permetre identificar clares diferències en l’estratificació de l’aŀlel BTNL8_BTNL3-del entre grups continentals majors. A més, presentem tagging SNPs en diverses poblacions, facilitant una genotipació futura de la variant de deleció BTNL8-BTNL3. Finalment mostrem la influència de la deleció CNV en els nivells d’expressió de diferents gens involucrats en càncer i en la resposta immune, suggerint la involucració d’aquesta CNV en rutes biològiques específiques. En el segon capítol d’aquesta tesi s’investiguen les conseqüències funcionals de la CNV trobant una sobre-expressió de BTNL9 en leucèmia limfoblàstica aguda (ALL en anglès) després del subministrament de glucocorticoides (GC). S’havia mostrat ja prèviament que uns nivells elevats de BTNL9 correlacionen amb un elevat risc en pacients de ALL amb reorganització de MLL-AF4. Per comprovar si aquesta observació és deguda a la implicació de BTNL9 en apoptosi induïda per GC, es varen analitzar diferents línies ceŀlulars pre-B ALL trobant-se una clara correlació entre els nivells d’expressió de BTNL9 i resistència a GC en ALL amb reorganització de MLL i nivells més baixos en MLL en ALL germinal. Aquests resultats suggereixen un paper completament nou i inesperat de la proteïna BTNL que podrien resultar en el desenvolupament de inhibidors específics de BTNL9 per millorar la prognosi de ALL amb reorganització de MLL. En resum, en aquesta tesi proporcionem un anàlisi del clúster de gens humà BTNL. Identifiquem un nou gen de fusió BTNL8*3 amb implicacions potencials en rutes genètiques involucrades en la regulació i proliferació immune i mostrem una clara funció de BTNL9 en la resistència a GC el la leucèmia amb reorganització de MLL. Aquestes observacions proporcionen un nou coneixement sobre la família de gens BTNL i podria proporcionar la base per noves teràpies basades en BTNL9 en ALL amb reorganització de MLL. / In this thesis, we undertook a broad genomic, evolutionary, transcriptomic and functional analysis of a cluster containing three BTNL genes, namely BTNL8, BTNL3 and BTNL9, located on human chromosome 5q35.3. In the first chapter we report the identification of a 56 kb deletion copy number variant (CNV), which results in the formation of a novel chimeric gene, BTNL8*3, and leads to an upregulation in the expression-level of the third gene in the cluster, BTNL9. Next, we developed a genotyping assay and undertook a population analysis of this variant in several Hap Map and human diversity panel (HGDP-CEPH) populations. With this genotyping assay we could identify clear differences in the stratification of the BTNL8_BTNL3-del allele amongst major continental ethnic groups. In addition we report tagging SNPs in several population, facilitating the genotyping process of the BTNL8-BTNL3 deletion variant in the future. Moreover, we show an influence of the deletion CNV in the expression-level of several genes involved in cancer and immune response, suggesting an involvement of this CNV in specific biological pathways. In the second chapter we look for functional consequences of this CNV and found an upregulation of BTNL9 in acute lymphoblastic leukemia (ALL) after glucocorticoid (GC) treatment. Previously, it was shown that high-level BTNL9 correlates with high-risk in MLL-AF4 rearranged acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. To check whether this might be due to in involvement of BTNL9 in GC-induced apoptosis, we analyzed several pre-B ALL cell-lines and found a clear correlation between BTNL9 expression-level and resistance to GC in MLL rearranged ALL and at a lower level in MLL germ-line ALL. These results suggest a completely new and unexpected role for a BTNL protein and may led to the development of specific BTNL9 inhibitors to improve outcome of MLL rearranged ALL. Overall, we provide a comprehensive analysis of a BTNL gene cluster. We identified a new BTNL8*3 fusion-gene with potential implication in genetic pathways involved in immune regulation and proliferation, and show a clear function for BTNL9 in GC-resistance in MLL rearranged leukemia. This knowledge sheds more light on the BTNL family and may provide the basis for novel approaches using BTNL9 in MLL rearranged ALL therapy.

Patterns of human genetic diversity suggest that all modern humans originated from a small population in Africa that expanded rapidly 50,000 years ago to occupy the whole world. While moving into new environments, genetic drift and natural selection affected populations differently, creating genetic structure. By understanding the genetic structure of human populations, we can reconstruct human history and understand the genetic basis of diseases. The work presented here contributes to the ongoing effort to catalogue human genetic diversity by exploring populations that have been underrepresented in genetic studies. We use variations on the genomes of populations from Central Asia, the Near East, and North Africa to reconstruct the history of these populations. We find that climate change and geography appear to be major factors shaping genetic diversity. In addition, we identify recent cultural developments and historical events that have influenced admixture and gene flow between populations, leading to the genetic diversity observed in humans today. / Els patrons de diversitat genètica humana suggereixen que els humans van sorgir d’un petit grup a l’Àfrica que es va expandir ràpidament fa uns 50,000 anys per tot el planeta. En migrar cap a nous hàbitats, la deriva genètica i la selecció natural van afectar de manera diferencial les poblacions, generant una estructura genètica. Mitjançant la comprensió de l’estructura genètica de les poblacions podem reconstruir la història humana i entendre la base genètica de les malalties. Aquest treball contribueix a l’esforç continu de catalogar la diversitat genètica humana explorant poblacions poc representades en altres estudis genètics. Hem utilitzat variacions al llarg del genoma de poblacions d’Àsia Central, Orient Mitjà i el Nord d’Àfrica per tal de reconstruir la seva història. Hem observat que canvis climàtics i geogràfics semblen ser els factors principals que han modelat la diversitat genètica. A més, hem identificat esdeveniments culturals i històrics recents que afavorit les barreges i el flux genètic entre poblacions, generant la diversitat genètica observada avui en dia.

Los perros de raza Shar Pei tienen dos características fenotípicas propias de la raza que son las arrugas de la piel (ahora conocido como Hialuronosis Cutánea Hereditaria-HCH) y un desorden genético llamado Fiebre Familiar del Shar Pei (FSF) que se cree que es causada por un exceso de Ácido Hialurónico (HA). El origen genético se describe como una mutación reguladora (Variación Número de Copias- CNV) localizada upstream del gen que sintetiza HA (HAS2) en el cromosoma 13. Se construyó un modelo murino transgénico con mayor número de copias del HAS2 para emular y confirmar el fenotipo descrito en Shar Peis. Obtuvimos de manera exitosa 5 ratones transgénicos fundadores los cuales sirvieron para formar la colonia. Un total de 80 ratones de la F2 fueron incluidos en el estudio; 40 transgénicos (TG) (20 adultos y 20 jóvenes) y 40 tipo salvaje utilizados como control (20 adultos y 20 jóvenes). El análisis del fenotipo in vivo incluyó la inspección visual de posibles alteraciones en la piel (laxitud, pliegues, arrugas) y temperatura corporal (sistema basado implantación de microchip). Se determinó el número de copias (CN) utilizando el método de cuantificación relativa (2-ΔΔCt) con una RT-qPCR. El análisis post mortem incluyó hemograma completo, análisis de expresión de HAS2 en piel [utilizando el HAS2 murino endógeno como referencia y el HAS2constructo (transgen) como diana], histología de órganos parenquimatosos y piel además de la determinación de concentración de HA en suero sanguíneo. Después que se determinó el CN, los ratones TG fueron divididos en tres grupos: i) bajo CN: <20 copias, ii) medio CN: 21-69 copias y iii) alto CN: >70 copias. Aunque de manera exitosa conseguimos crear un ratón transgénico que expresaba HAS2, sobre producía HA y que en algunos aspectos semejaba el fenotipo de los Shar Peis, no pudimos emular la piel arrugada característica del Shar Pei ni tuvimos ratones con episodios febriles. Con todos estos resultados, es difícil sustentar el hecho de que el fenotipo de las arrugas de la piel del Shar Pei y el desorden febril sean consecuencia única de un aumento en la síntesis de HA. Los resultados obtenidos de los ratones transgénicos generados en esta tesis corroboran que quedan muchas preguntas respecto a las bases genéticas de HCH y FSF por contestar y que diferentes enfoques para averiguar el porqué de estas enfermedades son necesarios. Es por esta razón que analizamos otras vías de degradación de HA como la función del HAS2as, un gen que regula la expresión de HAS2, además de los Toll Like Receptors 2 y 4, sin encontrar cambios significativos. También reanalizamos datos de chip de Illumina, CanineSNP20 BeadChip (22.362 SNPs) para buscar regiones de homocigosis involucradas en el fenotipo del Shar Peis. Encontramos dos regiones de homocigosis en los CFA6 6 (40, 691, 228-51, 293, 708 CanFam2.0) y CFA 13 (23, 222, 643-27, 079, 420 CanFam2.0). Nuestros resultados indican un haplotipo específico característico de los Perros Shar Peis en el CFA6 el cual incluye dos genes (TNFR1 y MEFV) relacionados con la Fiebre Familiar Mediterránea en humanos y un CNV. Creemos que es importante considerar otras regiones en el genoma como la región del CFA6, la cual alberga muchos genes candidatos, para continuar indagando sobre las bases genéticas de estas enfermedades además de finalmente intentar confirmar si la HCH y la FSF están relacionados al compartir el mismo fondo genético o si son dos entidades distintas. / Shar Pei dogs have a breed defined wrinkled skin phenotype (now known as Hereditary Cutaneous Hyaluronosis-HCH) and a genetic disorder called Familial Shar Pei fever (FSF) which is thought to be caused by an excess in Hyaluronic Acid (HA). The genetic origin is described as a regulatory mutation (Copy number variation) located upstream of the HA synthesizing gene (HAS2) in chromosome 13. A transgenic mouse model with increased copies of HAS2 was constructed to emulate and confirm the phenotype described in Shar Peis. We successfully obtained 5 transgenic founder mice from which the colony was formed. A total of 80 F2 mice were included in the study: 40 Transgenic (TG) (20 adult and 20 young) and 40 wild type (WT) used as controls (20 adult and 20 young). Phenotype in vivo analysis included visual inspection of possible skin alterations (laxity, folds, wrinkles) and body temperature (microchip implant system). Copy number (CN) determination was performed using the comparative cycle threshold (CT) relative quantification method (2-ΔΔCt) with RT-qPCR. Post mortem analysis included complete blood count, skin HAS2 expression [using the endogenous HAS2 gene as a reference gene and HAS2 construction (transgene) as target], histology of parenchymal organs and skin and the determination of serum HA concentration. After CN determination, TG mice were divided into three groups: i) low CN: <20 copies, ii) medium CN; 21-69 copies and iii) High CN: >70 copies. Even though we successfully created a transgenic mouse which expressed HAS2, over produced HA and that in some aspects resembled the phenotype of Shar Pei dogs, we couldn’t emulate the Shar Peis characteristic wrinkled skin, nor did we have mice with febrile episodes. With all these results, it is difficult to sustain that the wrinkled skin phenotype and febrile disorder of the Shar Pei are only consequence of an increased synthesis of HA. Results of the transgenic mice generated in this thesis corroborate that many questions regarding the genetic basis of HCH and FSF remained to be answered and different approaches to insight on these diseases had to be used. Therefore we analyzed other HA degradation pathways such as HAS2as, gene which regulates HAS2 expression as well as HA degradation product routes (Toll Like Receptors 2 and 4) without any significant findings. We also reanalyzed data from the Illumina CanineSNP20 BeadChip (22.362 SNPs) to look for other regions involved in Shar Peis phenotypes. We have found two homozygosity regions in Shar Peis CFA 6 (40,691,228-51,293,708; CanFam2.0) and CF 13 (23,222,643-27,079,420; CanFam2.0). Our results denote a specific haplotype characteristic to Shar Pei dogs in CFA6 which includes 2 genes (TNFR1 and MEFV) related to Familiar Mediterranean Fever in humans and a CNV. We believe that it is important to consider other genomic regions such as that in CFA 6 which harbors many candidate genes to further inquire into the genetic background of these diseases as well as to finally confirm if HCH and FSF are related sharing a common genetic background or if they are two separate entities.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / Chromatin compaction is regulated by different factors, among them histone posttranslational modifications. There are different histone modifications, and among them, acetylation and methylation of lysine residues. Acetylation levels are regulated by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs), enzymes that catalyze addition and removal, respectively, of acetyl groups from histone lysine residues. Among the four classes of HDACs, the class III which correspond to the members of the Sir2 family or Sirtuins are quite unique. They participate in the response to a wide variety of stress stimuli through their requirement of NAD+ as a cofactor in their enzymatic activity. Mammals harbor seven Sirtuins (SirT1-SirT7). Among them, SirT6 is a nuclear protein involved in both genomic stability and metabolic homeostasis. Interestingly, SirT6 regulates the majority of these processes through an effect on chromatin, based on deacetylation of a histone mark, H3K9ac. However, the mechanism involved has not been fully characterized. In this work, we aim to study the consequences of SirT6 function in chromatin organization. We show that SirT6 overexpression induces gene silencing, which fits with the role of SirT6 as a repressor, shown by previous reports. Our studies show that SirT6 interacts with proteins or multi-protein complexes also involved in gene silencing, such as components of NuRD complex, or the HMTs EZH2, Suv39h1. However, we have focused the project in understanding the functional relationship between SirT6 and a H3K9-specific methyltransferases that we have identified as Suv39h1 and G9a. Suv39h1 trimethylates H3K9 and is essential in the establishment and maintenance of pericentromeric and telomeric constitutive heterochromatin. Interestingly, Suv39h1 was previously found to interact with SirT1 in the context of constitutive and facultative heterochromatin formation. Our work shows that the functional relationship between Suv39h1 and SirT6 is quite different from the already described between SirT1 and Suv39h1. SirT6 mediates a non canonical monoubiquitination in Suv39h1 in three conserved cysteines of the pre-SET domain. We have also identified SKP2 as the E3 ubiquitin ligase responsible of this monoubiquitination. SKP2 has a well-known role in promoting poliubiquitination and degradation of protein involved in G1/S checkpoint such as p21 and p27 and its levels are regulated during cell cycle progression. Our data show that SKP2 levels are also regulated by SirT6 through deacetylation, which in turn induce a double phosphorylation that prevents its degradation. Suv39h1 monoubiquitination is induced by double thymidine block and nocodazole treatments that arrest cells in G1/S phase and early mitosis, respectively. Furthermore, Suv39h1 monoubiquitination is induced by NF-kB pathway activation such as TNFa treatment, the overexpression of the NF-kB transcription factor RelA, or of the activator IKKa. Moreover, the promoter of the NF-kB global repressor, IkBa, is regulated by the interplay between Suv39h1, SKP2 and SirT6. Thus, upon activation of the pathway by TNFa treatment, SirT6 induces the Suv39h1 monoubiquitination through SKP2 activation and monoubiquitinated Suv39h1 is removed from the promoter allowing the transcription activation of IkBa by RelA. This novel model provides not only new insights in the regulation of NFkB pathway but also unveils new roles for SirT6, SKP2 and Suv39h1. / La compactación de la cromatina es regulada por diferentes factores entre los cuales destacan las modificaciones post-traduccionales de las histonas. Hay diferentes modificaciones de histonas entre ellas las desacetilationes y las metilaciones. Los niveles de acetilación están regulados por las histonas acetiltransferasas (HATs) y las histonas deacetilasas (HDACs), proteínas que añaden o quitan grupos acetil a las lisinas de las histonas, respectivamente. Los miembros de la familia Sir2 o de las sirtuínas constituyen la clase III de las HDACs y participan en respuesta a muchas formas de estrés. Entre ellas, está SirT6 que desacetila H3K9 acetilado para promover silenciamiento. En este proyecto mostramos que la sobreexpresión de SirT6 produce silenciamiento génico tal y como se había descrito previamente. Además, SirT6 interacciona con proteínas involucradas en silenciamiento génico como es el complejo NuRD y EZH2 y la metiltransferases de H3K9, G9a y Suv39h1. Suv39h1 trimetila H3K9 necesario para la estructura de la heterocromatina. Está caracterizada la interacción entre Suv39h1 y SirT1 en el contexto de formación de la formación de heterocromatina. La relación entre Suv39h1 y SirT6 es bastante diferente a la de Suv39h1 y SirT1. SirT6 media una monoubiquitinación no canónica en tres cisteínas conservadas del dominio pre-SET de Suv39h1. Entre las E3 ubiquitina ligasas que interaccionan con Suv39h1 y SirT6 como CHIP y CHFR, encontramos que la responsable de la monoubiquitinación de Suv39h1 es SKP2. Mostramos que los niveles de SKP2 están regulados también por SirT6 la cual desacetila SKP2 e induce su fosforilación evitando así su degradación. La monoubiquitinación de Suv39h1 es inducida con tratamiento de doble bloqueo y timidina, que paran las células en G1/S y mitosis temprana, respectivamente. Además, la activación de la vía de NFkB induce la monoubiquitinación de Suv39h1. La expresión del regulador negativo de la vía de NFkB, IkBa, está regulada por la interacción entre Suv39h1, SirT6 y SKP2 y bajo tratamiento con TNFa. SirT6 induce la monoubiquitinación de Suv39h1 a través de SKP2 y Suv39h1 monoubiquitinizado es desplazado del promotor permitiendo la activación de la transcripción de IkBa por RelA. Este modelo proporciona nuevas perspectivas de la regulación de la vía NFkB.

Numerosos estudios se llevan a cabo en todo el mundo para conocer las causas y el comportamiento del cáncer y aplicar este conocimiento a la mejora de la prevención, diagnóstico y tratamiento de las personas afectadas. Es en este contexto en el cual nuestro grupo pretende contribuir con estos objetivos, aportando nuevos conocimientos sobre los procesos involucrados en el desarrollo tumoral en el cáncer de tiroides en particular y en la carcinogénesis en general. El objetivo principal de este trabajo de tesis es estudiar la implicación de los genes WDR3 y TBX15 en el cáncer. El estudio de estos genes surge debido a que estudios previos llevados a cabo en nuestro laboratorio identificaron dos polimorfismos marcadores de la susceptibilidad al cáncer de tiroides en la región cromosómica 1p12, donde se encuentran estos genes. Además, esta región cromosómica ha sido asociada frecuentemente con numerosos tipos de cáncer. Uno de los polimorfismos identificados se encuentra en el intrón 24 del gen WDR3 y el otro en una región vacía de genes ubicada a 460 Kb del gen TBX15. La función de estos genes no ha sido completamente dilucidada, sin embargo, se ha propuesto que WDR3 estaría involucrado en la proliferación del ciclo celular a través de la interrupción de la biogénesis del ribosoma, además, varios estudios han mostrado una expresión irregular de las proteínas con motivos WD en determinados tipos de cáncer. Por otra parte, el gen TBX15, al igual que los demás miembros de la familia T-box, ha sido asociado a procesos del desarrollo, además, en los últimos años han surgido evidencias que indican una relación entre los genes T-box y la tumorigénesis, con efectos sobre la proliferación celular, invasión y metástasis. Es por ello que hipotetizamos que los genes WDR3 y TBX15 podrían estar relacionados con el cáncer. Numerosos estudios se llevan a cabo en nuestro laboratorio con el fin de dilucidar el papel de estos genes en la etiología del cáncer de tiroides en particular y también en el cáncer en general. En el presente trabajo de tesis realizamos un estudio de asociación de los genes WDR3 y TBX15 con la susceptibilidad al cáncer de tiroides y, seguidamente, analizamos su expresión y regulación principalmente en cáncer de tiroides y también en cáncer de colon y tumores cerebrales. El estudio de asociación del gen WDR3 con el cáncer de tiroides indica que este gen es un factor de susceptibilidad a este tipo de cáncer. Además, los análisis de expresión de WDR3 evidencian una sobre-expresión de este gen en el cáncer de tiroides y de colon. Los análisis de metilación de la región promotora de WDR3 indican que esta modificación epigenética no está involucrada en la regulación de la expresión de WDR3 a nivel transcripcional, sin embargo, el análisis de factores de transcripción de unión al promotor muestran que los factores c-Myc y CTCF actúan regulando la expresión de WDR3. Por otra parte, el estudio de asociación del gen TBX15 con el cáncer de tiroides indica que este gen no es un factor de susceptibilidad a este tipo de cáncer. Los análisis de expresión de TBX15 evidencian una expresión disminuida de este gen en el cáncer de tiroides. Los análisis de metilación de la región promotora de TBX15 en tejidos de tiroides y tejidos cerebrales, indican que esta modificación epigenética está involucrada en la regulación de la expresión de TBX15 a nivel transcripcional. El presente trabajo de tesis pone en evidencia el papel de los genes WDR3 y TBX15 en la etiología del cáncer de tiroides y sugieren su implicación en la carcinogénesis en general. / There are numerous studies dedicated to find out the causes of cancer and its progression and the application of this knowledge to improving the prevention, diagnosis and treatment. In this context our group contributes to these objectives, providing new insights into the processes involved in tumor development of thyroid cancer in particular and carcinogenesis in general. The main objective of this thesis is to study the involvement of the genes WDR3 and TBX15 in cancer. The study of these genes arises from studies conducted in our laboratory that identified two polymorphisms markers of thyroid cancer susceptibility in the chromosomal region 1p12, where these genes have been mapped. Additionally, this chromosomal region has often been associated with many types of cancer. One of the polymorphisms identified is located in WDR3 (intron 24) gene and the other in a region located at 460 Kb from TBX15 gene. The function of these genes has not been completely known, however, it has been proposed that WDR3 is involved in the proliferation of the cell cycle through the disruption of the ribosome biogenesis. In addition, several studies have shown an irregular expression of WD repeat proteins in certain types of cancer. Moreover, the TBX15 gene, like other members of the T-box family, has been related to developmental processes and several evidences suggest a relationship between the T-box genes and tumorigenesis, with effects on cell proliferation, invasion and metastasis. That is why we hypothesize that genes WDR3 and TBX15 may be related to cancer. Numerous studies are conducted in our laboratory to elucidate the role of these genes in the etiology of thyroid cancer in particular and also in cancer in general. In this thesis was performed an association study of genes WDR3 and TBX15 with thyroid cancer susceptibility, and their expression and regulation were analyzed in thyroid cancer, colon cancer and brain tumors. The gene association study of WDR3 with thyroid cancer indicates that this gene is a susceptibility factor for this cancer. The expression analysis shows that the WDR3 is over-expressed in thyroid cancer and colon cancer. The methylation analysis of the promoter region of WDR3 indicates that this epigenetic modification is not involved in the regulation of WDR3 expression at transcriptional level, however, analysis of transcription factors binding to the promoter shows that the c-Myc and CTCF factors could act as regulators of the WDR3 expression. Moreover, the association study of TBX15 gene with thyroid cancer indicates that this gene is not a susceptibility factor for this cancer. The expression analysis of TBX15 shows decreased expression of this gene in thyroid cancer. The methylation analysis of the promoter region of TBX15 in thyroid tissues and brain tissues, indicates that this epigenetic modification is involved in the regulation of TBX15 expression at transcriptional level. This thesis highlights the role of genes WDR3 and TBX15 in the etiology of thyroid cancer and suggests their involvement in carcinogenesis in general.

Esta tesis revela la regulación transcripcional del gen gap giant (gt) en el embrión blastodermal de Drosophila por ingeniería inversa: un modelo matemático infiere los mecanismos subyacentes de datos cuantitativos de expresión recopilados en un fondo genético silvestre. El modelo se amolda a mRNA reportero controlado por elementos reguladores en cis (CRE) de gt. Es una herramienta potente para investigar cómo se forma el patrón a nivel molecular por los sitios de unión de factores de transcripción y permite predecir la expresión en cepas mutantes. La presente tesis esclarece la regulación diferencial de dos CRE adyacentes de gt y presenta la primera evidencia experimental de auto-activación de gt mediante mutagénesis de sus elementos reguladores. Tras la optimización de los parámetros en un fondo de tipo silvestre, el modelo predice correctamente los cambios observados en mutantes de Krüppel y tailless. Otras contribuciones reglamentarias sugeridas por el modelo son confirmadas por la evaluación sistemática de los CREs en mutantes / This thesis unravels the transcriptional regulation of the gap gene giant (gt) in the Drosophila blastoderm embryo via a reverse-engineering approach: a mathematical model infers the underlying mechanisms from quantitative expression data collected in the wild-type background. The model is fit to reporter mRNA driven by cis-regulatory elements (CRE) of gt. It is a powerful tool to investigate how the pattern is formed at the molecular level from transcription factor binding sites and it gives us the ability to predict the expression in mutants. This thesis elucidates the differential regulation of two adjacent gt CREs and presents the first experimental evidence for Gt auto-activation via site-directed mutagenesis of its enhancers. After optimizing the parameters in the wild-type background, the model correctly predicts the observed changes in Krüppel and tailless mutants. Other regulatory contributions suggested by the model are confirmed by systematic evaluation of the CREs in mutants

Los avances en las tecnologías de genotipado masivo están revolucionando la comprensión de los genomas de animales domésticos, incluyendo su historia y cómo los eventos demográficos y selectivos han dado forma a la variación de los genomas de los individuos. En este trabajo analizamos por primera vez una amplia muestra de poblaciones de cerdos criollos de América y se estimó su relación genética con las poblaciones de cerdos en todo el mundo. Adicionalmente, se analizó el genoma de un cerdo que vivió en el siglo XVI a fin de proporcionar nuevas evidencias sobre eventos históricos y genéticos importantes como la domesticación y cruzamientos. Estos estudios mostraron una alta diferenciación entre las poblaciones de cerdos de Europa y Asia, siendo especialmente pronunciada para la región no pseudoautosómica del cromosoma X. A pesar del origen ibérico de los primeros cerdos introducidos en América, se observó una reducción sustancial de éste origen genético en el casi todas las poblaciones Americanas de cerdos estudiadas. El origen genético observado en las actuales poblaciones de cerdos en América se debió primero al los cerdos Ibéricos en el siglo XV y la reciente introgresión de las razas porcinas comerciales. Además se detectó origen genético proveniente de Asia, probablemente por causa de la introgresión de las razas comerciales que llevan haplotipos asiáticos, aunque no se puede descartar el cruzamiento con razas Chinas. Debido a la gran diversidad de condiciones del medio ambiente en América, se compararon las frecuencias alélicas observadas entre las poblaciones para estimar huellas de selección en el genoma, detectándose algunos genes relacionados con el sistema cardiovascular y la conformación de las extremidades. El ADN antiguo proporciona una valiosa información a cerca de los acontecimientos históricos que han modelado el genoma de los individuos modernos. En el capítulo 5 se analizó una parte del genoma de un cerdo que vivió en el siglo XVI en el noreste de España, junto a tres nuevos genomas de individuos modernos, un cerdo Ibérico, un jabalí de España y un cerdo criollo de Guatemala. Los genomas fueron obtenidos por métodos de secuenciación masiva. Los datos arqueológicos y genómicos sugirieron que el cerdo antiguo era domestico y estrechamente relacionado con los cerdos Ibéricos actuales y el jabalí Europeo, y con señales genéticas de cruzamiento entre ellos. Sorprendentemente, la comparación del cerdo antiguo y el cerdo Ibérico moderno con el genoma del cerdo criollo de Guatemala, mostró que ellos son igualmente cercanos a los cerdos criollos de América, y podría apoyar la hipótesis de la reducción de origen ibérico en cerdos Americanos causado por la introgresión de otras razas. Por último, entre los genes altamente diferenciadas se encontraron aquellos que participan en el color de la capa y el aumento del rendimiento reproductivo, ambas funciones asociadas con el primeros procesos de domesticación. Una de las estrategias de análisis para describir las relaciones de la población de cerdos utilizados en esta tesis, y ampliamente utilizado en estudios similares, es el análisis de componentes principales (PCA). Sin embargo, las proyecciones de PCA son sensibles a tamaño de muestra desbalanceado. En el capítulo 6 se evaluó una corrección en el PCA que tenga en cuenta el tamaño de la muestra de las poblaciones evaluadas ó su FST para corregir el sesgo en las proyecciones de los individuos. Las simulaciones sugieren que el método propuesto mejora las proyecciones de los individuos en dos dimensiones y en algunos caso, recupera los patrones de relaciones de la población, incluso cuando el tamaño de muestra es tan bajo como n = 1. El método ponderado de PCA puede recuperar una estructura más realista de los datos que la inferida con el PCA tradicional en poblaciones genéticamente diferenciadas. / Advances in high throughput genetic technologies are revolutionizing the understanding of domestic animal genomes, including their history and how demography and selective processes have shaped the variation of individuals’ genomes. Here we studied for the first time a large survey of village pig populations from America and estimate their relatedness with worldwide pig populations. In complement, we also analysed an ancient pig genome of 16th century to provide new evidence on important historical and genetic events like domestication and admixture. These studies showed the high differentiation between European and Asian pig populations, being particularly pronounced for the non-pseudoautosomal region of chromosome X. Despite the Iberian origin of pigs firstly introduced to America, a substantial reduction of this ancestry was observed in almost all American village pig populations. The actual ancestry observed in America is likely the result of admixing Iberian pigs in 15th century and recent introgression of commercial pig breeds. Additionally, some Asian ancestry also was observed probably due to introgression of commercial breeds carrying Asian haplotype, although direct admixture with Chinese breeds cannot be ruled out. Because the large diversity of environmental condition in the American continent, we compared the allele frequencies observed between populations to estimate signatures of selection in the genome, detecting some genes related with cardiovascular system and limbs conformation. Ancient DNA provides valuable information about the historical events that have modelled the genome of modern individuals. In chapter 5 we performed the analysis of the partial genome of a pig that lived in 16th century at North eastern Spain together three new modern genomes from Iberian pig, Spanish wild boar and a Guatemalan Creole pig obtained by whole genome shotgun sequencing. Archaeological and genomic data suggested that ancient pig was domestic, closely related to extant Iberian pigs and to European wild boar with some genetic signals of admixture with wild boar. Surprisingly, the comparison of ancient pig and modern Iberian pig to American sample from Guatemala, showed that they are equally close to American Creole pigs, and could support the hypothesis of reduction of Iberian origin in American village pigs driven by introgression of other breeds. Finally, among the highly differentiated genes we found those involved in coat colour and an increase the reproductive performance, both known functions associated with early domestication process. One of the analytical strategies to describe the population relationships of pigs used in this thesis, and widely used in similar studies is the principal component analysis (PCA). Nonetheless, PCA projections are sensitive to unequal sample size. In Chapter 6 we evaluated a correction in PCA that consider either sample size of evaluated populations or their FST estimates to correct bias in individual projections. Simulations suggest that the proposed method improves the two-dimensional projections of PCA data and, in some cases, entirely recovers population relationships patterns, even when sample size is as low as n=1. The weighted PCA can recover a more realistic structure than inferred with traditional PCA in well-structured populations.