Orientador: Ivan de Godoy Maia / Resumo: Proteínas desacopladoras (UCPs; do inglês uncoupling proteins) são proteínas especializadas no transporte mitocondrial que desacoplam a respiração da síntese de ATP. UCPs geram um fluxo de prótons através da membrana mitocondrial interna, dependente de ácidos graxos e sensível a nucleotídeos purínicos (PN). No presente trabalho, foram realizados vários estudos empregando UCPs de plantas (pUCP). Inicialmente, foi empreendida a caracterização bioquímica de uma UCP de milho (Zea mays; ZmUCP), representativa de espécies monocotiledôneas. Essa proteína, quando expressa em Escherichia coli e reconstituída em lipossomos, foi capaz de induzir um fluxo de prótons dependente de ácido linoléico (LA) e sensível a ATP com valores de Km, Vmax e Ki similares àqueles observados para pUCPs de espécies dicotiledôneas. A ZmUCP foi utilizada para investigar a importância de um par de histidinas presente no segundo loop matricial da UCP1 de mamíferos e ausente nas pUCPs. A introdução do referido par de histidinas na ZmUCP (Lys155His e Ala157His) provocou um aumento na afinidade por LA enquanto que a sua atividade permaneceu inalterada. Em um estudo mais abrangente de estrutura-função, mutações pontuais nos resíduos Lys147, Arg155 e Tyr269, localizados nas chamadas assinaturas das UCPs, e Cys28 e His83, específicos para pUCPs, foram introduzidas na proteína AtUCP1 de Arabidopsis. Os efeitos de tais mutações nas propriedades bioquímicas da AtUCP1 foram examinados usando sistema de reconstituição em lipossomos. O resíduo Arg155 parece ser crucial para a afinidade da AtUCP1 por LA enquanto que His83 tem importante função na atividade de transporte. Os resíduos Cys28, Lys147, e também Tyr269, são importantes para a correta funcionalidade da AtUCP1, já que suas substituições... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Uncoupling proteins (UCPs) are specialized mitochondrial transporter proteins, which uncouple respiration from ATP synthesis. UCPs mediate a fatty acid (FA)-dependent, purine nucleotide (PN)-inhibitable proton flux across the inner membrane mitochondrial. In the present study, several assays on plant UCPs (pUCP) were performed. Firstly, we biochemically characterized an UCP from maize (Zea mays; ZmUCP), a representative uncoupling protein from monocot species. This protein was expressed in Escherichia coli and reconstituted in liposomes. ZmUCP was fully active and induced a linoleic acid-dependent proton flux that was sensitive to ATP. The obtained Km, Vmax and Ki values were similar to those observed for dicot pUCPs. ZmUCP was also used to investigate the importance of a histidine pair present in the second matrix loop of mammalian UCP1 and absent in pUCPs. ZmUCP with the introduced histidine pair (Lys155His and Ala157His) displayed increased LA-affinity while its activity remained unchanged. In a subsequent study using AtUCP1, point mutations were introduced in amino acid residues Lys147, Arg155 and Tyr269, located inside the so-called UCP-signatures, and Cys28 and His83, specific for pUCPs. The effects of amino acid replacements on AtUCP1 biochemical properties were examined using reconstituted liposomes. Residue Arg155 appears to be crucial for AtUCP1 affinity to LA whereas His83 plays an important role in transport activity. Residues Cys28, Lys147, and also Tyr269 are important for correct AtUCP1 function, as their substitutions affected either the AtUCP1 affinity to LA and its transport activity, or sensitivity to PN inhibitors. Furthermore, we analyzed the expression profiles of the six genes encoding pUCP in Arabidopsis thaliana (AtUCP1-6) in response to salt (NaCl) and osmotic (mannitol)... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Fábio Tebaldi Silveira Nogueira / Banca: Jomar Patricío Monteiro / Resumo: O gene que codifica a TCTP (Translationally Controlled Tumour Protein) está presente em todos os eucariontes e o seu produto está envolvido em diferentes processos celulares. Embora bem caracterizada em mamíferos, poucos são os trabalhos disponíveis na literatura relacionados à análise da TCTP em plantas. No presente trabalho, a expressão do gene que codifica a TCTP em tomateiros foi analisada em situações de estresse biótico e abiótico. No estresse abiótico, as plantas de tomate foram submetidas a dano mecânico nas folhas, e essas coletadas após 4, 8 e 12 horas. No estresse biótico, duas espécies virais foram inoculadas mecanicamente nas plantas de tomate, o Cucumber mosaic virus (CMV) e o Pepper Yellow Mosaic Virus (PepYMV), respectivamente, e as folhas sistemicamente inoculadas foram coletadas após 25 dias. Um aumento na expressão da TCTP foi constatado em resposta ao estresse biótico, sendo de 1,3x em relação ao controle não inoculado na infecção pelo CMV, e de 1,4x na infecção pelo PepYMV. No estresse mecânico, o pico de expressão ocorreu após 4 horas com um aumento de 3,4x em relação ao controle não tratado, com posterior redução nos demais tempos. Adicionalmente, plantas transgênicas de tabaco capazes de superexpressar a TCTP de tomate foram geradas a fim de determinar o papel dessa proteína na infecção pelo PepYMV. Quando as linhagens transgênicas geradas foram inoculadas com o PepYMV observou-se, aos 14 dias após a inoculação (DAI), um aumento na concentração viral (1,8x) em relação às plantas de tabaco não transformadas, sendo o mesmo verificado aos 21 DAI (1,6x). Essa diferença, entretanto, não foi mais observada aos 28 DAI. Esses dados confirmam a relação funcional da TCTP com a resposta de defesa das plantas aos estresses bióticos e abióticos / Abstract: Not available / Mestre

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.

Os agrupamentos de ferro-enxofre (Fe-S) são grupos prostéticos necessários para a manutenção da vida, pois estão envolvidos em diversos processos incluindo a transferência de elétrons, reações metabólicas, sinalização e regulação da expressão gênica. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os únicos organismos em que a síntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas, incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Neste trabalho foi realizada uma análise transcricional dos genes NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis após diferentes estúmlos por meio de PCR quantitativa (qRT-PCR) e microarranjos. Após o tratamento de plântulas de E. grandis com frio, foram realizados experimentos de qRT-PCR. Os resultados foram normalizados com os genes constitutivos codificadores da histona H2B e da ribonucleoproteína L23A. Considerando tal normalização, ISU1 aumentou sua expressão em 0,6 e 1,7 vezes, NFS1 apresentou um aumento de 6 e 8 vezes, enquanto ISA1 apresentou um aumento de 69 a 114 vezes em relação à condição controle. Utilizando-se a técnica de microarranjos, foi analisada a diferença de expressão entre folhas e xilema de árvores maduras de E. grandis. O gene NFS1 apresentou maior expressão nas folhas do que em xilema, porém os genes ISA1 e ISU1 apresentaram um padrão de expressão equivalente entre os dois tipos de tecidos. Esses resultados sugerem que (i) os genes NFS1 e ISA1 podem estar relacionados à resposta celular ao estresse causado por frio; e que (ii) os aumentos na expressão devem-se, provavelmente, ao metabolismo de enxofre e à indução de enzimas antioxidantes. Foi também realizado um experimento de curva de tempo com a submissão de plântulas de E. grandis ao resfriamento, objetivando-se verificar em que momento esses genes começam a ter suas expressões aumentadas. O gene ISU1 apresentou maior expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, caindo drasticamente logo após este período. O gene ISA1, que havia apresentado a maior expressão relativa no experimento anterior, não apresentou diferença significativa no padrão de expressão durante as 16 horas de resfriamento, assim como o gene NFS1. Esses resultados indicam que as proteínas Fe-S, frente ao resfriamento, estão possivelmente envolvidas na recuperação das plantas após tal estresse. / Iron-sulfur (Fe-S) clusters are prosthetic groups required for the maintenance of life because they are involved in various vital processes, including electron transfers, metabolic reactions, signaling and regulation of gene expression. Plants perform photosynthesis and respiration, two processes that require Fe-S proteins, and are the only organisms in which the synthesis of these proteins is compartmentalized. Several factors and stresses affect the development of plants including low temperature, which is a productivity-limiting factor and restricts plants to certain geographical distributions, including Eucalyptus grandis, a species with significant economic importance. The aim of this study is to perform an analysis of E. grandis NFS1 and ISA1 gene expressions after different stimuli through quantitative PCR (qRT-PCR) and microarrays. qRT-PCR experiment were conducted on plants submitted to a cold treatment. The results were normalized with the housekeeping genes encoding histone H2B and ribonucleoprotein L23A. Considering such normalizations, ISU1 increased the expression 0.6 and 1-fold, NFS1 showed a 6 and 8-fold increase in comparison with the control condition, while ISA1 gene increased 69 and 114-fold. Using microarrays, the difference in expression between leaves and xylem of E. grandis was analyzed. The NFS1 gene showed higher expression in leaves than in xylem, but the ISA1and ISU1 showed equivalent pattern of expression in both types of tissues. These results suggest that (i) NFS1 and ISA1 genes are related to the cellular response to the stress caused by chilling, and that (ii) the increased expression should be probably due to the metabolism of sulfur and to the induction of antioxidative enzymes. A time-course experiment was also conducted during the cold stress of E. grandis plants to look at which moment these genes begin to increase their expressions. The ISU1 gene showed higher expression in the first 2 hours of treatment, and than decreased severally after this period. The ISA1 gene, which had shown the highest expression in the previous experiment, did not show significant differences in the pattern of expression during the 16 hours of chilling treatment, as well as the NFS1 gene. These results indicate that Fe-S proteins, in response to low temperature, are possibly involved in the recovery of the plants after this stress.

O silenciamento gênico tem sido utilizado extensivamente para facilitar a investigação de eventos da biologia vegetal. Ele pode ser induzido de diferentes modos, sendo que o passo chave para sua ocorrência é a presença de RNA fita dupla (dsRNA). A fim de avaliar um método rápido de obtenção de silenciamento para análise funcional em larga escala, foi inoculado dsRNA ou siRNA diretamente em folhas de plantas de arroz e de Nicotiana benthamiana. Os dsRNAs de seqüências do gene pds e do gene codificante da ferritina foram obtidos através da síntese in vivo e in vitro e o siRNA de PDS de arroz, derivado somente de síntese in vitro. O gene pds codifica a enzima fitoeno desaturase (PDS), uma enzima chave na biossíntese de carotenóides, que protege a clorofila das plantas contra o foto-branqueamento. O silenciamento deste gene mostra um fenótipo visível, claramente demonstrado através do uso de um inibidor químico da síntese desta enzima. No presente estudo, plantas de arroz e de N. benthamiana inoculadas com dsRNAs derivados do gene pds não apresentaram mudanças fenotípicas. Para avaliação de um outro método foi adaptado um vetor de silenciamento estável, no qual foram inseridos fragmentos de cDNA nas orientações senso e antisenso do gene de ferritina de arroz. O papel da ferritina, segundo experimentação in vitro, pode estar ligada à tolerância de certos cultivares de arroz às altas concentrações de ferro. O aprimoramento das metodologias de silenciamento e de transformação poderá resultar em uma ferramenta mais útil para a análise funcional em larga escala de genes de arroz. / Gene silencing has been used extensively to facilitate the investigation of different events in plant biology. It can be induced through different ways. The key step for its occurrence is the presence of double strand RNA (dsRNA). In order to evaluate a fast method to obtain silencing for functional analysis in a wide scale, either dsRNAs or siRNAs were directly inoculated in the leaves of rice and N. benthamiana plants. The dsRNAs the sequences of the pds gene and of the coding region of the ferritin gene were obtained through in vivo or in vitro synthesis, the siRNA PDS of rice were derived from synthesis in vitro. The pds gene codifies for the enzyme phytoene desaturase (PDS), a key enzyme in the biosynthesis of carotenoids, which protects the clorophil from the plants against photo-bleaching. The silencing of this gene shows a visible phenotype, clearly demonstrated through a chemical inhibition of PDS synthesis. However, no phenotypical changes were observed in either rice or N. benthamiana plants inoculated with dsRNA of the pds gene. In the present study, it was also adapted a vector for stable transformation, in which were inserted cDNA fragments of both, sense and antisense, orientations of the rice ferritin gene. In vitro experiments show that ferritin could be connected to the tolerance to high concentrations of iron of certain cultivars of rice. The improvement of silencing and transformation methodologies could result in a more useful tool for the functional analysis of rice genes in a wide scale.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-09-22T18:53:56Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Carolina Paola Sansaloni.pdf: 1344496 bytes, checksum: a9eae5d22eaec31835f3534662d4075c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-12-12T14:56:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Carolina Paola Sansaloni.pdf: 1344496 bytes, checksum: a9eae5d22eaec31835f3534662d4075c (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-12T14:56:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Carolina Paola Sansaloni.pdf: 1344496 bytes, checksum: a9eae5d22eaec31835f3534662d4075c (MD5) Previous issue date: 2008-02 / Marcadores microssatélites permitem o gerenciamento de variabilidade genética, proteção varietal e identificação individual em populações de melhoramento e produção de Eucalyptus. A análise de locos microssatélites em sistemas “multiplex” (i.e. vários locos analisados simultaneamente) vem sendo realizada tradicionalmente com microssatélites dinucleotídeos cujos alelos diferem em apenas dois pares de bases. Entretanto o padrão de qualidade recomendado internacionalmente para a investigação genética forense estabeleceu a utilização exclusiva de microssatélites baseados em repetições de tetra ou pentanucleotídeos. A maior diferença de tamanho entre os alelos e a minimização de artefatos de amplificação permitem uma interpretação significativamente mais robusta de genótipos em comparação a dinucleotídeos e conseqüentemente uma fácil e confiável comparação de perfis genotípicos entre laboratórios. O objetivo deste trabalho foi, portanto, o desenvolvimento, caracterização e mapeamento genético de uma nova categoria de microssatélites para espécies de Eucalyptus, baseados em repetições de tetra e pentanucleotídeos. Um banco de dados de 18.510 mil seqüências genômicas derivadas de clones de cromossomos artificiais de bactérias (BAC) de E. grandis totalizando 9,6 mega pares de bases foram mineradas para repetições de tetra e pentanucleotídeos e pares de iniciadores desenhados automaticamente para flanquear repetições totalizando dez ou mais pb. Dos 304 e 196 pares de iniciadores desenhados para a amplificação de locos tetra e pentanucleotídeos perfeitos, respectivamente, foram selecionados 80 locos de tetra e 30 de pentanucleotídeos para estudos detalhados. Após uma triagem em eletroforese de alta resolução foram selecionados 22 locos tetra e 10 pentanucleotídeos os quais foram geneticamente mapeados e caracterizados para número de alelos, heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho), probabilidade de identidade (PI), probabilidade de exclusão de paternidade (PE) e conteúdo de informação polimórfica (PIC) em amostras populacionais de seis procedências das três principais espécies plantadas de Eucalyptus no mundo (E. grandis, E. globulus e E. urophylla). Os locos tetra e pentanucleotídeos selecionados revelaram um conteúdo informativo inferior àquele de dinucleotídeos, embora adequado para discriminar indivíduos e determinar parentesco com elevada precisão. Ao avaliar a capacidade efetiva de discriminação individual em um grupo de 46 clones elite plantados comercialmente 5 locos tetra ou pentanucleotídeos foram suficientes para identificar unicamente todos os clones. A herança mendeliana de todos os 32 locos selecionados foi confirmada. Destes, 23 locos apresentaram uma configuração de segregação que permitiu o seu mapeamento genético em 8 dos 11 grupos de ligação com base em mapas de referência de duas famílias de E. grandis x E. urophylla. Dois sistemas multiplex, cada um com 7 locos selecionados foram testados com sucesso disponibilizando assim os primeiros sistemas de análise genética de alta precisão para espécies de Eucalyptus, passíveis de adoção em escala internacional para a análise genética de clones e populações. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Microsatellite markers allow the management of genetic variation, varietal protection and individual identification in breeding and production populations of Eucalyptus. The analysis of microsatellite markers in multiplexed systems has been traditionally accomplished using dinucleotide repeat based loci whose alleles differ by only two base pairs. However the golden standard recommended for individual identification in forensic genetics requires the exclusive use of microsatellites based on equal or higher than tetranucleotide repeats. The larger difference in allele size and the reduction in amplification stuttering artifacts allows a significantly more robust genotype calling and thus an easier and more reliable comparison of multilocus genotypes across laboratories. The objective of this work was, therefore, the development, characterization and mapping of a novel category of microsatellites for Eucalyptus species, based on tetra and pentanucleotide repeats. A database of 18,510 sequences derived from Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) clones of E. grandis totalling 9.6 mega basepairs of high quality sequence was mined for tetra and pentanucleotide repeats and primers designed automatically to flank repeats equal or larger than 10 bp. Out of the 304 and 196 primer pairs designed for perfect tetra and pentanucleotide repeats respectively, 80 tetranucleotide and 30 pentanucleotide based loci were selected for detailed studies Following a screening step for polymorphism in high resolution PAGE, 22 tetra and 10 pentanucleotide repeat based loci were selected and genetically mapped and characterized for numbers of alleles, observed and expected heterozigosity, probability of identity (PI), probability of paternity exclusion (PE) and polymorphism information content in population samples of six provenances of the three most widely planted species of the genus (E. grandis, E. globulus e E. urophylla). The tetra and pentanucleotide repeat loci showed a lower information content when compared to dinucleotide repeat markers however fully adequate to discriminate individuals and determine parentage with confidence. When assessing the actual discrimination power on a gruoup of 46 commercially planted Eucalyptus clones, five tetra or pentanucleotide markers were sufficient to uniquely identify all the clones. The mendelian inheritance of all 32 selected loci was confirmed. Twenty three displayed a segregation configuration that allowed genetically mapping them on 8 of the 11 linkage groups using two reference maps of E. grandis x E. urophylla. Two multiplex systems, with 7 loci each were successfully tested introducing the first high precision systems of genetic analysis for species of Eucalyptus, likely to be internationally adopted for the genetic analysis of clones and populations.

O silenciamento gênico tem sido utilizado extensivamente para facilitar a investigação de eventos da biologia vegetal. Ele pode ser induzido de diferentes modos, sendo que o passo chave para sua ocorrência é a presença de RNA fita dupla (dsRNA). A fim de avaliar um método rápido de obtenção de silenciamento para análise funcional em larga escala, foi inoculado dsRNA ou siRNA diretamente em folhas de plantas de arroz e de Nicotiana benthamiana. Os dsRNAs de seqüências do gene pds e do gene codificante da ferritina foram obtidos através da síntese in vivo e in vitro e o siRNA de PDS de arroz, derivado somente de síntese in vitro. O gene pds codifica a enzima fitoeno desaturase (PDS), uma enzima chave na biossíntese de carotenóides, que protege a clorofila das plantas contra o foto-branqueamento. O silenciamento deste gene mostra um fenótipo visível, claramente demonstrado através do uso de um inibidor químico da síntese desta enzima. No presente estudo, plantas de arroz e de N. benthamiana inoculadas com dsRNAs derivados do gene pds não apresentaram mudanças fenotípicas. Para avaliação de um outro método foi adaptado um vetor de silenciamento estável, no qual foram inseridos fragmentos de cDNA nas orientações senso e antisenso do gene de ferritina de arroz. O papel da ferritina, segundo experimentação in vitro, pode estar ligada à tolerância de certos cultivares de arroz às altas concentrações de ferro. O aprimoramento das metodologias de silenciamento e de transformação poderá resultar em uma ferramenta mais útil para a análise funcional em larga escala de genes de arroz. / Gene silencing has been used extensively to facilitate the investigation of different events in plant biology. It can be induced through different ways. The key step for its occurrence is the presence of double strand RNA (dsRNA). In order to evaluate a fast method to obtain silencing for functional analysis in a wide scale, either dsRNAs or siRNAs were directly inoculated in the leaves of rice and N. benthamiana plants. The dsRNAs the sequences of the pds gene and of the coding region of the ferritin gene were obtained through in vivo or in vitro synthesis, the siRNA PDS of rice were derived from synthesis in vitro. The pds gene codifies for the enzyme phytoene desaturase (PDS), a key enzyme in the biosynthesis of carotenoids, which protects the clorophil from the plants against photo-bleaching. The silencing of this gene shows a visible phenotype, clearly demonstrated through a chemical inhibition of PDS synthesis. However, no phenotypical changes were observed in either rice or N. benthamiana plants inoculated with dsRNA of the pds gene. In the present study, it was also adapted a vector for stable transformation, in which were inserted cDNA fragments of both, sense and antisense, orientations of the rice ferritin gene. In vitro experiments show that ferritin could be connected to the tolerance to high concentrations of iron of certain cultivars of rice. The improvement of silencing and transformation methodologies could result in a more useful tool for the functional analysis of rice genes in a wide scale.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Danyelle Mayara Silva (danielemaiara@gmail.com) on 2009-09-08T11:38:14Z No. of bitstreams: 1 Tese_KennyBonfim.pdf: 2688589 bytes, checksum: 124b1b3f0d729f713ef58718c23aa640 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-09-10T16:01:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_KennyBonfim.pdf: 2688589 bytes, checksum: 124b1b3f0d729f713ef58718c23aa640 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-09-10T16:01:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_KennyBonfim.pdf: 2688589 bytes, checksum: 124b1b3f0d729f713ef58718c23aa640 (MD5) Previous issue date: 2007 / A produção mundial de feijão, compreendendo os gêneros Phaseolus e Vigna, é superior a 18 milhões de toneladas e o Brasil ocupa o segundo lugar na produção mundial e o primeiro quando se trata apenas do gênero Phaseolus. Entretanto, sua produção ainda está aquém do necessário para suprir a demanda interna. Dentre os principais problemas relacionados com a baixa produção de feijão no Brasil estão a competição com plantas daninhas, estresse hídrico e o ataque de pragas e doenças como mosaico dourado do feijoeiro causado por um geminivírus. O Bean golden mosaic virus (BGMV), é transmitido por mosca-branca (Bemicia tabaci) de uma forma persistente, circulativa, causando mosaico dourado em feijão comum (Phaseolus vulgaris). Os sintomas característicos são: mosaico verde amarelado nas folhas, nanismo e vagens distorcidas. A doença é largamente disseminada nas regiões de produção de feijão no Brasil e América Latina causando perdas severas (40 -100%). Neste trabalho, a tecnologia de RNA interferente foi explorada usando uma seqüência do gene viral AC1 para gerar plantas transgênicas de feijão comum altamente resistentes a geminivírus. Desta maneira o gene viral (AC1) foi escolhido para a construção do vetor de transformação uma vez que a proteína Rep exerce uma função essencial no ciclo de infecção viral. Rep não é uma replicase porém é a única proteína requerida para a replicação do genoma viral. O vetor pBGMVRNAiAHAS foi construído a partir de um fragmento de DNA de 411 pb do gene AC1 do BGMV (_1836-2247, acesso no GeneBank No. M88686). Dezoito linhagens de feijão foram obtidas com a construção de interferência, as quais poderão induzir o silenciamento pós-transcricional do gene AC1. Uma linhagem (denominada 5.1) apresentou alta resistência (aproximadamente 93% das plantas não apresentaram sintomas) após alta pressão de inoculação (mais de 300 moscas-brancas virulíferas por planta). Os siRNAs específicos foram detectados nas plantas transgênicas, ambas inoculadas e não inoculadas. Uma análise de PCR semiquantitativo revelou a presença do DNA viral nas plantas transgênicas expostas a moscas-brancas virulíferas por um período de 6 dias. Entretanto, após a retirada dos insetos, não foi detectado DNA viral após um período adicional de seis dias. Devido à importância social e econômica do feijão na América Latina e à falta de genes para resistência a doenças nos bancos de germoplasma, faz-se necessário o desenvolvimento de um programa de melhoramento associado à engenharia genética para o lançamento de novas variedades, que possibilitará a diminuição dos principais problemas relacionados a esta cultura. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Production of beans, including the genus Phaseolus and Vigna, is superior to 18 million tons. Brazil is the secondlargest producer of both species genus and the major world producer of Phaseolus. However, its production is still below the necessary to supply the internal demand. Competition with weeds, abiotic stress and the occurrence of diseases as bean golden mosaic are some of the main problems related to its low production. Bean golden mosaic virus (BGMV), is transmitted by the whitefly Bemisia tabaci in a persistent, circulative manner, and causes the golden mosaic of common bean (Phaseolus vulgaris) which characteristic symptoms are yellow-green mosaic of leaves, stunting, and fruit distortion. The disease is the largest constraint on bean production in Brazil and Latin America and causes severe yield losses (40 to 100%). Here we explored the RNAi concept to silence the AC1 viral gene and generate high resistant transgenic common bean plants. Since the Rep protein performs an essential function in the viral infecting cycle, the AC1 gene was chosen to construct the transformation vector. Rep is not the replicase, but the only protein required for the replication of the viral genome. The vector pBGMVRNAiAHAS was constructed using the 411 bp fragment from the AC1 gene (_1836-2247, GeneBank accession No. M88686). Eighteen transgenic common bean lines were obtained with the construction to induce post-transcriptional gene silencing against AC1 gene. One line (named 5.1) presented high resistance (approximately 93% of plants free of symptoms) upon inoculation at high pressure (more than 300 viruliferous whiteflies per plant). Transgene-specific siRNA were detected in both inoculated and noninoculated transgenic plants. A semi-quantitative PCR analysis revealed the presence of virus DNA in transgenic plants exposed to viruliferous whiteflies for a period of six days. However, when insects were removed, no virus DNA could be detected after an additional period of six days. Due to its social and economical importance in Latin America and to the lack of genes for resistence, it is necessary to develop an improving program associated to genetic engineering in order to generate new varieties. It Shall allow the decreasing to the production of beans

A obtenção de novas cultivares de uvas de mesa e a compreensão da regulação da expressão gênica, associada à formação do fruto de uma cultivar de uva sem semente, constituem pré-requisitos essenciais para o desenvolvimento de ferramentas aplicadas ao melhoramento genético para essas espécies. Com este objetivo, dois trabalhos foram conduzidos a partir do estudo de transcritos derivados de frutos da cultivar (cv) Sultanina de videira. No primeiro trabalho, três bibliotecas subtraídas foram construídas a partir de RNA total de frutos em diferentes estádios de formação, utilizando-se uma metodologia modificada da análise representacional diferencial (RDA), denominada análise representacional de transcritos em grupos (BRAT). Um total de 2.500 fragmentos derivados de transcritos (TDFs) foram identificados e clonados a partir de estádios específicos do desenvolvimento do fruto. Após sequenciamento e análise in silico, 1.554 (62,16%) dos transcritos foram validados de acordo com a qualidade da sequência. A montagem das sequências derivadas de genes expressos (ESTs) resultou em 726 singletos e 69 clusters, com aproximadamente 76% de redundância. Entre os TDFs identificados, onze genes candidatos e dois genes-referência foram selecionados e submetidos a uma análise aprofundada dos seus perfis de expressão temporal por RT-qPCR. A expressão de sete genes foi concordante com os estádios específicos do desenvolvimento dos frutos. Entre os candidatos selecionados os genes a seguir listados são possivelmente os mais promissores quando se considera o desenvolvimento do fruto da cv. Sultanina: (i) VvUBP1 (proteína de ligação a oligouridilatos), (ii) VvRIP1 (proteínas induzidas pelo amadurecimento), (iii) VvP450 (citocromo P450), (iv) VvDOF1 (proteína do tipo Dof); (v) VvERF1 (fator de transcrição responsivo ao etileno), e (vi) VvGID1L1 (receptor de ácido giberélico). Num segundo momento, foi realizado um estudo mais detalhado dos genes Dof de videira. Tais genes correspondem a um grupo de fatores de transcrição específicos de plantas, os quais estão envolvidos na regulação de diferentes funções, tais como, resposta ao estresse, hormônios e luz, sinalização de fitocromo, germinação de sementes e expressão gênica tecido-específica. A família de genes Dof de videira compreende 26 membros, sendo que as sequências de aminoácidos de todos os domínios Dof alinham perfeitamente, incluindo resíduos de cisteína que são críticos para a ligação de zinco e outros resíduos conservados em fatores de transcrição Dof de A. thaliana, O. sativa e outras plantas. Baseado na análise de domínios Dof, sugere-se que estes domínios sejam possivelmente funcionais em videira. A localização física dos genes Dof nos cromossomos de videira foi realizada. Além disso, foi conduzida uma análise filogenética comparando o grupo de genes Dof em videira com os seus homólogos em outras duas eudicotiledôneas completamente sequenciadas, A. thaliana e Populus, permitindo identificar claramente clusters de genes parálogos e ortólogos. Por fim, os perfis de expressão de todos os 26 genes Dof foram estudados por RT-qPCR em nove órgãos de videira. / Table grapes production and kwnolegment about the gene expression regulation associated with the formation of seedless grape cultivar, constitute essential prerequisites for the development of tools applied to genetic improvement of this plant species. To this end, two studies were conducted using the analysis of transcripts derived from fruits of the Sultanina cultivar (cv.) grapevine. In the first study, three subtracted libraries were constructed from total RNA from fruit different developmental stages using a modified methodology of Representational Difference Analysis (RDA), named Bulk Representational Analysis of Transcripts (BRAT). A total of 2,500 transcripts-derived fragments (TDFs) were identified and cloned from specific stages of fruit development. After sequencing and analysis in silico, 1,554 (62.16%) transcripts were validated in accordance with the sequence quality. The assembly of sequences derived from expressed genes (ESTs) resulted in 726 singletons and 69 clusters, with overall EST redundancy of approximately 76%. Among the TDFs identified eleven candidate genes and two reference genes were selected and subjected to a thorough analysis of their temporal expression profiles by RT-qPCR. Among them, seven genes proved to be in agreement with the stage-specific expression. Among candidates selected from those differentially expressed, the genes listed below were considered the most promising when considering the fruit development in grapevine cv. Sultanina: (i) VvUBP1(oligouridylate binding protein), (ii)VvRIP1 (ripening induced protein), (iii) VvP450 (cytochrome P450), (iv) VvDOF1 (Dof-like protein), (v) VvERF1 (ethylene-responsive transcription factor), and (vi) VvGID1L1 (gibberellins receptor). The second study detailed the grapevine Dof gene family. Dof proteins are involved in the regulation of different functions such as plant response to stress, hormones and light phytochrome signaling, seed germination and tissue-specific gene expression. The Dof gene grapevine family includes 26 members. The amino acid sequences deduced from Dof domains matched perfectly including cysteine residues critical for zinc binding and other residues known to be conserved in Dof transcription factors from A. thaliana, O. sativa and other plants. Based on analysis of Dof domains, it is suggested that all grapevine Dof domains are possibly functional. The physical location of Dof genes in grapevine chromosome was determined. A phylogenetic study comparing grapevine Dof genes with their counterparts in two other eudicots completely sequenced, A. thaliana and Populus, allowed us to identify clear clusters of paralogous and orthologs genes. Finally, the expression profiles of all 26 Dof genes was studied by RT-qPCR in nine vegetative and reproductive grapevine organs.

Os agrupamentos de ferro-enxofre (Fe-S) são grupos prostéticos necessários para a manutenção da vida, pois estão envolvidos em diversos processos incluindo a transferência de elétrons, reações metabólicas, sinalização e regulação da expressão gênica. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os únicos organismos em que a síntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas, incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Neste trabalho foi realizada uma análise transcricional dos genes NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis após diferentes estúmlos por meio de PCR quantitativa (qRT-PCR) e microarranjos. Após o tratamento de plântulas de E. grandis com frio, foram realizados experimentos de qRT-PCR. Os resultados foram normalizados com os genes constitutivos codificadores da histona H2B e da ribonucleoproteína L23A. Considerando tal normalização, ISU1 aumentou sua expressão em 0,6 e 1,7 vezes, NFS1 apresentou um aumento de 6 e 8 vezes, enquanto ISA1 apresentou um aumento de 69 a 114 vezes em relação à condição controle. Utilizando-se a técnica de microarranjos, foi analisada a diferença de expressão entre folhas e xilema de árvores maduras de E. grandis. O gene NFS1 apresentou maior expressão nas folhas do que em xilema, porém os genes ISA1 e ISU1 apresentaram um padrão de expressão equivalente entre os dois tipos de tecidos. Esses resultados sugerem que (i) os genes NFS1 e ISA1 podem estar relacionados à resposta celular ao estresse causado por frio; e que (ii) os aumentos na expressão devem-se, provavelmente, ao metabolismo de enxofre e à indução de enzimas antioxidantes. Foi também realizado um experimento de curva de tempo com a submissão de plântulas de E. grandis ao resfriamento, objetivando-se verificar em que momento esses genes começam a ter suas expressões aumentadas. O gene ISU1 apresentou maior expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, caindo drasticamente logo após este período. O gene ISA1, que havia apresentado a maior expressão relativa no experimento anterior, não apresentou diferença significativa no padrão de expressão durante as 16 horas de resfriamento, assim como o gene NFS1. Esses resultados indicam que as proteínas Fe-S, frente ao resfriamento, estão possivelmente envolvidas na recuperação das plantas após tal estresse. / Iron-sulfur (Fe-S) clusters are prosthetic groups required for the maintenance of life because they are involved in various vital processes, including electron transfers, metabolic reactions, signaling and regulation of gene expression. Plants perform photosynthesis and respiration, two processes that require Fe-S proteins, and are the only organisms in which the synthesis of these proteins is compartmentalized. Several factors and stresses affect the development of plants including low temperature, which is a productivity-limiting factor and restricts plants to certain geographical distributions, including Eucalyptus grandis, a species with significant economic importance. The aim of this study is to perform an analysis of E. grandis NFS1 and ISA1 gene expressions after different stimuli through quantitative PCR (qRT-PCR) and microarrays. qRT-PCR experiment were conducted on plants submitted to a cold treatment. The results were normalized with the housekeeping genes encoding histone H2B and ribonucleoprotein L23A. Considering such normalizations, ISU1 increased the expression 0.6 and 1-fold, NFS1 showed a 6 and 8-fold increase in comparison with the control condition, while ISA1 gene increased 69 and 114-fold. Using microarrays, the difference in expression between leaves and xylem of E. grandis was analyzed. The NFS1 gene showed higher expression in leaves than in xylem, but the ISA1and ISU1 showed equivalent pattern of expression in both types of tissues. These results suggest that (i) NFS1 and ISA1 genes are related to the cellular response to the stress caused by chilling, and that (ii) the increased expression should be probably due to the metabolism of sulfur and to the induction of antioxidative enzymes. A time-course experiment was also conducted during the cold stress of E. grandis plants to look at which moment these genes begin to increase their expressions. The ISU1 gene showed higher expression in the first 2 hours of treatment, and than decreased severally after this period. The ISA1 gene, which had shown the highest expression in the previous experiment, did not show significant differences in the pattern of expression during the 16 hours of chilling treatment, as well as the NFS1 gene. These results indicate that Fe-S proteins, in response to low temperature, are possibly involved in the recovery of the plants after this stress.