Os gliomas são o tipo de tumor primário cerebral mais comum em adultos. A sobrevida média dos pacientes é de cerca de um ano para pacientes de glioblastoma multiforme, o maior grau de malignidade. As terapias disponíveis atualmente, que incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia, não têm sido eficientes devido a vários fatores, em particular a capacidade invasiva das células tumorais. RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) é um importante gene supressor de tumor cuja atividade anti-tumoral têm sido associada à sua atividade inibitória sobre algumas MMPs. A perda da função de RECK compromete a integridade tecidual, em parte causada pela atividade aumentada das MMPs. A linhagem celular T98G, derivada de glioblastoma multiforme (GBM), apresenta grande capacidade invasiva e níveis elevados de MMP-2 e -9. A fim de avaliar o efeito de RECK na contenção da invasão no modelo de glioma humano, foi feita a superexpressão de RECK nesta linhagem. A expressão de RECK, MMP-2, MMP-9 a MT1-MMP foram avaliadas por qPCR e por western blotting nas células T98G/RECK+ (células T98G superexpressando RECK após transfecção estável utilizando o vetor pCXN2). O potencial invasivo e migratório das células T98G/RECK+foi inibido, verificado por ensaio transwell. Foram observadas nas células T98G/RECK+ alterações importantes no arranjo do citoesqueleto, mas não nas células controle. Arranjos de actina na forma de \"stress fibers\" presentes no clone positivo podem ser responsáveis pela alteração observada na migração. A distribuição de FAK foi avaliada por imunocitoquímica e sua expressão por Western blot, mostrando que RECK só altera a distribuição desta proteína no citoesqueleto celular. Quanto ao potencial de inibição de MMPs, observou-se uma diminuição significativa dos níveis gênicos de MMP-9, mas não em termos protéicos ou de atividade de MMPs. Assim, este trabalho contribui para a discussão do papel de RECK na migração de células do modelo de glioma humano, uma das características responsáveis pela ausência de terapia efetiva deste tipo de tumor. / Malignant gliomas are the most common type of primary brain tumors in adults. Patient survival is less than one year in average for glioblastoma, the most malignant glioma. Therapies available today, which include surgery, radiotherapy and chemotherapy, have not been successful due to several factors, specially the invasiveness of the tumor. RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) is an important tumor suppressor gene whose anti-tumoral activity is associated to its anti-MMPs activity. Lack of functional RECK compromises tissue integrity, in part due to elevated MMPs activity. T98G cells, derived from a human multiform glioblastoma (GBM), were described as a highly invasive glioma cell line, which displays high levels of MMPs 2 and 9. In order to evaluate the effect of RECK in restraining glioma invasion, we overexpressed RECK in these invasive cell line derived from GBM. The expression of RECK, MMP-2, MMP-9 and MT1-MMP was evaluated by qPCR and by western blotting in T98G/RECK+ (T98G cells overexpressing RECK cells, where RECK gene was cloned into the pCXN2 vector generating a stable transfection). The invasion and migration capacity of T98G/RECK+ cells was inhibited in transwell assay. Important cytoskeleton modifications were also observed in T98G/RECK+ cells but not on the control cells. Actin arrangements representing stress fibers on the positive clones may be responsible for motility alteration patterns observed. FAK distribution was assessed through imunocytochemical staining, and its expression evaluated by western blot analyses, showing that RECK forced expression changed the distribution pattern but not FAK expression. Concerning MMPs inhibition, a significant inhibition of MMP-9 gene expression was observed in T98G/RECK+, but neither protein levels nor protein activity were affected. Thus, the present study improves the discussion about RECK role in the migration of glioma cells, an important feature for the failure of current therapies for this kind of tumor.

Os gliomas são o tipo de tumor primário cerebral mais comum em adultos. A sobrevida média dos pacientes é de cerca de um ano para pacientes de glioblastoma multiforme, o maior grau de malignidade. As terapias disponíveis atualmente, que incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia, não têm sido eficientes devido a vários fatores, em particular a capacidade invasiva das células tumorais. RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) é um importante gene supressor de tumor cuja atividade anti-tumoral têm sido associada à sua atividade inibitória sobre algumas MMPs. A perda da função de RECK compromete a integridade tecidual, em parte causada pela atividade aumentada das MMPs. A linhagem celular T98G, derivada de glioblastoma multiforme (GBM), apresenta grande capacidade invasiva e níveis elevados de MMP-2 e -9. A fim de avaliar o efeito de RECK na contenção da invasão no modelo de glioma humano, foi feita a superexpressão de RECK nesta linhagem. A expressão de RECK, MMP-2, MMP-9 a MT1-MMP foram avaliadas por qPCR e por western blotting nas células T98G/RECK+ (células T98G superexpressando RECK após transfecção estável utilizando o vetor pCXN2). O potencial invasivo e migratório das células T98G/RECK+foi inibido, verificado por ensaio transwell. Foram observadas nas células T98G/RECK+ alterações importantes no arranjo do citoesqueleto, mas não nas células controle. Arranjos de actina na forma de \"stress fibers\" presentes no clone positivo podem ser responsáveis pela alteração observada na migração. A distribuição de FAK foi avaliada por imunocitoquímica e sua expressão por Western blot, mostrando que RECK só altera a distribuição desta proteína no citoesqueleto celular. Quanto ao potencial de inibição de MMPs, observou-se uma diminuição significativa dos níveis gênicos de MMP-9, mas não em termos protéicos ou de atividade de MMPs. Assim, este trabalho contribui para a discussão do papel de RECK na migração de células do modelo de glioma humano, uma das características responsáveis pela ausência de terapia efetiva deste tipo de tumor. / Malignant gliomas are the most common type of primary brain tumors in adults. Patient survival is less than one year in average for glioblastoma, the most malignant glioma. Therapies available today, which include surgery, radiotherapy and chemotherapy, have not been successful due to several factors, specially the invasiveness of the tumor. RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) is an important tumor suppressor gene whose anti-tumoral activity is associated to its anti-MMPs activity. Lack of functional RECK compromises tissue integrity, in part due to elevated MMPs activity. T98G cells, derived from a human multiform glioblastoma (GBM), were described as a highly invasive glioma cell line, which displays high levels of MMPs 2 and 9. In order to evaluate the effect of RECK in restraining glioma invasion, we overexpressed RECK in these invasive cell line derived from GBM. The expression of RECK, MMP-2, MMP-9 and MT1-MMP was evaluated by qPCR and by western blotting in T98G/RECK+ (T98G cells overexpressing RECK cells, where RECK gene was cloned into the pCXN2 vector generating a stable transfection). The invasion and migration capacity of T98G/RECK+ cells was inhibited in transwell assay. Important cytoskeleton modifications were also observed in T98G/RECK+ cells but not on the control cells. Actin arrangements representing stress fibers on the positive clones may be responsible for motility alteration patterns observed. FAK distribution was assessed through imunocytochemical staining, and its expression evaluated by western blot analyses, showing that RECK forced expression changed the distribution pattern but not FAK expression. Concerning MMPs inhibition, a significant inhibition of MMP-9 gene expression was observed in T98G/RECK+, but neither protein levels nor protein activity were affected. Thus, the present study improves the discussion about RECK role in the migration of glioma cells, an important feature for the failure of current therapies for this kind of tumor.

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.