A utilização da terapia antiretroviral, atualmente mais amplamente acessível, implica na permanência da identificação da resistência viral e monitoramento da doença como itens importantes em adultos e pacientes pediátricos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1. Os principais marcadores da infecção por HIV-1, utilizados no monitoramento da infecção e curso da doença, são as contagens de células T CD4+ e a carga viral. Ambos são úteis como parâmetros indicadores para o início da terapia e na avaliação de sua eficácia. Além disto, a sua associação a testes de genotipagem para a identificação de mutações de resistência viral, pode auxiliar na indicação da conduta clínica mais adequada. No presente estudo, analisamos os valores da carga viral e taxas de linfócitos T CD4+ e CD8+ na avaliação do status imunológico de 25 crianças com indicação para a terapia antiretroviral, condicionando o regime terapêutico aos resultados do teste de genotipagem. A identificação dos subtipos virais foi feita por análise filogenética e a genotipagem incluiu a análise dos genes protease e transcriptase reversa do HIV-1. Dezoito amostras foram agrupadas no subtipo viral B e três no subtipo F1; cepas recombinantes também foram observadas, sendo uma BF, duas BD e uma DF. Dezoito crianças apresentaram mutações conferindo resistência viral aos inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeo e sete crianças apresentaram resistência aos inibidores não-análogos, com seis relatando resistência a nevirapina, delavirdina e efavirenz. Além disto, duas crianças, nas quais a terapia havia sido descontinuada dois a três anos antes da avaliação do teste de genotipagem, apresentaram as mutações K101E, K103N e G190A, conferindo resistência às três drogas. As mutações mais frequentes para o gene da transcriptase reversa foram observadas nos codons M41L, M184V e T215FY. Entretanto, dez crianças apresentaram relevante número de mutações de resistência viral, variando entre cinco a dez, que conferiram resistência a no mínimo quatro e até onze drogas antiretrovirais. Para o gene da protease, as mutações de resistência mais comuns foram observadas nos codons M46I, D30N e I54LV. Treze crianças apresentaram resistência viral a, no mínimo, duas e até 12 drogas. A adequação da terapia antiretroviral altamente potente (HAART), de acordo com o padrão de resistência viral, permitiu observar aumento dos valores de células T CD4+ em 12 dos 25 pacientes pediátricos, demonstrando melhoria na sua condição de imunodeficiência associada ao HIV. Decréscimos importantes da carga viral foram observados em 17 crianças, com níveis indetectáveis de RNA HIV alcançados em 13 delas, sendo 11 com linhagens virais resistentes a múltiplas drogas. O desenvolvimento de linhagens virais resistentes é uma das principais razões da falha terapêutica. Mesmo considerando outros fatores causais, tais como aderência, metabolismo e níveis adequados das drogas, a identificação do perfil de resistência viral é um importante fator na conduta para a adequação de esquemas terapêuticos, dando suporte ao uso racional das drogas antiretrovirais em programas de tratamento. / With antiretroviral therapy becoming more widely available nowadays, Human Immunodeficiency Virus type 1 resistance identification and monitoring of disease remains of great importance in adults and infected children. The major HIV-1 infection markers usually used for monitoring viral infection and disease course are CD4+ T cell counts or percentages and HIV viral load. Both of them are helpful indicating when to start therapy and evaluating its efficacy. Also, their association with genotyping tests to identify viral resistant mutations may help clinicians for the most adequate clinical conduct. In the present study, we assessed HIV-1 viral load and CD4+ and CD8+ T lymphocyte rates for the immunological status evaluation of 25 antiretroviral-treated children managing therapeutic regimens according to genotyping test results. Drug resistance evaluation was done using genotyping covering protease and reverse transcriptase genes. Additionally, all of the 25 vertically HIV-1 infected children were assessed for viral subtyping throughout phylogenetic analysis. Eighteen samples clustered at B subtype and three clustered at F1 subtype; one BF, two BD and one DF recombinant strains were also observed. Eighteen children presented, at least, one mutation conferring resistance to the nucleoside reverse transcriptase inhibitors, and seven children presented resistance to the non-nucleoside inhibitors, with six resistant to all three drugs, nevirapine, delavirdine, and efavirenz. In addition, two children in whom the therapy had been discontinued two to three years before testing presented K101E, K103N, and G190A mutations conferring resistance to the all three drugs. Reverse transcriptase gene mutations were more frequently observed at codons M41L, M184V, and T215FY. However, ten children presented an important number of viral resistance mutations, ranging from five to ten mutations, conferring resistance to at least four to up to eleven antiretroviral drugs. Protease gene mutations were more frequently seen at codons M46I, D30N, and I54LV. Thirteen children presented viral resistance to at least two to up to twelve drugs. The management of the highly active antiretroviral therapy (HAART) according to viral resistance in our group of pediatric patients allowed an increase in CD4+ T cell counts and/or percentage in 12 of the 25 children, showing an improvement in their HIV-associated immunodeficiency status. Important viral burden declines were observed in 17 children, and HIV RNA undetectable levels were reached in 13 of them. Among these 17 children, 11 were multi-drug resistant. The development of resistant viral strains is one of the main reasons for failure of antiretroviral therapy. Even considering other causal factors such as compliance of the patient, metabolism of drugs and drug levels, viral resistance profile identification is an important factor in the management of therapeutic regimens, supporting the rational use of antiretroviral drugs by treatment programs.

A utilização da terapia antiretroviral, atualmente mais amplamente acessível, implica na permanência da identificação da resistência viral e monitoramento da doença como itens importantes em adultos e pacientes pediátricos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1. Os principais marcadores da infecção por HIV-1, utilizados no monitoramento da infecção e curso da doença, são as contagens de células T CD4+ e a carga viral. Ambos são úteis como parâmetros indicadores para o início da terapia e na avaliação de sua eficácia. Além disto, a sua associação a testes de genotipagem para a identificação de mutações de resistência viral, pode auxiliar na indicação da conduta clínica mais adequada. No presente estudo, analisamos os valores da carga viral e taxas de linfócitos T CD4+ e CD8+ na avaliação do status imunológico de 25 crianças com indicação para a terapia antiretroviral, condicionando o regime terapêutico aos resultados do teste de genotipagem. A identificação dos subtipos virais foi feita por análise filogenética e a genotipagem incluiu a análise dos genes protease e transcriptase reversa do HIV-1. Dezoito amostras foram agrupadas no subtipo viral B e três no subtipo F1; cepas recombinantes também foram observadas, sendo uma BF, duas BD e uma DF. Dezoito crianças apresentaram mutações conferindo resistência viral aos inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeo e sete crianças apresentaram resistência aos inibidores não-análogos, com seis relatando resistência a nevirapina, delavirdina e efavirenz. Além disto, duas crianças, nas quais a terapia havia sido descontinuada dois a três anos antes da avaliação do teste de genotipagem, apresentaram as mutações K101E, K103N e G190A, conferindo resistência às três drogas. As mutações mais frequentes para o gene da transcriptase reversa foram observadas nos codons M41L, M184V e T215FY. Entretanto, dez crianças apresentaram relevante número de mutações de resistência viral, variando entre cinco a dez, que conferiram resistência a no mínimo quatro e até onze drogas antiretrovirais. Para o gene da protease, as mutações de resistência mais comuns foram observadas nos codons M46I, D30N e I54LV. Treze crianças apresentaram resistência viral a, no mínimo, duas e até 12 drogas. A adequação da terapia antiretroviral altamente potente (HAART), de acordo com o padrão de resistência viral, permitiu observar aumento dos valores de células T CD4+ em 12 dos 25 pacientes pediátricos, demonstrando melhoria na sua condição de imunodeficiência associada ao HIV. Decréscimos importantes da carga viral foram observados em 17 crianças, com níveis indetectáveis de RNA HIV alcançados em 13 delas, sendo 11 com linhagens virais resistentes a múltiplas drogas. O desenvolvimento de linhagens virais resistentes é uma das principais razões da falha terapêutica. Mesmo considerando outros fatores causais, tais como aderência, metabolismo e níveis adequados das drogas, a identificação do perfil de resistência viral é um importante fator na conduta para a adequação de esquemas terapêuticos, dando suporte ao uso racional das drogas antiretrovirais em programas de tratamento. / With antiretroviral therapy becoming more widely available nowadays, Human Immunodeficiency Virus type 1 resistance identification and monitoring of disease remains of great importance in adults and infected children. The major HIV-1 infection markers usually used for monitoring viral infection and disease course are CD4+ T cell counts or percentages and HIV viral load. Both of them are helpful indicating when to start therapy and evaluating its efficacy. Also, their association with genotyping tests to identify viral resistant mutations may help clinicians for the most adequate clinical conduct. In the present study, we assessed HIV-1 viral load and CD4+ and CD8+ T lymphocyte rates for the immunological status evaluation of 25 antiretroviral-treated children managing therapeutic regimens according to genotyping test results. Drug resistance evaluation was done using genotyping covering protease and reverse transcriptase genes. Additionally, all of the 25 vertically HIV-1 infected children were assessed for viral subtyping throughout phylogenetic analysis. Eighteen samples clustered at B subtype and three clustered at F1 subtype; one BF, two BD and one DF recombinant strains were also observed. Eighteen children presented, at least, one mutation conferring resistance to the nucleoside reverse transcriptase inhibitors, and seven children presented resistance to the non-nucleoside inhibitors, with six resistant to all three drugs, nevirapine, delavirdine, and efavirenz. In addition, two children in whom the therapy had been discontinued two to three years before testing presented K101E, K103N, and G190A mutations conferring resistance to the all three drugs. Reverse transcriptase gene mutations were more frequently observed at codons M41L, M184V, and T215FY. However, ten children presented an important number of viral resistance mutations, ranging from five to ten mutations, conferring resistance to at least four to up to eleven antiretroviral drugs. Protease gene mutations were more frequently seen at codons M46I, D30N, and I54LV. Thirteen children presented viral resistance to at least two to up to twelve drugs. The management of the highly active antiretroviral therapy (HAART) according to viral resistance in our group of pediatric patients allowed an increase in CD4+ T cell counts and/or percentage in 12 of the 25 children, showing an improvement in their HIV-associated immunodeficiency status. Important viral burden declines were observed in 17 children, and HIV RNA undetectable levels were reached in 13 of them. Among these 17 children, 11 were multi-drug resistant. The development of resistant viral strains is one of the main reasons for failure of antiretroviral therapy. Even considering other causal factors such as compliance of the patient, metabolism of drugs and drug levels, viral resistance profile identification is an important factor in the management of therapeutic regimens, supporting the rational use of antiretroviral drugs by treatment programs.

Introdução: estudos com Enfuvirtida (ENF) mostraram que mutações na HR1 da gp41 levam à resistência primária de cepas em pacientes sem tratamento prévio com inibidores de fusão (Derdeyn et al., 2000; Rimsky et. al., 1998; Sista et. al., 2002). Outros, que o uso contínuo de HAART leva à falha virológica (Shafer et. al., 1998; Shafer & Vuitton, 1999). Para a melhor escolha terapêutica recomenda-se usar a Genotipagem do HIV1 (Ministério da Saúde, 2008b; Perez-Elias et. al., 2003; Shafer et. al., 2001). Objetivos: avaliar o perfil de resistência do HIV1 ao ENF pelo sequenciamento da HR1 da gp41 em pacientes sob HAART, sem uso de inibidor de fusão. Realizar fenotipagem virtual da pol do HIV1 em trinta e duas cepas com resistência aos NRTI, NtRTI , NNRTI e PI para verificar indicação do ENF. Métodos: investigamos 877 prontuários de pacientes do CRT-DST/AIDS entre 5/2002 a 7/2005 e verificamos que 92 que haviam realizado o Teste de Genotipagem do HIV1 em nosso laboratório, sem tratamento prévio com inibidores de entrada poderiam participar do nosso estudo. O primeiro grupo, com 60 pacientes apresentou cepas sensíveis à pelo menos um antirretroviral (ARV) e o segundo com 32 cujas cepas apresentaram resistência parcial e completa às drogas. A região HR1/HR2 da gp41 foi seqüenciada com o kit Big Dye Terminator vs. 3.1. Alinhamos as seqüências e as comparamos com HXB2 através do programa BioEdit vs.7.0.9.0. As mutações de resistência ao ENF foram determinadas pelo algoritmo Francês (ANRS) e pelo da Universidade de Stanford. Submetemos as sequências ao Virtual Phenotype Assay (Virco, Bélgica) para obtermos a Fenotipagem Virtual. Os subtipos da HR1/HR2 da gp41 e do pol foram determinados por análises filogenéticas e os recombinantes, pelo Simplot v 3.5.1. Resultados: 89(97%) amostras foram seqüenciadas, 2 (2%) não amplificaram e 1 (1%) não tinha material suficiente. Destas, 82 (92%) eram do subtipo B, 6(7%) do F1 e 1(1%), do BF na gp41. No pol, 80(87%) eram B, 4(4%) eram F e 7(8%), eram FB. Três (3%) apresentaram resistência primária ao ENF, determinada pela N42D (1%), N43H (1%) e L44M (1%). Dez amostras tinham os polimorfismos Q39R(10%), N42H(10%), N42R(10%), N42N/S(10%) e N42S(60%). Na HR2, as mutações N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K e S138S/A estavam presentes em 26% das cepas. Apesar das cepas apresentarem resistência aos ARV pelo teste de genotipagem, a fenotipagem virtual mostrou que 10% dos ARV ainda atuavam sobre elas, enquanto que 75% delas apresentaram resistência parcial e 15%, completa às drogas. Conclusão: nosso estudo sugere a introdução do teste de genotipagem da HR1/HR2 da gp41 antes de indicar do ENF em pacientes com falha terapêutica e que a Fenotipagem Virtual pode ser usada para a escolha do melhor esquema antirretroviral que permita uma supressão viral sustentada. / Background: studies using Enfuvirtide (ENF) have showed that mutations in the HR1 (gp41) have been associated with primary resistance in strains of the patients without previous treatment with fusion inhibitors. (Rimsky et. al.,1998; Derdeyn et al.,2000, Sista et. al.,2002). The widespread use of HAART may achieve maximal suppression of the viral load, but the viral rebound may occur, leading to virologic failure (Shafer et. al.,1998; Shafer & Vuitton,1999). To optimize therapeutic choices it is recommended to use the HIV1 Genotypic Assay. Objective: to evaluate the resistance profile in the HR1 in patients submitted to HAART, but naïve entry inhibitors. To make the Virtual Phenotypic Assay in the pol of the HIV1 strains isolated of the 32 patients with resistance to the antiretroviral (ARV) and to verify the possibility of using the ENF. Methods: we investigated 877 handbook patients of the CRT-DST/AIDS from May/2002 to July/2005. We identified 92 naïve patients to entry inhibitors included in our cohort to do genotypic assay; they were included in our research. The first group was composed by 60 persons with sensible strains to only one ARV. The second, with 32 presented strains with resistance to all ARV. HR1/HR2 was sequenced (ABIPrism BigDye Terminator vs 3.1). Bioedit Software vs.7.0.9.0 was used to compare sequences with the HIVHXB2. The resistance mutations to ENF were analyzed using French ANRS and Stanford HIV Drug Resistance Algorithm. The results by Virtual Phenotype Assay of 32 patients that presented regimen failure by Genotypic Assay predicted HIV phenotypic resistance. Subtype analysis were did by Phylogeny and the recombinants strains results, confirmed by Simplot v.3.5.1. Results: 89(97%) out of 92 samples were sequenced. Two of them (2%) could not be amplified and one (1%) we did not have enough material to use. In the HR1/HR2 82(92%) of the samples were typed as B, 6(7%), as F and 1(1%) as FB. In the pol 80(87%) were classified as B, 4(4%), as F and 7(8%) as FB. According to algorithms used, 3(3%) out of 89 ENF naïve patients presented complete resistance to this drug. One virus harbored the N42D mutation (1%), another, the N43H(1%) and the other one the L44M(1%). In 10 samples we observed the polymorphisms Q39R(1%), N42H(1%), N42R(1%), N42N/S(1%) and N42S(7%). In the HR2 domain the substitutions N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K and S138S/A were present in 26% of the samples. Although strains presented resistance to the ARV by Genotypic Assay, in the Virtual Phenotypic Assay we verified that 10% of the drugs had some effect upon them. 75% of the strains presented partial and 15% completed resistance to ARV. Conclusion: it is important to introduce the HR1/HR2 genotyping test to verify resistance mutations to ENF before indicating this drug to patients with virologic failure. The virtual phenotypic assay can be used to select the better combination therapy to obtain viral suppression sustained response.

Introdução: estudos com Enfuvirtida (ENF) mostraram que mutações na HR1 da gp41 levam à resistência primária de cepas em pacientes sem tratamento prévio com inibidores de fusão (Derdeyn et al., 2000; Rimsky et. al., 1998; Sista et. al., 2002). Outros, que o uso contínuo de HAART leva à falha virológica (Shafer et. al., 1998; Shafer & Vuitton, 1999). Para a melhor escolha terapêutica recomenda-se usar a Genotipagem do HIV1 (Ministério da Saúde, 2008b; Perez-Elias et. al., 2003; Shafer et. al., 2001). Objetivos: avaliar o perfil de resistência do HIV1 ao ENF pelo sequenciamento da HR1 da gp41 em pacientes sob HAART, sem uso de inibidor de fusão. Realizar fenotipagem virtual da pol do HIV1 em trinta e duas cepas com resistência aos NRTI, NtRTI , NNRTI e PI para verificar indicação do ENF. Métodos: investigamos 877 prontuários de pacientes do CRT-DST/AIDS entre 5/2002 a 7/2005 e verificamos que 92 que haviam realizado o Teste de Genotipagem do HIV1 em nosso laboratório, sem tratamento prévio com inibidores de entrada poderiam participar do nosso estudo. O primeiro grupo, com 60 pacientes apresentou cepas sensíveis à pelo menos um antirretroviral (ARV) e o segundo com 32 cujas cepas apresentaram resistência parcial e completa às drogas. A região HR1/HR2 da gp41 foi seqüenciada com o kit Big Dye Terminator vs. 3.1. Alinhamos as seqüências e as comparamos com HXB2 através do programa BioEdit vs.7.0.9.0. As mutações de resistência ao ENF foram determinadas pelo algoritmo Francês (ANRS) e pelo da Universidade de Stanford. Submetemos as sequências ao Virtual Phenotype Assay (Virco, Bélgica) para obtermos a Fenotipagem Virtual. Os subtipos da HR1/HR2 da gp41 e do pol foram determinados por análises filogenéticas e os recombinantes, pelo Simplot v 3.5.1. Resultados: 89(97%) amostras foram seqüenciadas, 2 (2%) não amplificaram e 1 (1%) não tinha material suficiente. Destas, 82 (92%) eram do subtipo B, 6(7%) do F1 e 1(1%), do BF na gp41. No pol, 80(87%) eram B, 4(4%) eram F e 7(8%), eram FB. Três (3%) apresentaram resistência primária ao ENF, determinada pela N42D (1%), N43H (1%) e L44M (1%). Dez amostras tinham os polimorfismos Q39R(10%), N42H(10%), N42R(10%), N42N/S(10%) e N42S(60%). Na HR2, as mutações N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K e S138S/A estavam presentes em 26% das cepas. Apesar das cepas apresentarem resistência aos ARV pelo teste de genotipagem, a fenotipagem virtual mostrou que 10% dos ARV ainda atuavam sobre elas, enquanto que 75% delas apresentaram resistência parcial e 15%, completa às drogas. Conclusão: nosso estudo sugere a introdução do teste de genotipagem da HR1/HR2 da gp41 antes de indicar do ENF em pacientes com falha terapêutica e que a Fenotipagem Virtual pode ser usada para a escolha do melhor esquema antirretroviral que permita uma supressão viral sustentada. / Background: studies using Enfuvirtide (ENF) have showed that mutations in the HR1 (gp41) have been associated with primary resistance in strains of the patients without previous treatment with fusion inhibitors. (Rimsky et. al.,1998; Derdeyn et al.,2000, Sista et. al.,2002). The widespread use of HAART may achieve maximal suppression of the viral load, but the viral rebound may occur, leading to virologic failure (Shafer et. al.,1998; Shafer & Vuitton,1999). To optimize therapeutic choices it is recommended to use the HIV1 Genotypic Assay. Objective: to evaluate the resistance profile in the HR1 in patients submitted to HAART, but naïve entry inhibitors. To make the Virtual Phenotypic Assay in the pol of the HIV1 strains isolated of the 32 patients with resistance to the antiretroviral (ARV) and to verify the possibility of using the ENF. Methods: we investigated 877 handbook patients of the CRT-DST/AIDS from May/2002 to July/2005. We identified 92 naïve patients to entry inhibitors included in our cohort to do genotypic assay; they were included in our research. The first group was composed by 60 persons with sensible strains to only one ARV. The second, with 32 presented strains with resistance to all ARV. HR1/HR2 was sequenced (ABIPrism BigDye Terminator vs 3.1). Bioedit Software vs.7.0.9.0 was used to compare sequences with the HIVHXB2. The resistance mutations to ENF were analyzed using French ANRS and Stanford HIV Drug Resistance Algorithm. The results by Virtual Phenotype Assay of 32 patients that presented regimen failure by Genotypic Assay predicted HIV phenotypic resistance. Subtype analysis were did by Phylogeny and the recombinants strains results, confirmed by Simplot v.3.5.1. Results: 89(97%) out of 92 samples were sequenced. Two of them (2%) could not be amplified and one (1%) we did not have enough material to use. In the HR1/HR2 82(92%) of the samples were typed as B, 6(7%), as F and 1(1%) as FB. In the pol 80(87%) were classified as B, 4(4%), as F and 7(8%) as FB. According to algorithms used, 3(3%) out of 89 ENF naïve patients presented complete resistance to this drug. One virus harbored the N42D mutation (1%), another, the N43H(1%) and the other one the L44M(1%). In 10 samples we observed the polymorphisms Q39R(1%), N42H(1%), N42R(1%), N42N/S(1%) and N42S(7%). In the HR2 domain the substitutions N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K and S138S/A were present in 26% of the samples. Although strains presented resistance to the ARV by Genotypic Assay, in the Virtual Phenotypic Assay we verified that 10% of the drugs had some effect upon them. 75% of the strains presented partial and 15% completed resistance to ARV. Conclusion: it is important to introduce the HR1/HR2 genotyping test to verify resistance mutations to ENF before indicating this drug to patients with virologic failure. The virtual phenotypic assay can be used to select the better combination therapy to obtain viral suppression sustained response.